CN1746306B

CN1746306B - 一种重组人干扰素α4编码cDNA序列及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN1746306B
Application number: CN 200510021387
Authority: CN
Inventors: 陈守春; 闫娟; 石刚; 徐琦; 刘玉应; 韩蕾; 刘忠荣; 王若竹; 及元乔; 李伯刚
Original assignee: Chengdu Diao Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Chengdu Diao Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2005-08-02
Filing date: 2005-08-02
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2025-08-02
Also published as: CN1746306A

Abstract

本发明涉及一种可在原核表达系统中高效表达的重组人干扰素α4编码cDNA序列，其特征在于含有SEQ ID NO.1核苷酸序列，本发明还提供了该重组人干扰素α4编码cDNA序列在制备重组人干扰素α4多肽中的应用。本发明通过人工合成得到IFNα4全长cDNA序列SEQ ID NO.1，并采用原核表达系统获得了高效表达的重组人干扰素α4多肽，所述重组人干扰素α4多肽达到药典相关标准规定的活性标准。用本发明制备的重组人干扰素α4多肽产量大、活性高、工艺简化，成本低，能对人干扰素α4的相关研究和产业化应用起极大的推动作用。

Description

一种重组人干扰素α4编码cDNA序列及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种可在原核表达系统中高效表达的重组人干扰素α4编码cDNA序列及其应用。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是由细胞分泌的一类具有抗病毒等多种生物活性的蛋白质。它通过直接或间接作用于细胞干扰素效应基因，表达多种效应蛋白，从而发挥多样性的生物学功能。作为一种细胞功能调节物质，干扰素属于细胞因子。经国际干扰素命名委员会正式确定名称的干扰素种类有：IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNτ等几种。国内外学者迄今已从人类基因组中克隆了26个IFN基因。同一型别干扰素又分为若干亚型，其中α干扰素研究最多，业已发现人类基因组中至少存在13种具有不同功能的α干扰素亚型(见表1)。^【1～2】

表1干扰素基因命名及分类

生物进化是形成不同α干扰素亚型的重要原因。研究表明，从低等动物到人类都存在多种α干扰素亚型，α干扰素的型别和数量在不同种属间存在差异，但同一种属中不同α干扰素亚型具有较高的序列同源性。不同α干扰素亚型基因通常位于染色体同一区域且相邻成簇排列，其中间隔一些业已丧失功能的假基因。据推测，不同亚型α干扰素基因可能来源于同一祖先，其中的差异可能是生物体与环境之间相互选择和适应的结果。(3)

不同亚型α干扰素之间由于序列同源性较高，且与相同的细胞受体(interferonalpha/beta receptor)结合，通过相似的机理发挥作用，因而生物活性相近。从表面上看，不同亚型α干扰素的生物学活性似乎存在“冗余性”，但近年来大量研究表明，不同亚型α干扰素的存在均与其特殊的生物学意义相适应。不同亚型α干扰素之间的差别主要体现在：(1)不同亚型α干扰素基因在染色体上拷贝数不同，有些为单拷贝基因，有些为多拷贝基因，基因拷贝数的差异与其功能发挥有着较大的关系。(2)不同亚型α干扰素基因除了编码区存在差异外，编码区上游的启动子区亦明显不同，不同亚型的启动子区分别接受不同顺式元件或反式因子的刺激而活化，故不同亚型α干扰素基因对于相同诱生因子的反应性不同，而机体在不同诱生因子作用下干扰素系统亦表现出多形性，包括产生不同数量的α干扰素亚型、不同比例的α干扰素亚型等。(3)不同亚型α干扰素的效应分子、效应细胞不同，其生物活性亦存在差异。以抗病毒为例，不同亚型α干扰素的抗病毒谱不同，抗病毒活性不同，副作用的发生亦存在差异。因此对各种亚型分别进行区别性研究也是当前干扰素研究的重要思路。^(4～16)

IFNα4在先前文献中又被称为Interferon alpha-M1、Interferon alpha-76，是在上世纪80年代被克隆的IFNα基因，此后，该基因被定位于染色体9p22上。IFNα基因编码蛋白质为189个氨基酸的前体蛋白，其中前23个氨基酸为信号肽，成熟的编码多肽为166个氨基酸。在166个氨基酸的成熟肽中，存在以第1、99，29、139位半胱氨酸形成的2对二硫键。IFNα4在第51、114位氨基酸存在2种表型，若第51位为A、114位为E，则命名为IFNα4a；若第51位为T、114位为V，则命名为IFNα4b。IFNα4在正常人外周血单核细胞中有较高水平表达，在某些疾病状态下，亦检测到IFNα4的表达异常，上述结果提示IFNα4是构成人体抗病毒及抗肿瘤免疫调节的重要因子，可能在抗病毒及抗细胞增殖方面发挥重要作用。^(17～19)

目前，重组人α干扰素的应用开发主要集中在IFNα1b、IFNα2a、IFNα2b、共有序列干扰素等少数几个亚型上，有关IFNα4的表达及生物活性分析的研究很少^(20～21)，至今没有相关应用研究的报道。由于IFNα4在正常机体内含量极低，难以大量获得，严重的阻碍了对IFNα4的开发应用。采用人干扰素编码基因cDNA序列进行干扰素原核表达的报道已见诸文献^(22～24)。但目前人工设计并化学合成人IFNα4编码cDNA序列进行原核表达并无报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种原核生物特别是大肠杆菌中高效表达的重组人干扰素α4编码cDNA序列。

本发明的另一个目的在于提供包含本发明重组基因的质粒表达载体和宿主。

本发明还提供了含有本发明重组人干扰素α4抗原和肽链试剂。

根据本发明的一个方面，新的可表达重组人干扰素α4多肽的编码cDNA序列构建是通过对已知人干扰素α4编码cDNA的碱基序列进行重新设计，消除大肠杆菌稀有密码子，而代之以大肠杆菌偏爱密码子。密码子替换前后的对照如表2所示：

表2IFNα4cDNA序列

2a.改造前人IFNα4cDNA序列

tgt gat ctg cct cag acc cac agc ctg ggt aat agg agg gcc ttg 45

ata ctc ctg gca caa atg gga aga atc tct cat ttc tcc tgc ctg 90

aag gac aga cat gat ttc gga ttc ccc gag gag gag ttt gat ggc 135

cac cag ttc cag aag gct caa gcc atc tct gtc ctc cat gag atg 180

atc cag cag acc ttc aat ctc ttc agc aca gag gac tca tct gct 225

gct tgg gaa cag agc ctc cta gaa aaa ttt tcc act gaa ctt tac 270

cag caa ctg aat gac ctg gaa gca tgt gtg ata cag gag gtt ggg 315

gtg gaa gag act ccc ctg atg aat gag gac tcc atc ctg gct gtg 360

agg aaa tac ttc caa aga atc act ctt tat cta aca gag aag aaa 405

tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt gtc aga gca gaa atc atg aga 450

tcc ctc tcg ttt tca aca aac ttg caa aaa aga tta agg agg aag 495

gat tga 501

2b.本发明提供的人工改造后的人IFN α4cDNA序列(SEQ ID NO.1)

TGC GAT CTT CCG CAG ACT CAC TCT CTT GGT AAC CGT CGT GCT CTT 45

ATC CTT CTT GCT CAG ATG GGT CGT ATC TCT CAC TTC TCC TGC CTT 90

AAA GAT CGT CAC GAT TTC GGT TTC CCG GAA GAA GAG TTC GAT GGT 135

CAC CAG TTC CAG AAA GCT CAG GCT ATC TCT GTT CTT CAC GAA ATG 180

ATC CAG CAG ACT TTC AAC CTT TTC TCT ACT GAA GAT TCT TCT GCT 225

GCT TGG GAA CAG TCT CTT CTT GAA AAA TTC TCT ACT GAA CTT TAC 270

CAG CAG CTT AAC GAT CTT GAA GCA TGC GTT ATC CAG GAA GTT GGT 315

GTT GAA GAA ACT CCG CTT ATG AAC GAA GAT TCT ATC CTT GCT GTT 360

CGT AAA TAC TTC CAG CGT ATC ACT CTT TAC CTT ACT GAA AAA AAA 405

TAC TCT CCG TGC GCT TGG GAA GTT GTT CGT GCT GAA ATC ATG CGT 450

TCT CTT TCT TTC TCT ACT AAC CTT CAG AAA CGT CTT CGT CGT AAA 495

GAT TAA 501

根据本发明的另一个方面，将本发明合成的人IFNα4编码cDNA序列连接进入质粒而构建成本发明的重组质粒载体。在本发明的一个方案中，在合成的人IFNα4编码cDNA序列上连接了目的基因插入位点上游约550bp大小片断，并在此基础上在5’端和3’端分别连上了NcoI酶切位点和PstI酶切位点，经双酶切后，与同样含有这两个酶切位点的质粒pTYB11相连。

根据本发明的再一方面，用获得的本发明的重组质粒载体转化大肠杆菌而得到本发明的含有重组人IFNα4编码cDNA序列的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，将重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，鉴定筛选出含有重组人IFNα4基因的重组质粒转化细胞。

根据本发明的又一方面，提供含有本发明重组人IFNα4的抗原和肽链蛋白试剂，可用于制备抗人IFNα4单克隆抗体的抗原，也可用于制备检测所用的阳性对照标准品，以及其他相类似应用。

由于目前人干扰素α4多肽难于获得，这成为了对其深入研究和实际应用的障碍。为了大量且低成本的获得人干扰素α4多肽，促进其基础研究和在医药上的应用、并实现其产业化生产，本发明参考大肠杆菌密码子的偏好性，设计并人工合成了IFN α4全长编码cDNA序列SEQ ID NO.1，结果发现密码子替换后能在大肠杆菌中高效表达人干扰素α4，为研究原核系统表达的人干扰素α4的相关性质和进一步开发应用奠定了基础。本发明制备重组人干扰素α4的方法中，在保证工程菌高效表达产物的前提，优化了发酵培养参数，获得了大量的工程菌用于提取纯化重组人干扰素α4多肽。纯化后得到的重组人干扰素α4多肽经检测达到了药典相关标准规定的体外活性标准。用本发明制备的重组人干扰素α4多肽产量大、活性高、工艺简化，成本明显降低，能对人干扰素α4的相关研究和产业化应用起极大的推动作用。

附图说明

图1IFNα4全长cDNA PCR扩增电泳图

其中：Marker为核酸分子量marker，1、2为IFNα4全长cDNA扩增结果。

图2重组原核表达载体pTYB11/IFNα4构建示意图

其中2a为pTYB11载体上游片断与IFNα4基因片断连接示意图；2b为融合基因片断与pTYB11载体连接示意图。

图3重组原核表达载体pTYB11/IFNα4构建电泳图

其中M为核酸分子量marker，1为载体上游片断与IFNα4PCR连接结果，2为载体上游片断扩增结果，3为IFNα4基因扩增结果。

图4目的蛋白表达SDS-PAGE电泳图

其中M为标准蛋白分子量marker，1、3、5、7为上清，2、4、6、8为沉淀；分子量约为70Kda的蛋白条带为前体融合蛋白，经扫描分析最大表达量约占可溶性蛋白总量的30％。

图5目的蛋白纯化过程电泳图

其中M为标准蛋白分子量marker，1为破菌后上清，2、3和4分别为使用NEB亲和层析介质和国产自制层析介质纯化最终所得目的蛋白(目的蛋白均经过自剪切，去除intein)，其分子量约为19kd，5为层析柱再生所得的吸附蛋白。

图6目的蛋白Western blot图

其中M为标准蛋白分子量marker，1为纯化的目的蛋白rhIFNα4纯品。

具体实施方式

下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述对本发明进行说明，但不应理解为是对本发明的限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种修改或替换，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明的范围。

实施例一重组人干扰素α4多肽基因的合成

1材料

IFNα4编码cDNA序列拼接引物(均为5’到3’方向，2OD值，PAGE纯化)由上海博亚公司合成。大肠杆菌JM10、克隆载体pGEM-T、T4多核苷酸磷酸化酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司。质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒，DNA纯化试剂盒为Omega公司产品。PCR扩增仪为杭州大和公司产品，凝胶成像系统、垂直电泳系统为BIO-RAD公司产品。

2方法

2.1引物设计

根据Genbank上重组人干扰素α4多肽氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性原则重新设计23条用于基因拼接的正、反链DNA引物，引物序列见表3。

表3重组人干扰素α4多肽基因合成引物

2.2引物磷酸化

将上述引物稀释至100pmol/L的浓度，各取1ul，于70℃变性5min后立即置于冰上放置5min。上述混合液加入10×T4 ligase buffer、T4 polynucleotide kinase及ddH₂O，反应体系如下：

经处理的引物混合液 23ul

10×T4 ligase buffer 4ul

T4 polynucleotide kinase 1ul

ddH₂O 11ul

39ul

37℃反应1h后置70℃放置10min，然后置94℃1min，55℃1min，室温自然冷却。

2.3引物连接

将5’磷酸化产物加入以下反应体系：

5’磷酸化产物 39ul

10×T4DNA ligase buffer 5ul

10×T4DNA ligase 1ul

ddH₂O 5ul

50ul

于16℃连接4h后，65℃灭活10min。采用Omega核酸纯化回收试剂盒回收连接片断，最后以30ul ddH₂O洗脱。

2.4PCR扩增

以连接反应产物为模板，加入首条正链和末条反链引物，进行全长IFNα4 cDNA基因扩增，PCR反应体系如下：

连接反应产物 2ul

10×PCR buffer 5ul

25mmol/L MgCl₂ 5ul

dNTPs(2mmol/each) 4ul

引物A-1(100mol/L) 1ul

引物B-12(100mol/L) 1ul

EX Taq酶(1U/ul) 0.5ul

ddH₂O 32.5ul

50ul

反应结束，于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳。

2.5PCR产物的凝胶回收、纯化

合并PCR产物150ul，采用2％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片断，目的片断回收采用Omega公司凝胶回收试剂盒回收，最终洗脱液溶于30ul ddH₂O中。

2.6目的基因与T载体的连接、转化，克隆筛选及鉴定

取凝胶回收纯化的PCR产物4ul加入pGEM-T载体DNA 1ul，连接缓冲液5ul，16℃连接4h。将连接产物转化感受态细菌JM109，然后涂布于含100ug/ml Amp的固体LB培养基平板中，37℃培养过夜。挑取单菌落加入5ml含100ug/ml Amp的液体LB培养基试管中，37℃培养6h。采用Omega公司质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，对质粒进行酶切鉴定，鉴定阳性的载体送上海博亚公司测序。将测序证实完全正确的序列命名为pGEM-T/IFNα4，保存菌种。

3结果

将合成的23条引物磷酸化，连接，以连接产物为模板，经PCR扩增得到大小约550bp的IFNα4全长cDNA(见图1)，将其成功连接于克隆载体pGEM-T，经测序证实得到阳性重组质粒pGEM-T/IFNα4。

实施例二重组人干扰素α4多肽原核表达载体pTYB11/IFNα4的构建

1材料

基因扩增引物(均为5’到3’方向，2OD值，PAGE纯化)由上海博亚公司合成。大肠杆菌JM109、Deep Vent DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，原核表达载体pTYB11购自NEB公司。质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒，DNA纯化试剂盒为Omega公司产品。PCR扩增仪(Ferrotec)为杭州大和公司产品，凝胶成像系统、垂直电泳系统为BIO-RAD公司产品。

2方法

由于目的基因片断不能直接通过表达载体pTYB11上多克隆酶切位点进行连接，因此首先设计两对引物，分别扩增表达载体pTYB11上目的基因插入位点上游约550bp大小片断及目的基因约520bp大小片断。载体上游片断扩增引物5’端加入了NcoI酶切位点，目的基因片断扩增引物3’端加入了PstI酶切位点。两片断分别含有能够通过PCR进行连接的重叠基因序列，两片断通过重叠PCR方法进行连接，连接产物再通过其上游的NcoI和下游的PstI酶切位点定向插入载体pTYB11中，构建成重组原核表达载体pTYB11/IFNα4(见图2)。

2.1引物设计

分别设计pTYB11载体上游片断扩增引物C-1、D-1及目的基因IFNα4扩增引物E-1、F-1。

C-1 GGT CCA TGG TGG TAT TCG CAA TAA(NcoI)

D-1 GTT CTG TAC AAC AAC CTG GGA TCC AA

E-1 TCC CAG GTT GTA CAG AAC TGC GAT CTG CCG CAG AC

F-1 GGT CTG CAG TCA TTA ATC TTT GCG GCG CA(PstI)

2.2PCR扩增

pTYB11上游片段的扩增：取pTYB11质粒DNA 1ug作模板，以C-1、D-1为引物，PCR反应条件如下：

pTYB11DNA 1ul

10×PCR buffer 5ul

dNTPs(10mmol/each) 1ul

引物C-1(100mol/L) 1.25ul

引物D-1(100mol/L) 1.25ul

Deep Vent酶(2U/ul) 0.5ul

ddH₂O 40ul

50ul

反应结束，于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳。

IFNα4片段的扩增：取pGEM-T/IFNα4质粒DNA 1ug作模板，以E-1、F-1为引物，PCR反应条件如下：

PGEM-T/IFNα4DNA 1ul

10×PCRbuffer 5ul

dNTPs(10mmol/each) 1ul

引物E-1(100mol/L) 1.25ul

引物F-1(100mol/L) 1.25ul

Deep Vent酶(2U/ul) 0.5ul

ddH₂O 40ul

50ul

反应结束，于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳。

2.3PCR产物的连接

取上述PCR产物各5ul，进行PCR连接反应，连接反应体系如下：

IFNα4DNA 5ul

载体上游片段 5ul

10×PCRbuffer 5ul

dNTPs(10mmol/each) 1ul

引物C-1(100mol/L) 1.25ul

引物F-1(100mol/L) 1.25ul

Deep Vent酶(2U/ul) 0.5ul

ddH₂O 31ul

50ul

反应结束，于1％的琼脂糖凝胶上电泳。

2.4目的基因及载体的酶切

取表达载体pTYB11质粒DNA及经凝胶回收、纯化的PCR连接产物各25ul(1ug/ul)，进行NcoI和PstI双酶切，酶切反应体系如下：

pTYB11质粒DNA 25ul 纯化的PCR连接产物 25ul

NcoI(10u/ul) 1ul NcoI(10u/ul) 1ul

PstI(10u/ul) 1ul PstI(10u/ul) 1ul

10×buffer 5ul 10×buffer 5ul

ddH₂O 18ul ddH₂O 18ul

50ul 50ul

37℃，酶切3h。各取2ul酶切产物行1％琼脂糖凝胶电泳，若酶切完全，则采用低熔点琼脂糖回收载体及目的基因片断，最后分别溶于30ul ddH₂O中。

2.5目的基因与表达载体的连接、转化，克隆筛选及鉴定

取酶切回收的载体质粒DNA0.5ul，置于1.5mlEppendorf管底部，再加入酶切回收的目的基因DNA片断4.5ul，加入Takara公司DNA ligation Sol I 5ul，16℃连接过夜。将连接产物涂布于含100ug/ml Amp的固体LB培养基平板中，37℃培养过夜。挑取单菌落加入5ml含100ug/ml Amp的液体LB培养基试管中，37℃培养6h。采用Omega公司质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，对质粒进行酶切鉴定，鉴定阳性的载体送上海博亚公司测序。将测序证实完全正确的序列命名为pTYB11/IFNα4，保存菌种。

3结果

以pTYB11质粒DNA作模板，以C-1、D-1为引物进行PCR反应。反应结束，于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，结果在约550bp处呈一特异性扩增带(见图3)。

以pGEM-T/IFNα4质粒DNA作模板，以E-1、F-1为引物进行PCR反应。反应结束，于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，结果在约520bp处呈一特异性扩增带(见图3)。

将上述PCR产物各5ul，进行PCR连接反应。反应结束，于1％的琼脂糖凝胶上电泳，结果在约1100bp处呈一特异性连接产物带(见图3)。

PCR连接产物成功连接于原核表达载体pTYB11，经测序证实得到阳性重组质粒pTYB11/IFNα4。

实施例三重组原核表达载体pTYB11/IFNα4工程菌的发酵

1材料

表达大肠杆菌BL21(DE3)购自上海生工生物工程公司，原核表达载体pTYB11购自NEB公司。质粒抽提试剂盒，凝胶回收试剂盒为Omega公司产品。干扰素单抗为华美公司产品，其余常规试剂均为我室自备。BioFloIII型7L自动控制发酵罐为New BrunswickScientific公司产品，细胞高压匀质机为上海医疗仪器厂产品，凝胶成像系统、垂直电泳系统为BIO-RAD公司产品。

2方法

将实施例2所得的阳性重组质粒pTYB11/IFNα4重新转化表达大肠杆菌BL21(DE3)，经筛选得到pTYB11/IFNα4BL21(DE3)工程菌。

2.1培养液的配制

(1)种子液培养基500ml

Tryptone 5g

Yeast Extract 2.5g

NaCl 5g

加去离子水定容至500ml，在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(2)基础培养基

Trypt one 44g

Yeast Extract 22g

NaCl 44g

加去离子水定容至3800ml，随发酵罐在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(3)磷酸盐缓冲液

K₂HPO₄·3H₂O 28.5g

KH₂PO₄ 17g

加去离子水定容至120ml，在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(4)补料培养基I

葡萄糖 40g

加去离子水定容至80ml

MgSO₄·7H₂O 4g

加去离子水定容至20ml

在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

(5)补料培养基II

Tryptone 20g

加去离子水定容至100ml

Yeast Extract 40g

加去离子水定容至200ml

在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

维生素溶液 10ml

微量金属溶液 10ml

(6)补料培养基III

Tryptone 30g

加去离子水定容至150ml

Yeast Extract 10g

加去离子水定容至50ml

葡萄糖 60g

加去离子水定容至120ml在121℃，1.034×10⁵Pa高压蒸气灭菌20min。

2.2菌种的活化

取-70℃，20％甘油保存的菌种pTYB11/IFNα4BL21(DE3)的种子菌100ul，接种于5ml含100ug/ml Amp的液体LB培养基试管中，32℃，220rpm培养10h；再按2％的比例接种于50ml含100ug/ml Amp的液体LB培养基烧瓶中，32℃，220rpm培养4h，得到活化种子菌。活化种子菌可于4℃短期保存。

2.3发酵种子液的培养取活化种子液，以1∶1000的比例接种于500ml含100ug/mlAmp的液体LB培养基的1000ml烧瓶中，32℃，220rpm培养至菌体密度OD值约为2.5。

2.4发酵罐的培养使用New Brunswick Scientific公司的BioFlo III型7L自动控制发酵罐进行发酵培养，中间按方案进行补料和监测，发酵全过程经优化的参数见表4：

表4重组原核表达载体pTYB11/IFNα4工程菌发酵参数

2.5离心收集菌体，得湿菌总重约350g。

2.6菌体采用细胞高压匀质机破碎后4000rpm离心30min，分离上清及沉淀，然后分别取上清和沉淀各10ul，行SDS-PAGE电泳。

3结果：

菌体诱导起始密度OD值为15-20，诱导温度为15-18℃，诱导时间为12-16h时，表达蛋白大部分为可溶性形式，此时重组可溶性蛋白占菌体可溶性蛋白总量的比例＞30％(见图4)。

实施例四重组人干扰素α4多肽的纯化

1材料

几丁质磁珠购自NEB公司，β-1，4-聚乙酰葡萄糖胺(几丁质)购自济南海德贝海洋生物工程有限公司，其他层析介质购自安玛西亚(中国)有限公司，超滤系统为Millipore产品，凝胶成像系统、垂直电泳系统为BIO-RAD公司产品。

2方法及结果

2.1亲和层析

亲和层析采用NEB公司商品化介质几丁质磁珠。

(1)将几丁质磁珠在使用前按说明书要求进行预处理后装柱。

(2)以3倍体积的PBS buffer平衡柱床，将破菌后的菌体上清液上柱，上样流速1～2ml/min，收集穿透液反复上柱2次。

(3)样品上柱完毕后，以3倍柱床体积的PBS buffer冲洗柱床，至紫外监测仪显示波峰回复至基线。

(4)采用含100nmol/L NaCl₂的PBS buffer(PH7.0)洗脱柱床，根据紫外监测波峰分段收集流出液。

2.2疏水层析

(1)采用Phenyl Sepharose 6Fast Flow(low sub)为疏水介质，常规装柱。

(2)以2倍柱床体积的bufferA(50mmol磷酸钠，1.0M硫酸铵，PH7.0)平衡柱床。

(3)以含1.0M硫酸铵的亲和层析洗脱液(PH7.0)上柱，上样结束后以若干倍体积的bufferA冲洗柱床，至紫外监测仪显示波峰回复至基线。

(4)以硫酸铵浓度梯度降低的buffer B(50mmol磷酸钠，PH7.0)洗脱柱床，根据紫外监测波峰分段收集流出液(纯化结果见图5)。

2.3超滤浓缩

合并含有目的蛋白的收集管，经Millipore超滤浓缩器浓缩后再过0.25nm的滤膜除菌，置于-20℃。按照蛋白定量及生物活性检测数值，分装、冻干，每只样品含rhIFN-α4比活为5.0×10⁶IU。然后采用干扰素单抗作为一抗进行免疫印迹(Western blot)，证实了所获产物为干扰素(见图6)。

实施例五重组人干扰素α4多肽的活性的检测

1原理

rhIFN-α4效价测定采用细胞病变抑制法。不同浓度的rhIFN-α4加入人羊膜wish细胞培养后，用VSV水泡性口炎病毒攻击，通过比较标准品与待检品对wish细胞的病变抑制程度，计算出待检品生物活性效价。

2材料

人α型干扰素国家标准品(购自中国药品生物制品检定所)

rhIFN-α4待检品

wish细胞株

MEM培养基(GIBCO公司)

染色液：50mg结晶紫加入20ml乙醇中，加水至100ml

脱色液：50％乙醇，50％蒸馏水，0.1％乙酸

96孔培养板(NUNC公司)

酶标仪(model 550，Bio-rad公司)

3方法

(1)用含10％小牛血清的MEM培养液调整wish细胞浓度为3.0×10⁵/mL接种于96孔培养板，每孔100μl；37℃、5％CO₂条件下培养4-6h。

(2)标准品与待检品均用含7％牛血清的MEM稀释至10³IU/ml作为上样起始浓度，在稀释板上进行4倍倍比稀释后，(8个稀释度)分别加入96孔板，每孔50ul，(每个稀释度设复孔)同时设立细胞、病毒对照；37℃、5％CO₂条件下培养18-24h。

(3)细胞板弃上清，加入剂量为100TCID₅₀ VSV病毒液，每孔100ul；37℃、5％CO₂条件下培养24h。

(4)弃上清，每孔加入50ul结晶紫染色液，室温放置30min。

(5)用蒸馏水小心冲去染色液，吸干残留水分。每孔加入100ul脱色液，室温放置3-5min后分别于酶标仪570、630nm处测定O.D值。

(6)由对照品和待测品曲线比较求出待测品活性单位。

4结果

从本发明方法生产的rhIFN-α₄纯化样品中抽取三批rIFN-α纯化品进行效价测定(结果见表5)。

表5rhIFN-α₄纯化品的效价测定

批号	比活性(IU/mg)
批号	比活性(IU/mg)	1	0.82×10<sup>8</sup>
2	1.05×10<sup>8</sup>	1	0.82×10<sup>8</sup>
2	1.05×10<sup>8</sup>	3	2.01×10<sup>8</sup>

上述结果表明本发明方法制备得到的多肽比活性均在0.82×10⁸-2.01×10⁸IU/mg范围内，表明纯化品生物活性已经达到干扰素类产品国家药典要求(《中华人民共和国药典》，2005年版，三部，第203-223页)。

上述实施例表明，本发明人IFNα4编码cDNA序列能够在原核表达载体中大量表达生产高活性的人IFNα4多肽，解决了目前人干扰素α4多肽难于获得的困难，将大大的促进人干扰素α4多肽在基础研究和在医药上的应用。本发明制备重组人干扰素α4多肽产量大、活性高、工艺简化，成本低，能对人干扰素α4的相关研究和产业化应用起极大的推动作用。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明作出各种改变及变形，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。

【参考文献】：

(1)Olopade OI，Bohlander SK，Pomykala H，et al.，Mapping of the shortest region ofoverlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia.Genomics.1992 Oct；14(2)：437-43.

(2)Diaz MO，Pomykala HM，Bohlander SK，et al.，Structure of the human type-I interferongene cluster determined from a YAC clone contig.Genomics，1994；22(3)：540-52.)

(3)Robert RM，Liu L，Guo Q，et al.，The evolution of type I interferons.J InterferonCytokine Res.1998；18(10)：805-16.Hughes AL.The evolution of the type I interferon genefamily in mammals.J Mol Evol.1995；41(5)：539-48.Gillespie D，Carterw.Concerted evolutionof human interferon alpha genes.J Interferon Res.1983；3(1)：83-8.

(4)J Chen，E Baig，and EN Fish.Diversity and relatedness among the type I interferons.JInterferon Cytokine Res，December 1，2004；24(12)：687-98.

(5)Betsy J.Barnes，Paul A.Moore，and Paula M.Pitha.Virus-specific Activation ofa Novel Interferon Regulatory Factor，IRF-5，Results in the Induction of DistinctInterferon α Genes.J.Biol.Chem.，Vol.276，Issue 26，23382-23390，June 29，2001

(6)Catharien M.U.Hilkens，

F.Schlaak and Ian M.Kerr.Differential Responsesto IFN-α Subtypes in Human T Cells and Dendritic Cells.The Journal of Immunology，2003，171：5255-5263.

(7)Graham R.Foster，Siti H.Masri，Rachel David，Meleri Jones，Arpita Datta，GiovannaLombardi，Laura Runkell，Carole de Dios，Irene Sizing，Martha J.James and Federica M.Marelli-Berg.IFN-α Subtypes Differentially Affect Human T Cell Motility.The Journal ofImmunology，2004，173：1663-1670.

(8)E Larrea，A Alberdi，Y Castelruiz，P Boya，MP Civeira，and J Prieto.Expressionof interferon-alpha subtypes in peripheral mononuclear cells from patients with chronichepatitis C：a role for interferon-alpha5.J Viral Hepat，March 1，2001；8(2)：103-10.

(9)PK Weck，S Apperson，L May and N Stebbing.Comparison of the antiviral activitiesof various cloned human interferon-alpha subtypes in mammalian cell cultures.Journal ofGeneral Virology，Vol 57，233-237

(10)Y Yanai，O Sanou，K Yamamoto，H Yamauchi，H Ikegami，and M Kurimoto.The anti-tumoractivities of interferon(IFN)-alpha in chronic myelogenous leukaemia(CML)-derived celllines depends on the IFN-alpha subtypes.Cancer Lett，November 28，2002；185(2)：173-9.

(11)GR Foster，O Rodrigues，F Ghouze，E Schulte-Frohlinde，D Testa，MJ Liao，GR Stark，L Leadbeater，and HC Thomas.Different relative activities of human cell-derivedinterferon-alpha subtypes：IFN-alpha 8 has very high antiviral potency.J InterferonCytokine Res，December 1，1996；16(12)：1027-33.

(12)AL Greenway，ML Overall，N Sattayasai，MJ Rowley，PJ Hertzog，GL McMullen，BFCheetham，and S Marzuki.Selective production of interferon-alpha subtypes by culturedperipheral blood mononuclear cells and lymphoblastoid cell lines.Immunology，January 1，1992；75(1)：182-8.

(13)A Verhagen，IR Mackay，M Rowley，and M Tymms.Comparison of augmentation of humannatural killer cell cytotoxicity by interferon-alpha subtypes.Nat Immun Cell Growth Regul，January 1，1990；9(5)：325-33.

(14)BS Edwards，MJ Hawkins and EC Borden.Comparative in vivo and in vitro activationof human natural killer cells by two recombinant alpha-interferons differing in antiviralactivity.Cancer Research，Vol 44，Issue 73135-3139，Copyright

(15)EN Fish，K Banerjee，and N Stebbing.Human leukocyte interferon subtypes havedifferent antiproliferative and antiviral activities on human cells.Biochem Biophys ResCommun，April 29，1983；112(2)：537-46.

(16)M Tonew，B Gluck，E Ohme，and RH Wondraczek.Sensitivity of different cell linesto interferons：the relative antiviral activity as a function of the interferon subtype.JBasic Microbiol，January 1，1989；29(8)：537-45.)

(17)AL Greenway，PJ Hertzog，RJ Devenish，et al.，Immunologicalisation of interferon-alpha inhepatitis C patients and its correlation with response to interferon-alpha therapy.JHepatol.1994；21(5)：842-52

(18)ER Brandt，IR Mackay，PJ Hertzog，et al.，Molecular detection of intefferon-alpha expression inmultiple sclerosis brain.J Neuroimmunol.1993；44(1)：1-5

(19)Yokota S，Yokosawa N，Okabayashi T，et al.，Induction of suppressor of cytokine signaling-3 byherpes simplex virus type 1 contributes to inhibition of the interferon signaling pathway.JVirol.2004；78(12)：6282-6.)

(20)Linnane AW，Beilharz MW，McMullen GL，et al.，Nucleotide sequence and expression in E.coli ofa human interferon-alpha gene selected from a genomic library using synthetic oligonucleotides.BiochemInt.1984；8(5)：725-32.

(21)M Galanis，LWang，P Nagley，et al.，Duplication of secretion signal sequence in deleterious for thesecretion of human intefferon alpha 4 from Saccharomyces cerevisiae and Bacillus subtilis.Biochem MolBiol Int，1993；30(2)：271-82.)

(25)Chong S，Mersha F.B，Comb D.G，et al.，Single-column purification of free recombinant proteinsusing a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element.Gene，1997；192：277-281.

(22)Nagase Y，Nakamura N，Tohyama J，et al.，Chemical synthesis of a human fibroblast interferongene and its expression in Escherichia coli.Nucleic Acids Symp Ser.1983；(12)：83-6.

(23)Edge MD，Greene AR，Heathclifie GR，et al.，Chemical synthesis of a human interferon-alpha 2gene and its expression in Escherichia coli.Nucleic Acids Res.1983；11(18)：6419-35.

(24)Neves FO，Ho PL，Raw I，et al.，Overexpression of a synthetic gene encoding human alpha interferon inEscherichia coli.Protein Expr Purif.2004；35(2)：353-9).

一种重组人干扰素α4多肽编码cDNA序列及其制备方法与应用.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>成都地奥制药集团有限公司

<120>一种重组人干扰素α4多肽编码cDNA序列及其制备方法与应用

<130>3256

<160>28

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>501

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>1

tgcgatcttc cgcagactca ctctcttggt aaccgtcgtg ctcttatcct tcttgctcag 60

atgggtcgta tctctcactt ctcctgcctt aaagatcgtc acgatttcgg tttcccggaa 120

gaagagttcg atggtcacca gttccagaaa gctcaggcta tctctgttct tcacgaaatg 180

atccagcaga ctttcaacct tttctctact gaagattctt ctgctgcttg ggaacagtct 240

cttcttgaaa aattctctac tgaactttac cagcagctta acgatcttga agcatgcgtt 300

atccaggaag ttggtgttga agaaactccg cttatgaacg aagattctat ccttgctgtt 360

cgtaaatact tccagcgtat cactctttac cttactgaaa aaaaatactc tccgtgcgct 420

tgggaagttg ttcgtgctga aatcatgcgt tctctttctt tctctactaa ccttcagaaa 480

cgtcttcgtc gtaaagatta a 501

<210>2

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>2

tgcgatcttc cgcagactca ctctcttggt aaccgtcgtg ctctta 46

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>3

tccttcttgc tcagatgggt cgtatctctc acttctcctg ccttaa 46

<210>4

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>4

agatcgtcac gatttcggtt tcccggaaga agagttcgat ggtcac 46

<210>5

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>5

cagttccaga aagctcaggc tatctctgtt cttcacgaaa tgatcc 46

<210>6

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>6

agcagacttt caaccttttc tctactgaag attcttctgc tgcttg 46

<210>7

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>7

ggaacagtct cttcttgaaa aattctctac tgaactttac cagcag 46

<210>8

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>8

cttaacgatc ttgaagcatg cgttatccag gaagttggtg ttgaag 46

<210>9

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>9

aaactccgct tatgaacgaa gattctatcc ttgctgttcg taaata 46

<210>10

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>10

cttccagcgt atcactcttt accttactga aaaaaaatac tctccg 46

<210>11

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>11

tgcgcttggg aagttgttcg tgctgaaatc atgcgttctc tttctt 46

<210>12

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>12

tctctactaa ccttcagaaa cgtcttcgtc gtaaagatta a 41

<210>13

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>13

gagtgagtct gcggaagatc gca 23

<210>14

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>14

acgacccatc tgagcaagaa ggataagagc acgacggtta ccaaga 46

<210>15

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>15

ggaaaccgaa atcgtgacga tctttaaggc aggagaagtg agagat 46

<210>16

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>16

atagcctgag ctttctggaa ctggtgacca tcgaactctt cttccg 46

<210>17

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>17

agagaaaagg ttgaaagtct gctggatcat ttcgtgaaga acagag 46

<210>18

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>18

atttttcaag aagagactgt tcccaagcag cagaagaatc ttcagt 46

<210>19

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>19

acgcatgctt caagatcgtt aagctgctgg taaagttcag tagaga 46

<210>20

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>20

atcttcgttc ataagcggag tttcttcaac accaacttcc tggata 46

<210>21

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>21

ggtaaagagt gatacgctgg aagtatttac gaacagcaag gataga 46

<210>22

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>22

gcacgaacaa cttcccaagc gcacggagag tatttttttt cagtaa 46

<210>23

<211>46

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>23

acgtttctga aggttagtag agaaagaaag agaacgcatg atttca 46

<210>24

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>24

ttaatcttta cgacgaag 18

<210>25

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>25

ggtccatggt ggtattcgca ataa 24

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>26

gttctgtaca acaacctggg atccaa 26

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>27

tcccaggttg tacagaactg cgatctgccg cagac 35

<210>28

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Artificial Sequence

<400>28

ggtctgcagt cattaatctt tgcggcgca 29

Claims

1.一种可在原核表达系统中高效表达的重组人干扰素α4编码cDNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组质粒载体，其特征在于含有权利要求1所述重组人干扰素α4编码cDNA序列。

3.根据权利要求2所述的重组质粒载体，其特征在于所述质粒载体是将SEQID NO.1所示核苷酸序列与质粒pTYB11连接而构建的。

4.含有权利要求1所述核苷酸序列的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为原核细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是用含有将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组质粒载体转入大肠杆菌BL21(DE3)而制备的。