CN115057946B - 干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用 - Google Patents

干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用 Download PDF

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    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
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Abstract

本发明公开了干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，所述干扰素为人源IFN‑a4，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；用于制备广谱抑制流感病毒亚型和新型冠状病毒的复制。本发明提供的干扰素IFN‑a4可以用于广谱抗流感病毒和新型冠状病毒等呼吸道RNA病毒以及相关感染的生物药物或者产品以及其重组构建体系。

Description

干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用。
背景技术
干扰素是宿主固有免疫系统中具有强大的抗病毒和免疫调节功能的关键性分子。I型IFN是病毒感染细胞的首要响应细胞因子，具有典型的抗病毒作用。然而目前仅有有限的干扰素种类应用于临床。在SARS-CoV-2感染的早期，对患者使用I型干扰素具有治疗益处。英国Synairgen生物技术公司临床实验通过雾化吸入IFN-β制剂能够显著降低新冠患者发展成重症的几率。IFN-α2本身已经进入了我国的诊疗方案之中。IFN-α能够协同IFN-λ抑制诺如病毒的复制，其中IFN-λ小肠上皮细胞内的感染复制，IFN-α控制其它细胞内的病毒复制和蔓延。IFN-α2是目前为止最为有效的抗HIV类IFN，和抗HIV药物联用能够有效的降低HIV潜伏病毒的RNA水平，有研究证实IL-21和IFN-α2联用能有效降低SIV感染的恒河猴体内的炎症水平和病毒复制，并在抗病毒药物停止后依然显著抑制SIV病毒反弹。重组IFN-α2被应用于抗乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染的治疗药物，IFN-β被应用于治疗多发性硬化症（MS）。对于IFNa4的抗病毒功能目前鲜有研究。
以新型冠状病毒和流感病毒引发的急性呼吸道传染性疾病多次在全世界不同国家和地区爆发，已经成为公共卫生领域面临的严峻挑战之一。流感所引起的发病率与死亡率高，每年导致2百万到5百万的重症病例患者和25万到50万的死亡病例，据估计，全球感染患者中，成人为5-10%，儿童为20-30%。流感除了严重的疾病负担，还会造成巨大的直接与间接经济负担。自从2013年H7N9爆发以后，WHO总共收到1567例实验室确诊人感染病例。H7N9在人上呼吸道初次感染潜伏4-18天以后，进一步向下呼吸道侵袭，导致了大部分的病人，尤其老年人病情严重。目前为止，尚未有有效的药物能够治疗H7N9患者，患者在使用达菲2天后就能够产生耐药性，帕拉米韦的治疗效果也不甚理想。因此研发新型广谱抗流感的药物是一个亟待解决的难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：研发新型广谱抗流感的药物是一个亟待解决的难题，本发明提供了解决上述问题的干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，干扰素IFN-a4可以用于广谱抗流感病毒和新型冠状病毒等呼吸道RNA病毒以及相关感染的生物药物或者产品以及其重组构建体系。
本发明通过下述技术方案实现：
干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，所述干扰素为人源IFN-a4，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；用于制备广谱抑制流感病毒亚型和新型冠状病毒的复制。
进一步可选地，所述流感病毒包括H1N1、H9N2、PR8、H7N9和H5N6等高致病禽流感病毒。
进一步可选地，所述冠状病毒包括Wuhan hu-1、Delta和Omicron SARS-CoV-2毒株。
一种干扰素融合蛋白，包括人源IFN-a4和FC片段。
进一步可选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步可选地，编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步可选地，用于融合蛋白的表达载体包括pcDNA3.1、pSV1.0等真核载体，腺病毒、痘病毒、AAV等病毒载体，pET15b、pET28a、pGEX4T1、pGEX-6p-1等原核载体。
一种干扰素融合蛋白的制备方法，包括在IFN-a4蛋白N端连上IgG FC片段，通过IgG磁珠进行纯化获得融合蛋白。
本发明制备的干扰素融合蛋白，可加强融合蛋白的稳定性、延长蛋白的半衰期、降低免疫原性、增强蛋白抗病毒功能。干扰素融合蛋白在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，干扰素融合蛋白为上述的干扰素融合蛋白，或者为上述的干扰素融合蛋白的制备方法制备获得的干扰素融合蛋白。
本发明具有如下的优点和有益效果：
本发明提供的干扰素IFN-a4蛋白制品，可以广谱抑制流感病毒的复制和新型冠状病毒的感染，并在小鼠体内展示了优于IFN-a2的抗流感病毒的效果。后期可以进一步扩大应用至呼吸道RNA病毒。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为重组IFN-a4蛋白的纯化鉴定。
图2为IFN-a4抑制H9N2毒株的复制。
图3为IFN-a4抑制H1N1 CA04毒株的复制。
图4为IFN-a4抑制PR8毒株的复制。
图5为IFN-a4和IFN-a2对小鼠感染PR8的保护测试及诶过。
图6为IFN-a4和IFN-a2保护小鼠感染后的HE病理结果。
图7为IFN-a4抑制pSARS-CoV-2 wuhan hu-1毒株的感染测试结果。
图8为IFN-a4抑制pSARS-CoV-2 Omicron毒株的感染测试结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、材料或方法。
在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
实施例1
本实施例提供了一种干扰素融合蛋白，干扰素为人源IFN-a4，氨基酸序列如SEQID NO:1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。编码融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。通过以下方法制备获得：
在IFN-a4蛋白N端连上IgG FC片段，通过IgG磁珠进行纯化，鉴定结果现实其纯度大于95%, 且活性高于普通IFN-a4。
一、基因的获取
登陆NCBI网站，查询Homo sapiens (human) IFNA4，结果显示该基因有且只有一种转录本NM_021068.4，即可得到该基因的CDS区核苷酸编码。
二、表达载体的构建
得到核苷酸序列后，于公司合成相应片段，连接于质粒pcDNA3.1；而后通过酶切连接的方法与其他质粒连接。
三、融合蛋白的表达
将HEK293细胞提前一天铺种于培养瓶中，于37℃ 5% CO2培养箱培养，第二天将质粒与转染试剂一起孵育20min后加到细胞中，6h后换培养液；继续培养48h后收取细胞培养上清液。
四、融合蛋白的纯化
1)将细胞培养上清收集至15 mL离心管，加入200 μL Protein G琼脂糖珠溶液，放置在四维摇床上4℃冷库过夜，孵育12-16小时；
2)取出15 mL离心管，1000 g离心5min，去除上清，将Protein G琼脂糖珠子沉淀用500 μL PBS缓冲液重悬，转移至1.5 mL纯化柱中，100 g离心30s；
3)洗脱：弃去柱下收集管中液体，将柱子换入新的1.5 mLEP管，加入400 μL甘氨酸缓冲液（pH=2.7），100 g离心30s进行洗脱，收集洗脱液；
4)中和：向洗脱液中迅速加入10 μL Tris碱缓冲液进行中和；
5)超滤：将得到的蛋白溶液加入PBS缓冲液，在超滤管中离心，置换缓冲液，得到纯化的目的蛋白；
6)回收保存：柱子用500 μL的PBS缓冲液清洗一遍；Protein G琼脂糖珠子置于20%乙醇溶液中4℃保存。
五、融合蛋白的鉴定
纯化后的蛋白，使用SDS-PAGE胶电泳2h，再通过考马斯亮蓝标准染色法观察蛋白纯度。
实施例2
关于实施例1提供的干扰素融合蛋白抑制流感病毒复制的验证
一、IFNα4融合蛋白抑制流感病毒H1N1（CA04、PR8）和H9N2的复制
肺上皮细胞系A549来源于人非小细胞肺癌上皮细胞，是用于研究流感病毒感染的主要细胞模型，为了验证IFNα4对不同亚型流感病毒感染的作用，本实施例采用在12孔板铺板A549，使用1mL浓度为5nM的实施例1制备的IFNα4融合蛋白在CO2细胞培养箱中培养24h，吸去培养基后使用PBS清洗细胞一次，加入400 µL含流感病毒的DMEM 处理2h，平均每个细胞感染病毒的颗粒数（MOI）为0.01。2h后，吸掉含病毒的培养基，加入1ml含2% FBS的DMEM继续培养细胞24h后收细胞，通过蛋白免疫印迹法分析流感病毒核蛋白NP的表达。所用一抗分别为anti-NP-rabbit（义翘神州，11675-T62，1：5000），anti-GAPDH-rabbit（CST，2118，1：1000）；二抗为anti-rabbit-HRP（CST，7074，1:4000）。
结果显示，与病毒对照相比，IFNα4能明显抑制流感病毒CA04、PR8和H9N2核蛋白NP的复制（图2-图4），显示了广谱抗流感病毒的效果。
二、IFNα4和IFNα2对小鼠抗PR8流感病毒感染效果
为了观察IFNα4和IFNα2对小鼠抗PR8流感病毒感染的效果，本实施例采用8周、体质量为18.2g~19.8g的雌性C57 BL/6J小鼠提前使用IFNα4或IFNα2（实验组）对小鼠滴鼻（1%的戊巴比妥麻醉小鼠后），实施例1制备的IFNα4融合蛋白或IFNα2使用量为0.001 nmol /30 µL/只，对照组为相同体积（30 µL）的溶剂PBS。IFNα4、IFNα2或PBS滴鼻6h后，再次使用1%的戊巴比妥麻醉小鼠，用100 TCID50 /50 ul的PR8对小鼠滴鼻，每天记录小鼠体重持续14天。
结果如图5所示，与PBS组相比，IFNα4和IFNα2均能保护小鼠抗PR8流感病毒感染；实验组间比较，IFNα4保护小鼠抗PR8流感病毒感染的效果强于IFNα2组。
三、IFN-a4和IFN-a2保护小鼠感染后的HE病理结果
为了观察IFN-a4和IFN-a2保护小鼠感染后的肺部病变情况，将本实施例第二种情况（IFNα4和IFNα2对小鼠抗PR8流感病毒感染效果）中14天后存活的IFN-a4和IFN-a2处理组的小鼠处死摘取相同部位的肺叶，用于HE染色然后观察病理结果。结果如图6所示，IFN-a4处理组小鼠肺部炎症侵润细胞基本消失，未见明显的肺实质化，证明IFN-a4处理小鼠愈后效果优于IFN-a2处理组。
实施例3
关于实施例1提供的干扰素融合蛋白抑制冠状病毒感染的验证
人肝癌细胞株Huh7能弱表达ACE2，为了提高pSARS-CoV-2对Huh7的感染效率，使用慢病毒载体对Huh7细胞系稳定转染hACE2，构建了Huh7-ACE2细胞系。
为了验证IFNα4是否具有良好的抑制pSARS-CoV-2的感染效果，将Huh7-ACE2细胞按104个细胞/孔铺板于96孔黑板，并使用100 µL的含5nM的实施例1制备的IFNα4融合蛋白的完全培养基处理细胞，于CO2培养箱培养24h。培养24h后吸去培养基，加入100 µL含100TCID50的pSARS-CoV-2的完全培养基继续培养24h。培养完成后，吸去培养上清，使用PBS清洗细胞一次，加入20 µL细胞裂解液于冰上孵育10min，然后使用96孔平板振荡器震荡裂解细胞10min，再加入100 µL萤火虫荧光素检测试剂，并马上置于化学发光酶标仪上检测读值。
结果如图7-图8所示，与对照组相比，IFNα4处理组的Luciferase相对活性显著低于对照组，表明IFNα4能够显著抑制pSARS-CoV-2感染Huh7-ACE2细胞。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
                         序列表
<110>  四川省人民医院
<120>  干扰素在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用
<160>  4
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  189
<212>  PRT
<213>  人工序列(1)
<400>  1
Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr
1               5                   10                  15
Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
            20                  25                  30
Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser
        35                  40                  45
His Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu
    50                  55                  60
Glu Phe Asp Gly His Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu
65                  70                  75                  80
His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser
                85                  90                  95
Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly
        115                 120                 125
Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
    130                 135                 140
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser
145                 150                 155                 160
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Arg Leu Arg Arg Lys Asp
            180                 185
<210>  2
<211>  570
<212>  DNA
<213>  人工序列(2)
<400>  2
atggccctgt ccttttcttt actgatggcc gtgctggtgc tcagctacaa atccatctgt  60
tctctgggct gtgatctgcc tcagacccac agcctgggta ataggagggc cttgatactc 120
ctggcacaaa tgggaagaat ctctcatttc tcctgcctga aggacagaca tgatttcgga 180
ttccccgagg aggagtttga tggccaccag ttccagaagg ctcaagccat ctctgtcctc 240
catgagatga tccagcagac cttcaatctc ttcagcacag aggactcatc tgctgcttgg 300
gaacagagcc tcctagaaaa attttccact gaactttacc agcaactgaa tgacctggaa 360
gcatgtgtga tacaggaggt tggggtggaa gagactcccc tgatgaatga ggactccatc 420
ctggctgtga ggaaatactt ccaaagaatc actctttatc taacagagaa gaaatacagc 480
ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa atcatgagat ccctctcgtt ttcaacaaac 540
ttgcaaaaaa gattaaggag gaaggattga                                  570
<210>  3
<211>  398
<212>  PRT
<213>  人工序列(3)
<400>  3
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile
1               5                   10                  15
Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
            20                  25                  30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Glu Glu Glu Phe Asp Gly His Gln Phe
        35                  40                  45
Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
    50                  55                  60
Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
                85                  90                  95
Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
            100                 105                 110
Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
        115                 120                 125
Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
    130                 135                 140
Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys
145                 150                 155                 160
Arg Leu Arg Arg Lys Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
                165                 170                 175
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
            180                 185                 190
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
        195                 200                 205
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
    210                 215                 220
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
225                 230                 235                 240
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
                245                 250                 255
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
            260                 265                 270
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
        275                 280                 285
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
    290                 295                 300
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
305                 310                 315                 320
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
                325                 330                 335
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
            340                 345                 350
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
        355                 360                 365
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
    370                 375                 380
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385                 390                 395
<210>  4
<211>  1197
<212>  DNA
<213>  人工序列(4)
<400>  4
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg  60
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggct gtgatctgcc tcagacccac 720
agcctgggta ataggagggc cttgatactc ctggcacaaa tgggaagaat ctctcatttc 780
tcctgcctga aggacagaca tgatttcgga ttccccgagg aggagtttga tggccaccag 840
ttccagaagg ctcaagccat ctctgtcctc catgagatga tccagcagac cttcaatctc 900
ttcagcacag aggactcatc tgctgcttgg gaacagagcc tcctagaaaa attttccact 960
gaactttacc agcaactgaa tgacctggaa gcatgtgtga tacaggaggt tggggtggaa 1020
gagactcccc tgatgaatga ggactccatc ctggctgtga ggaaatactt ccaaagaatc 1080
actctttatc taacagagaa gaaatacagc ccttgtgcct gggaggttgt cagagcagaa 1140
atcatgagat ccctctcgtt ttcaacaaac ttgcaaaaaa gattaaggag gaaggat    1197

Claims (5)

1.干扰素融合蛋白在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述干扰素为人源IFN-a4，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的干扰素融合蛋白在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述流感病毒为H1N1、H9N2、PR8、H7N9和H5N6。
3.根据权利要求1所述的干扰素融合蛋白在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述冠状病毒为Wuhan hu-1、Delta和Omicron SARS-CoV-2。
4.根据权利要求1所述的干扰素融合蛋白在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，其特征在于，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求1所述的干扰素融合蛋白在制备抗广谱流感病毒和冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述干扰素融合蛋白由以下方法制得：
在IFN-a4蛋白N端连上IgG FC片段，通过IgG磁珠进行纯化获得融合蛋白。
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