CN113667005A - 太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水产动物疾病预防治疗技术领域，特别涉及太平洋鳕干扰素‑γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用。该太平洋鳕干扰素‑γ蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示；或者蛋白的序列为SEQ ID NO：1所示序列同源性达80％以上的序列。本发明重组酵母工程菌可作为鱼类饲料添加剂，通过食物链的方式将目的蛋白传递到仔稚鱼体内，显著提高太平洋鳕IFN‑γ的半衰期，降低了干扰素制备及纯化成本，具有广谱的抗病毒及免疫增强作用，该用药方法及功能蛋白的开发在水产养殖中应用前景广阔。

Description

太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及 其应用

技术领域

本发明涉及水产动物疾病预防治疗技术领域，特别涉及太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用。

背景技术

随着水产养殖业的快速发展，养殖期间的疾病预防治疗亦变得愈加重要。盲目使用抗生素及化学合成药物不但防治效果差，而且会导致一系列的不良后果。目前越来越多的学者开始从免疫学角度开展水产养殖的病害防治研究，即通过服用免疫添加剂来提高养殖鱼类的免疫机能，从而提高其抗病能力。

干扰素(Interferon，IFN)是一类能够诱导细胞产生抗病毒状态的细胞因子，具有调节机体免疫功能、抗病毒、抗肿瘤等多种作用，是机体防御系统的重要组成部分。但是干扰素在临床应用中存在血清半衰期短、机体内容易发生降解、成本高等问题。目前鱼类养殖业使用干扰素防治疾病发生的方法主要有三种，即注射、浸浴和口服。不同防治方法疗效差别较大，注射免疫方式能够使鱼类获得较好的免疫保护，而口服和浸浴两种免疫方式几乎不能显示出免疫保护效果。然而在养殖过程中实施注射免疫过于耗时耗力，即便口服和浸浴两种方式也需要巨量的干扰素。这些难题很大程度上限制了干扰素在水产养殖中的应用，所以如何降低干扰素在鱼类消化吸收过程中的损耗，提高干扰素生物学活性，降低制备成本对养殖鱼类病害防治具有十分重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用。该重组酵母工程菌可作为鱼类饲料添加剂，通过食物链的方式将目的蛋白传递到仔稚鱼体内，显著降低了干扰素制备及纯化成本，具有广谱的抗病毒及免疫增强作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种太平洋鳕干扰素-γ蛋白，该蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示；

或者蛋白的序列为SEQ ID NO：1所示序列同源性达80％以上的序列。

本发明该提供了编码上述太平洋鳕干扰素-γ蛋白的基因。

作为优选，太平洋鳕干扰素-γ基因的序列如SEQ ID NO：2所示；或者基因的序列为SEQ ID NO：2所示序列同源性达80％以上的序列。

本发明还提供扩增上述基因的引物序列，上游引物如SEQ ID NO：3所示，下游引物如SEQ ID NO：4所示。

本发明该提供了一种重组质粒，重组质粒包含上述太平洋鳕干扰素-γ基因。

作为优选，重组质粒的载体为pGAPZ-A表达载体。

本发明该提供了一种重组酵母工程菌，重组酵母工程菌包含上述重组质粒。

作为优选，重组酵母工程菌的宿主菌为毕赤酵母。

酵母菌在水产养殖中可作为饵料添加剂使用，可增加养殖鱼类的免疫能力。毕赤酵母表达系统作为真核表达系统之一，其对蛋白的表达后期修饰和空间的正确折叠比较适中。再者，毕赤酵母本身是一种益生菌，生物安全性好，生物背景清晰。本发明使用同源重组的方法将含有太平洋鳕IFN-γ基因的pGAPZ-A载体重组至毕赤酵母基因组中。将该酵母作为饲料添加剂加入到鱼饲料中，减少了干扰素在投喂和鱼类吸收过程中的损耗，使鱼类获得抗病毒能力，增强其免疫保护效果。

在本发明提供的具体实施例中，重组酵母工程菌的宿主菌为毕赤酵母GS115。

本发明该提供了上述重组酵母工程菌的制备方法，包括如下步骤：

将上述太平洋鳕干扰素-γ基因插入表达载体，得到重组质粒；将重组质粒转入宿主菌中，通过抗生素筛选得到重组酵母工程菌。

在本发明提供的具体实施例中，抗生素为博来霉素。

本发明该提供了上述重组酵母工程菌的发酵方法，以葡萄糖为唯一碳源和能源的培养基发酵培养重组酵母工程菌。

本发明该提供了上述太平洋鳕干扰素-γ蛋白或者重组酵母工程菌在制备提高水产动物抗病毒能力的饵料添加剂或饲料中的应用。

本发明该提供了一种水产动物饵料添加剂，包括本发明的太平洋鳕干扰素-γ蛋白或者重组酵母工程菌。

本发明该提供了一种水产动物饲料，包括本发明的太平洋鳕干扰素-γ蛋白或者重组酵母工程菌。

在本发明中，重组酵母工程菌通过食物链传递的方式用于水产动物中。

本发明提供了太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用。该太平洋鳕干扰素-γ蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示；或者蛋白的序列为SEQ ID NO：1所示序列同源性达80％以上的序列。本发明具有如下技术效果：

本发明所述重组酵母工程菌可作为鱼类饲料添加剂，通过食物链的方式将目的蛋白传递到仔稚鱼体内，降低了干扰素制备及纯化成本，具有广谱的抗病毒及免疫增强作用，该用药方法及功能蛋白的开发在水产养殖中应用前景广阔。

附图说明

图1 pGAPZA-IFN-γ载体构建示意图；

图2病毒噬斑抑制实验；其中，对照组(-)为未加病毒、未加GmIFN-γ处理样品，对照组(+)为未加GmIFN-γ处理样品；显微镜放大倍数：40×；

图3重组GmIFN-γ诱导EPC细胞MICA基因表达；差异性分析：a与a之间差异不显著，a与b之间差异显著；

图4 GmIFN--γ对斑马鱼IFN相关基因表达水平影响；内参基因：斑马鱼β-actin；使用SPSS进行差异显著性分析显示各基因P<0.05。

具体实施方式

本发明公开了太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的重组毕赤酵母是用太平洋鳕干扰素γ基因插入到酵母表达载体pGAPZ-A的多克隆位点区，利用同源重组的方法将表达基因重组进酵母基因组中，培养重组酵母，得到相关菌体。

本发明太平洋鳕干扰素γ融合蛋白的制备方法包括以下具体步骤：

1、基因扩增与质粒构建：根据太平洋鳕干扰素γ基因设计引物，PCR扩增获得干扰素基因开放阅读框，去除信号肽部分以及终止密码子，在N端引入EcoRI酶切位点基因，构建太平洋鳕干扰素γ融合蛋白重组表达载体质粒；

2、酵母转化与诱导培养：用同源重组法将BspH1酶切线性化的重组表达载体转化入酵母真菌GS115或其他毕赤酵母真菌基因组中，以博来霉素为抗生素的平板培养基(YPDZ)筛选阳性菌株，以葡萄糖为唯一碳源和能源的液体培养基(YPD)发酵培养重组酵母表达融合蛋白；

本发明的酵母重组菌的种子培养液在YPD培养基中发酵72h以获得大量重组酵母菌，发酵过程中以葡萄糖为补料培养基。收集菌体与鱼饲料搅拌混匀，投喂。

3、蛋白纯化与活性检测：表达蛋白产物经SDS-PAGE电泳分析，经细破碎提取、透析浓缩、亲和层析、脱盐层析纯化，采用投喂斑马鱼后相关基因表达检测的方法检测干扰素γ蛋白的生物学活性。

本发明获得的太平洋鳕干扰素γ长效融合蛋白制剂以酵母表达制备融合蛋白，蛋白纯化工艺简便，生产成本低，更有利于融合干扰素的推广和应用。

本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1太平洋鳕IFN-γ的制备

本实施例以IFN-γ进行重组太平洋鳕IFN-γ融合蛋白表达载体的构建。

太平洋鳕IFN-γ表达载体的制备步骤：

1、参照太平洋鳕IFN-γ基因序列信息及酵母表达载体pGAPZA物理图谱设计引物并引入酶切位点，其间去除干扰素信号肽、起始密码子及终止密码子。太平洋鳕IFN-γ融合蛋白序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ ID NO：2所示。

太平洋鳕IFN-γ蛋白序列：

Met Ala Leu Ala Leu Gly Arg Cys Leu Ser Leu Phe Met Leu Val Cys MetSer Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Pro Val Ala Pro Val Pro Gly Lys Met Leu GluThr Val Lys Thr Leu Ser Leu Gln His Pro Gln Lys Gly Gln Ser Phe Ser Gly SerVal Phe Ser Arg Glu Thr Leu Asn Lys Met Asp Asp Gly Asp Lys Arg Val Val LeuGly Lys Val Leu Glu Val Tyr Asp Lys Leu Phe Asp Gln Met Leu Ser Gln Pro ProThr Asp Ser Gln Ser Glu Glu Asn Lys Thr Glu Glu Ala Gly Ile Arg Tyr Leu GlnGlu Met Val Thr Leu Leu Arg Arg Thr Gln Tyr Lys Lys His Leu Leu Leu Thr SerThr Leu Glu Gln Leu Gly Asn Ile Gln Ile Asn Asn Ser Val Val Gln Ser Lys AlaLeu Trp Glu Leu Pro Trp Leu Phe Asn Glu Ala Ser Ser Leu Ala Glu Arg Lys ArgArg Ser Leu Arg Arg Arg Arg Ala Pro Arg Lys Arg Ala Ala Lys Phe Arg Arg AlaMet

太平洋鳕IFN-γ基因序列：

atggcactgg cgctggggag atgtctatcg ctcttcatgt tggtctgcat gtctgtttgtctgtcagtct gtctgccagt ggctcccgtt ccgggaaaga tgttggaaac cgtcaagact ctaagcctacaacatccaca gaaaggccag tcgttcagcg ggtccgtctt ctccagagaa acactcaaca agatggatgatggagataag agggttgtgc ttgggaaggt gttggaggtt tacgacaagc tgtttgatca gatgttgagtcagccgccaa ccgacagcca atcagaggag aataaaacag aggaagctgg gatccggtac ctccaggagatggttacact gctgaggaga acccagtaca agaaacacct gctgctcacc agcacactgg agcaactgggcaacatacag atcaataact ctgtagtgca gagcaaggca ttgtgggagc tgccttggct gttcaacgaagcaagctcat tggccgagag gaagaggagg agcctacgac gccgacgggc gcccaggaag agggccgctaaatttaggag ggctatgtga

太平洋鳕IFN-γ引物：

上游：5’-CGGAATTCATGCTGCCAGTGGCTCCCGTTC-3’，其中5’下划线为EcoRI酶切位点序列。

下游：5’-CCGCTCGAGGTCATAGCCCTCCTAAATTTAG-3’，其中5’下划线为XhoI酶切位点序列。

2、利用上述引物进行PCR反应

太平洋鳕干扰素γ基因PCR体系：PCR superMix 10μL，上下游引物各1μL，模板1μL，双蒸水补足20μL。

PCR反应条件为太平洋鳕干扰素γPCR反应通用条件：95℃5min；95℃30s；60℃30s；72℃30s，35个循环后于72℃延伸10min。

3、将PCR产物回收纯化后，插入到pMD-18T载体，酶切鉴定及测序。将该序列产物插入到经EcoRI、XhoI双酶切的pGAPZA载体中，制备太平洋鳕IFN-γ重组蛋白酵母表达载体pGAPZA-GmIFN-γ，酶切和测序鉴定后，用BspH1线性化两种表达载体，采用同源重组法分别转化入毕赤酵母GS115中，博来霉素梯度抗性筛选，得到高效表达的优势表达菌株。

4、以葡萄糖为唯一碳源和能源的培养基(YPD)发酵培养重组酵母。表达太平洋鳕IFN-γ胞内蛋白。

培养基：

YPDZ：2％Peptone,1％Yeast extract,2％葡萄糖,2％琼脂，100μg/ml Zeocin。

YPD：2％Peptone,1％Yeast extract,2％葡萄糖,100μg/ml Zeocin。

发酵条件：

取500μL待表达菌液加入到50mL YPD培养基中，30℃，200rpm摇床培养至OD值为1.0左右(约40h)。随后用离心管转移菌体，加入100mL YPD培养基，30℃，200rpm摇床培养，每24h补充2％葡萄糖。

纯化方法：

称量酵母菌体，每50mg菌体加入500μL提取试剂(0.1M Tris-HCl(pH7.5)，0.2M氯化钠，0.01Mβ-巯基乙醇，20％甘油，5mM EDTA，1mM PMSF，2mM DTT)用移液枪反复吹打均匀；将样品置于脱色摇床上室温280rpm振荡20min；12000rpm离心15min，收集细胞碎片，将上清转移至新的洁净的离心管中，活性蛋白位于上清中。

试验例1功能验证

1、细胞噬斑抑制实验：

为验证重组GmIFN-γ抗病毒能力，将纯化GmIFN-γ蛋白进行鲤春病毒血症病毒噬班抑制实验。在24孔板中加入1mL 5×10⁵个/mL细胞的MEM培养基。于25℃培养EPC细胞15h至细胞生长成单层。实验设置阴性对照组，阳性对照组，GmIFN-γ(真核表达)组，和GmIFN-γ(原核表达)组，其中阴性对照不加蛋白处理，不接种病毒；阳性对照组不加蛋白处理，接种病毒；GmIFN--γ(真核)组添加GmIFN--γ酵母表达产物处理，接种病毒；GmIFN-γ(原核)组添加GmIFN-γ大肠杆菌表达产物处理，接种病毒；每组设置3组平行实验。将纯化后的蛋白稀释至100μg/mL，每孔加入100μL继续培养细胞24h。将15-20000MW的PEG(聚乙二醇)溶MEM-5T中至终浓度为7％，并用磁力搅拌器搅拌均匀。每孔加入200μL PEG，于细胞间恒温水浴摇床孵育10min。将100μL鲤春病毒血症病毒(SVCV)(滴度为2.73×10⁷PFU/mL)样品接种至经PEG处理的单层细胞上。室温摇床吸附30min。每孔加入1mL甲基纤维素覆盖层，将24孔板置于20℃恒温培养箱中培养4-5d，结晶紫溶液染色观察蚀斑形成情况。

实验结果如图2显示：GmIFN-γ处理后样品经过病毒侵蚀后形成的噬斑明显减少。

2、免疫基因调节实验：

实验设计对照、酵母、BL21三组实验，每组设置3个平行，其中酵母组添加GmIFN-γ酵母表达产物，BL21组添加GmIFN-γ大肠杆菌表达产物处理。采用常规方法培养EPC细胞质至单层。每孔添加100μL经过滤除菌的GmIFN-γ重组蛋白纯化产物(PBS稀释至100μg/mL)，共培养24h后进行RNA提取及qPCR分析MHCⅠ类相关基因表达情况。MIC基因主要是参与人体免疫系统构建和恢复。MICA基因是MIC基因座位成员基因之一。

实验结果见图3。结果显示，酵母组GmIFN-γ可显著诱导EPC细胞MICA基因表达。

3、重组GmIFN-γ酵母菌投喂实验：

为进一步验证重组GSpG-GmIFN-γ酵母菌体对鱼类抗病毒及免疫调节作用，将暂养5天后的斑马鱼进行重组GmIFN-γ酵母菌投喂实验。实验分为空白对照及实验组两组，将斑马鱼随机分为两组，每组25尾，分别饲养于57×39×31cm水箱中，对照组按照正常养殖每天投喂1g市售斑马鱼饲料和1gGS115酵母菌体，实验组每天投喂1g GSpG-GmIFN-γ酵母菌体和1g市售斑马鱼饲料。连续投喂5天，每天随机取3尾斑马鱼进行解剖，取斑马鱼内脏进行RNA提取及qPCR分析。斑马鱼喂养GSpG-GmIFN-γ酵母菌不同时间后检测斑马鱼内脏团IFN相关基因mRNA表达情况。

图4结果表明：分析显示在投喂1-5天后Mx、IRF1、IRF7、PKR基因均有不同程度的上调，投喂5天时IRF7、IFN--γR1基因表达上调幅度较大，而IRF7、PKR及Mx基因上调幅度较小。另外斑马鱼内源性IFN--γ1和IFN--γR1表达也有明显的表达上调，尤其是IFN-γR1基因的表达水平上调较高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南热带海洋学院

<120> 太平洋鳕干扰素-γ蛋白、基因、重组质粒、重组酵母工程菌及其应用

<130> MP21018561

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 189

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Ala Leu Gly Arg Cys Leu Ser Leu Phe Met Leu Val Cys

1 5 10 15

Met Ser Val Cys Leu Ser Val Cys Leu Pro Val Ala Pro Val Pro Gly

20 25 30

Lys Met Leu Glu Thr Val Lys Thr Leu Ser Leu Gln His Pro Gln Lys

35 40 45

Gly Gln Ser Phe Ser Gly Ser Val Phe Ser Arg Glu Thr Leu Asn Lys

50 55 60

Met Asp Asp Gly Asp Lys Arg Val Val Leu Gly Lys Val Leu Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Lys Leu Phe Asp Gln Met Leu Ser Gln Pro Pro Thr Asp Ser

85 90 95

Gln Ser Glu Glu Asn Lys Thr Glu Glu Ala Gly Ile Arg Tyr Leu Gln

100 105 110

Glu Met Val Thr Leu Leu Arg Arg Thr Gln Tyr Lys Lys His Leu Leu

115 120 125

Leu Thr Ser Thr Leu Glu Gln Leu Gly Asn Ile Gln Ile Asn Asn Ser

130 135 140

Val Val Gln Ser Lys Ala Leu Trp Glu Leu Pro Trp Leu Phe Asn Glu

145 150 155 160

Ala Ser Ser Leu Ala Glu Arg Lys Arg Arg Ser Leu Arg Arg Arg Arg

165 170 175

Ala Pro Arg Lys Arg Ala Ala Lys Phe Arg Arg Ala Met

180 185

<210> 2

<211> 570

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcactgg cgctggggag atgtctatcg ctcttcatgt tggtctgcat gtctgtttgt 60

ctgtcagtct gtctgccagt ggctcccgtt ccgggaaaga tgttggaaac cgtcaagact 120

ctaagcctac aacatccaca gaaaggccag tcgttcagcg ggtccgtctt ctccagagaa 180

acactcaaca agatggatga tggagataag agggttgtgc ttgggaaggt gttggaggtt 240

tacgacaagc tgtttgatca gatgttgagt cagccgccaa ccgacagcca atcagaggag 300

aataaaacag aggaagctgg gatccggtac ctccaggaga tggttacact gctgaggaga 360

acccagtaca agaaacacct gctgctcacc agcacactgg agcaactggg caacatacag 420

atcaataact ctgtagtgca gagcaaggca ttgtgggagc tgccttggct gttcaacgaa 480

gcaagctcat tggccgagag gaagaggagg agcctacgac gccgacgggc gcccaggaag 540

agggccgcta aatttaggag ggctatgtga 570

Claims (12)

1.一种太平洋鳕干扰素-γ蛋白，其特征在于，所述蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示；

或者所述蛋白的序列为SEQ ID NO：1所示序列同源性达80％以上的序列。

2.编码权利要求1所述太平洋鳕干扰素-γ蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO：2所示；

或者所述基因的序列为SEQ ID NO：2所示序列同源性达80％以上的序列。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求2或3所述的基因。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pGAPZ-A表达载体。

6.一种重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌包含权利要求4或5所述的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的重组酵母工程菌，其特征在于，所述重组酵母工程菌的宿主菌为毕赤酵母。

8.权利要求6或7所述重组酵母工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求2或3所述基因插入表达载体，得到重组质粒；将重组质粒转入宿主菌中，通过抗生素筛选得到重组酵母工程菌。

9.权利要求6或7所述重组酵母工程菌的发酵方法，其特征在于，以葡萄糖为唯一碳源和能源的培养基发酵培养重组酵母工程菌。

10.权利要求1所述太平洋鳕干扰素-γ蛋白或者权利要求6-7中任一项所述重组酵母工程菌在制备提高水产动物抗病毒能力的饵料添加剂或饲料中的应用。

11.一种水产动物饵料添加剂，其特征在于，包括权利要求1所述太平洋鳕干扰素-γ蛋白或者权利要求6-7中任一项所述重组酵母工程菌。

12.一种水产动物饲料，其特征在于，包括权利要求1所述太平洋鳕干扰素-γ蛋白或者权利要求6-7中任一项所述重组酵母工程菌。

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