CN114891087B

CN114891087B - 草鱼干扰素、草鱼干扰素突变体及其应用和产品

Info

Publication number: CN114891087B
Application number: CN202210466001.XA
Authority: CN
Inventors: 胡向东; 邵健忠; 项黎新; 胡伟卿
Original assignee: Zhejiang Crown Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Crown Technology Co ltd
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114891087A

Abstract

本发明提供了一种草鱼干扰素、草鱼干扰素突变体及其应用和产品，涉及生物技术领域。本发明提供的草鱼干扰素，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。经发明人研究发现，本发明提供的草鱼干扰素安全高效，对于草鱼出血病病毒(GCHV)和草鱼小RNA病毒(GCPV)具有较强的抗病毒活性，能够用于抗水产动物病毒产品的制备中。本发明提供的草鱼干扰素突变体安全高效，相较于草鱼干扰素，对于草鱼出血病病毒和草鱼小RNA病毒具有更强的抗病毒活性，能够用于抗水产动物病毒产品的制备中。

Description

草鱼干扰素、草鱼干扰素突变体及其应用和产品

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种草鱼干扰素、草鱼干扰素突变体及其应用和产品。

背景技术

抗生素药物、各种杀虫剂化合物和类激素产品等使用，在提高畜、水产品数量上的确发挥了重要作用，但同时也为食品安全、生态平衡埋下了一颗定时炸弹。全民安全意识的普遍增强使传统饲料添加剂的推广应用面临挑战，为新技术产品的研发提供了良好的时机。

早在十几年前，医学专家就大声疾呼：滥用抗生素已成为危害民众健康的隐形杀手，如果长期以往，普通百姓将会陷入无药可治的绝境。对此，我国也认识到后果的严重性，所以已将抗生素药物被列为处方药物，严加管理。但是除了医生的处方药以外，一些地方的养殖业仍旧滥用抗生素，导致食物中的抗生素残留转移到人体中，使百姓不知不觉深受其害，影响经济发展和社会稳定。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种草鱼干扰素，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种草鱼干扰素突变体，以解决上述问题中的至少一种。

本发明的第三目的在于提供一种编码上述草鱼干扰素或者草鱼干扰素突变体的基因。

本发明的第四目的在于提供一种重组质粒。

本发明的第五目的在于提供一种基因工程菌。

本发明的第六目的在于提供上述草鱼干扰素、基因、重组质粒或者基因工程菌在制备抗水产动物病毒产品中的应用。

本发明的第七目的在于提供一种饲料添加剂。

第一方面，本发明提供了一种草鱼干扰素，所述草鱼干扰素的氨基酸序列如SEQID NO.1 所示。

第二方面，本发明提供了一种草鱼干扰素突变体，所述草鱼干扰素突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明提供了一种基因，所述基因编码上述草鱼干扰素或草鱼干扰素突变体。

作为进一步技术方案，所述基因具有如SEQ ID NO.3所示的序列或具有如SEQ IDNO.4所示的序列。

第四方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述基因。

作为进一步技术方案，所述载体包括pYES2质粒。

第五方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒。

作为进一步技术方案，所述基因工程菌包括酵母菌。

第六方面，本发明提供了一种草鱼干扰素、草鱼干扰素突变体、基因、重组质粒或者基因工程菌在制备抗水产动物病毒产品中的应用；

优选地，所述水产动物病毒包括草鱼出血病病毒和草鱼小RNA病毒中的至少一种。

第七方面，本发明提供了一种饲料添加剂，包括上述基因工程菌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

经发明人研究发现，本发明提供的草鱼干扰素安全高效，对于草鱼出血病病毒(GCHV)和草鱼小RNA病毒(GCPV)具有较强的抗病毒活性，能够用于抗水产动物病毒产品的制备中。

本发明提供的草鱼干扰素突变体安全高效，相较于草鱼干扰素，对于草鱼出血病病毒和草鱼小 RNA病毒具有更强的抗病毒活性，能够用于抗水产动物病毒产品的制备中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的技术路线图；

图2为草鱼IFN基因的核苷酸及氨基酸序列；

图3为九个物种的IFN同源基因氨基酸序列比对；

图4为草鱼干扰素与已知的哺乳类、鸟类、鱼类IFN-α,-β,-δ,-ω,和-τ之间的进化树分析图；

图5为RT-PCR结果图；

图6为酵母胞内表达载体IFN-pYES2的构建；

图7为目的基因的菌落PCR鉴定图；

图8为质粒IFN－pYES2经HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定图；

图9为目的基因的菌落PCR鉴定图；

图10为酵母中提取的质粒IFN－pYES2经HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定图；

图11为pYES2－IFN/INVSC1诱导表达的SDS－PAGE分析。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

第一方面，本发明提供了一种草鱼干扰素，所述草鱼干扰素的氨基酸序列如SEQID NO.1 所示：

MKTQMWTYMFVMFLTLQGQCSACEWLGRYRMISNESLSLLKEMGGKYPEGTKVSFPGRL YNMIDNAKVEDQVKFLVLTLDHIIRLMDAREHMNSVQWNLQTVEHFLTVLNRQSSDLKECVARYQPSHKESYEKKINRHFKILKKNLKKKEYSAQAWEQIRRAVKHHLQRMDIIASIANRR(SEQ ID NO.1)。

经发明人研究发现，本发明提供的草鱼干扰素安全高效，对于草鱼出血病病毒和草鱼小RNA病毒具有较强的抗病毒活性，能够用于抗水产动物病毒产品的制备中。

第二方面，本发明提供了一种草鱼干扰素突变体，所述草鱼干扰素突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MKTQMWTYMFVMFLTLQGQCSACEWLGRYRMISNESLSLLKEMGGKYPEGTKVSFPGRL YNMIDNAKVEDQVKFLVLTLDHIIRLMDAREHMNCVQWNLQTVEHFLTVLNRQSSDLKECVARY QPSHKESFEKKINRHFKILKKNLKKKEYSAQAWEQIRRAVKHHLQRMDIIASIANRR(SEQ ID NO.2)。

该基因能够表达上述草鱼干扰素或草鱼干扰素突变体。

SEQ ID NO.3:

cagtgtagaaagctactactacctgaatacaaagatgaaaactcaaatgtggacgtatatgtttgtaatgtttttaactctgcagggtcaat gctctgcttgcgaatggctcggccgatacaggatgataagcaacgagtctttgagcctcctgaaggaaatgggtggaaaatatcctgagggtaccaaggtgtcatttccaggacgcctgtacaacatgatagacaatgccaaggtggaggaccaggtgaagtttcttgtcctgaccttagatcata tcatccgcctcatggatgccaagagcacatgaattcagtgcagtggaacctacagactgtagagcattttctaactgtcctgaacaggcagtcatctgatcttaaagaatgtgtggcccgataccagccatcacataaggagtcctacgagaaaaagataaacagacacttcaagattttaaagaag aatctaaagaaaaaagaatatagtgctcaagcatgggagcagatccggagagctgtgaaacatcaccttcagaggatggacatcatcgcaagcattgccaacagacgataagacataatgacggatgaatgacttgtgacacattccatggagtgaagaaaagttaatgtaaacaatgccttaa aagctaaaactgaatgtaacaaatatttatttacatgactgtattttatttcaactagagttgaaagttttgcctaatgtctggtgttgtaatatagagtttaccttatgtgtttcctatgaaaacttgaagtaatctgatcaagcaagctaattatgtttcttacaaaaacctgagaaaccttgtatttattttattttggt gcaaataggcctatgtgcctaaactatacccagattttttgctgaatgtgaaaaaaatgtttaaaaaaacaagcatgccatgtatttcaagtcatgtatttattaacggtcaatcaattatgttgtgatgcacatggatatgatgtatgttttgtgattgtttcagatatttattatacttaatttacttcatacattgtt gtgcacaatttttgtatctctgaatattttattctttttatatgtactgaatgcttgcgataatgatttgctctatttgcttgcaaaatatttttgtacttttaaataaaaaattgattgaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ IDNO.3)。

SEQ ID NO.4:

cagtgtagaaagctactactacctgaatacaaagatgaaaactcaaatgtggacgtatatgtttgtaatgtttttaactctgcagggtcaat gctctgcttgcgaatggctcggccgatacaggatgataagcaacgagtctttgagcctcctgaaggaaatgggtggaaaatatcctgagggtaccaaggtgtcatttccaggacgcctgtacaacatgatagacaatgccaaggtggaggaccaggtgaagtttcttgtcctgaccttagatcata tcatccgcctcatggatgccaagagcacatgaattgtgtgcagtggaacctacagactgtagagcattttctaactgtcctgaacaggcagtcatctgatcttaaagaatgtgtggcccgataccagccatcacataaggagtcctttgagaaaaagataaacagacacttcaagattttaaagaaga atctaaagaaaaaagaatatagtgctcaagcatgggagcagatccggagagctgtgaaacatcaccttcagaggatggacatcatcgcaagcattgccaacagacgataagacataatgacggatgaatgacttgtgacacattccatggagtgaagaaaagttaatgtaaacaatgccttaaa agctaaaactgaatgtaacaaatatttatttacatgactgtattttatttcaactagagttgaaagttttgcctaatgtctggtgttgtaatatagagtttaccttatgtgtttcctatgaaaacttgaagtaatctgatcaagcaagctaattatgtttcttacaaaaacctgagaaaccttgtatttattttattttggt gcaaataggcctatgtgcctaaactatacccagattttttgctgaatgtgaaaaaaatgtttaaaaaaacaagcatgccatgtatttcaagtcatgtatttattaacggtcaatcaattatgttgtgatgcacatggatatgatgtatgttttgtgattgtttcagatatttattatacttaatttacttcatacattgtt gtgcacaatttttgtatctctgaatattttattctttttatatgtactgaatgcttgcgataatgatttgctctatttgcttgcaaaatatttttgtacttttaaataaaaaattgattgaaaaaaaaaaaaaaaaa(SEQ IDNO.4)。

第四方面，本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括载体和上述基因。其中载体包括但不限于pYES2质粒，或者本领域技术人员所熟知的其他载体。

第五方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌含有上述重组质粒。本发明中，基因工程菌优选为酵母菌。酵母表达系统表达外源基因的优点有很多，如酵母培养条件普通，生长繁殖迅速，用于表达基因工程产品时，工艺简单，能够耐受较高的流体静压，可以大规模生产，有效降低生产成本。酵母菌不会产生毒素，安全可靠，酿酒酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，特别适合于表达真核生物基因，这有利于保持生物产品的活性和稳定性。

第六方面，本发明提供了一种草鱼干扰素、草鱼干扰素突变体、基因、重组质粒或者基因工程菌在制备抗水产动物病毒产品中的应用。

本发明提供的草鱼干扰素安全，对于草鱼出血病病毒(GCHV)和草鱼小RNA病毒(GCPV) 具有较强的抗病毒活性，而基因、重组质粒或者基因工程菌能够表达草鱼干扰素，因此也能够用于抗水产动物病毒产品的制备。

在一些优选的实施方式中，所述水产动物病毒包括但不限于草鱼出血病病毒和草鱼小RNA病毒。

由于该饲料添加剂包括上述基因工程菌，因此，该饲料添加剂具备该基因工程菌全部功能，具有抗病毒活性，能够用于抗水产动物病毒产品的制备，例如制备具有抗病毒作用的饲料等。

此外，本发明饲料添加剂的推广应用，从源头上保证食品安全和人体健康，这对防止畜、禽、水产品药物残留方面起有决定性作用。也对我国饲料工业、食品工业往无公害环保型结构调整，解决畜、水产品药物残留和出口贸易壁垒，提高畜、水产品质量，保障人类健康和良好的生态环境具有特别重要的意义，社会经济效益好。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明的技术思路如图1所示。

实施例1草鱼干扰素基因的组织表达研究

1.实验材料

1.1实验鱼：二龄草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，体长约28cm，体重约700克，购自杭州市集贸市场，实验前饲养于25℃水族2周，确认健康后使用。

1.2干扰素诱导剂：poly I:C针剂2ml/支，购自天津药厂；诱导病毒(草鱼出血病病毒GCHV)，由本实验室保存，滴度10⁴TGC₅₀/0.1ml。

1.3主要试剂：总RNA提取：Trizol(Gibco BRL,USA)；逆转录试剂盒RNA PCR kit(AMV)Ver3.0 (TaKaRa,USA)；TaKaRa 5’-Full RACE Core Set；TaKaRa 3’-Full RACECore Set；PCR产物纯化试剂盒TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0；TA克隆试剂盒T－Vector PCR Product Cloning Kit，购自上海生工。

1.4生物信息学资源：开放阅读框分析NCBI ORF Finder；潜在功能位点分PROSITEdatabase；信号肽分析SignalP program(version 3.0)；多序列比对ClustalW(version1.83)；进化树构建：ClustalW and MEGA(version 3)。

2.实验方法

(一)IFN的诱导表达

1.poly I:C诱导：实验鱼背鳍皮下注射0.5ml poly I:C，26℃水温诱导12hr后再注射一次，12hr 后取头肾、脾脏、脑、心肌、肝脏、鳃等组织10克左右，液氮快速冷冻，保存于－80℃备用。

2.病毒诱导:实验鱼背鳍皮下注射GCHV 0.5ml，24hr后再注射一次，24hr后取草鱼头肾、脾脏、脑、心肌、肝脏、鳃等组织10克左右，液氮快速冷冻，保存于－80℃备用。

(二)草鱼组织总RNA提取

取冷冻完全的头肾和脾脏组织，置液氮碾磨成粉末状，以100mg组织加450ulbuffer的比例加 buffer R-A，迅速碾磨至buffer R-A完全融化，继续碾磨30s，将匀浆用带4～6号针头的10ml注射器反复吸注10次，吸取上清，以buffer R-A/buffer R-B/bufferR-C/buffer R-D＝8/3/9/9/13的比例，加入buffer R-E，旋涡振荡混合均匀。加4℃预冷的buffer R-B，盖紧离心管，用力上下混合均匀。加4℃ 预冷的buffer R-C，盖紧离心管，用力上下混合均匀，冰浴5min；于4℃，12000g离心5min。吸取下相溶液，转移至另一离心管中；加4℃预冷的buffer R-D，盖紧离心管，用力上下混合均匀，冰浴 5min。再于4℃，12000g离心10min将RNA沉淀于管底。倒置离心管稍用力甩弃液相和相间沉淀；简短离心，去残余液体；再加适量4℃预冷的50％乙醇，倒置弃液相；离心，去残余液体。置空气中将乙醇挥发除尽。加适量buffer TE充分溶解RNA沉淀，4℃，12000g离心2min。将上清转移到 Rnase-free的离心管，置－20℃以下保存待用。

(三)总RNA的质量检测及定量

用紫外分光光度法测定提取的总RNA的含量，RNA(ug/ul)＝0.04×OD₂₆₀值×稀释倍数。

(四)草鱼IFN基因克隆与分析

1.cDNA模板的制备

使用RT试剂盒TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0将总RNA进行逆转录以获取PCR反应的 cDNA模板。

反应体系：

反应条件：预变性94℃5min、变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃30s、循环35、在延伸 72℃8min。

2.PCR扩增

根据斑马鱼等IFN基因序列，经clastalW寻找出鱼类和人及其它物种IFN基因的保守序列。根据保守序列，设计合成三组引物分别用于扩增序列的中间段，以及3’和5’UTR。再对扩增产物测序，将测序结果进行拼接，得到草鱼的IFN基因cDNA全长序列，包括完整的开放阅读框、5’端和3’端非翻译区(UTR)。引物见表1。

第一组PCR反应：

反应体系：

反应条件：42℃～55℃15～30min；99℃5min；5℃5min。

第二组－3’RACE反应

按照TaKaRa 3’-Full RACE Core Set说明书进行。

第三组－5’RACE反应：

按照TaKaRa 5’-Full RACE Core Set说明书进行。

所用引物如下表。

3.PCR产物的检测与分析

取8ul PCR扩增产物，加2ul溴酚兰指示剂，在1.5％琼脂糖凝胶中稳压60伏电泳1小时，电泳缓冲液为TAE。电泳完毕后，用Kodak 200凝胶电泳图像分析系统(EDAS290,Eastman Kodak Company,USA)的数码相机拍摄并输入计算机。用PHOTOSHOP进行图像处理。

4.PCR产物的纯化

切下含目的DNA的琼脂糖凝胶，置于1.5ml离心管中，吸尽凝胶表面液体，在管中切碎胶块；称量胶块重量，计算胶块体积，以1mg＝1ul计算。向胶块中加入4个凝胶体积量的DR－I缓冲液；均匀混合后75℃加热，充分振荡混合6～10分钟，使胶块融化；再加入DR－I缓冲液量的1/2体积量的DR－II缓冲液，混合均匀；将Spin Column安置于Collectin Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，3600rpm离心1分钟，弃废液；将500ul的Rinse A加入Spin Column中，3600rpm离心 30秒，弃废液；将700ul的Rinse B加入Spin Column中，3600rpm离心30秒，弃废液；再将加700ul的Rinse B步骤重复一次，然后12000rpm离心1分钟。将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜中央处加入25ul的水或洗脱液，室温静止1分钟。12000rpm离心1分钟，洗脱DNA。

5、T－A克隆

5.1连接反应：在一个标准的10ul连接反应体系中，其余用水补足，通常情况下，没有必要对 PCR产物进行定量。反应按以下体系进行：

16～23℃连接过夜。

5.2转化：100ul感受态细胞，在冰上完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮；加入5ul连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟，42℃水浴热激90秒钟，将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2分钟；再加入800ul室温的LB培养液，于37℃，150rpm振荡培养1小时。4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400ul上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20ul100mM IPTG和100ul 20mg/ml X-gal涂布的平板上。平板在37℃正向放置1小时后倒置培养过夜。进行蓝白斑筛选，挑选3个白色菌斑，用牙签挑取，放入盛有添加安苄青霉素的2mlLB培养基的试管中，于37℃250rpm振摇下培养过夜。其余的菌斑可以保存，用封口膜封好平皿，置于4℃冰箱中。

5.3克隆鉴定

a.质粒DNA的小量制备

将1.5ml过夜培养物倒入微量离心管中，于4℃，10000g离心10min，吸去培养液；再将细菌沉淀重悬于100ul用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡；加200ul新配制的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管5次，以混合内容物；加200ul用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡 10秒使溶液III在粘稠的细菌裂解液中分散均匀，之后将管置于冰上3－5分钟。冰浴完成后，于4℃，12000g离心10分钟，将上清转入另一离心管；加等量酚:氯仿，振荡混匀，再于4℃，12000g离心 2分钟，将上清转入另一离心管；用2倍体积的乙醇沉淀，振荡混合，于室温放置2分钟；然后，于4℃，12000g离心5分钟；小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，尽管除壁液滴。用1ml 70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，干燥10分钟。然后，用50ul含无DNA酶的胰RNA酶(20ug/ml)的TE 溶液重新溶解沉淀，振荡均匀，贮存于-20℃。

b.酶切鉴定

对提取的DNA，取10ul，Pst1单酶切，总反应体系20ul。通过1.2％琼脂糖凝胶电泳初步判定 pUC－T中插入片段的大小与克隆前PCR产物的大小一致。

c.菌落PCR鉴定

随机挑取6个菌落于如2.2所述的PCR反应体系中，反应参数同2.2所述，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳来判定pUC－T中插入片段的大小与克隆前PCR产物的大小一致。

2.6 PCR产物序列测定

上述PCR产物经TA克隆后，采用T7启动子作为测序引物在DNA序列分析。

仪上测定序列(美国ABI377)。利用NCBI ORF Finder寻找该cDNA的开放阅读框。ORF中的潜在功能基序通过PROSITE数据库搜索。以及用SigP program(version 3.0)、ClastalW、MEGA(version 3)来进行信号肽分析、多序列比对和进化树的建立。

2.结果与讨论

2.1 GcIFN基因克隆及分析

2.1.1将中间段PCR反应、3’RACE、5’RACE产物经TA克隆后，用M13启动子作为测序引物，由英俊生物技术有限公司DNA序列分析仪测定序列，并将序列进行拼接得到一条长1191碱基IFN 类似物。用NCBI ORF Finder分析已知的IFN cDNA序列，开放阅读框ORF长543bp，编码181个氨基酸。其余5’UTR长34bp，3’UTR长614bp。经Singnal P 3.0分析，该基因具有一个长为22个氨基酸的信号肽，预示着，它的成熟肽为159个氨基酸。序列分析如图2所示，图2中划线部分为信号态，两个半胱氨酸残基用□，保守的氨基酸残基用〇，Phe56用Δ表示。细胞因子信号用横线划出，黑体部分为加尾信号。

2.2 GcIFN基因和其他物种氨基酸多序列比对

从Gene Bank中选择了八种生物IFN同源基因序列：人、小鼠、大西洋鲑鱼、鸡、斑马鱼、鲫鱼、红鳍东方豚、鲶鱼、和我们克隆到的草鱼GcIFN基因序列，用软件ClastalW进行多序列比对。比对结果显示，IFN同源基因的氨基酸序列在不同鱼类的物种中同源性较高。分析结果如图3和图4 所示，其中，图3中Mu：鼠；Hu：人；Gc：草鱼；Ga：鲫鱼；Zf：斑马鱼；Cn：鲶鱼；Ss：大西洋鲑鱼；Tf：红鳍东方豚；Gg：鸡；黑色部分为同源性高的保守区域。草鱼与斑马鱼和鲫鱼存在很高的同源性，高达90％以上。

实施例2草鱼干扰素基因的组织表达研究

1.材料与方法

1.1实验材料：

1.1.3试剂：总RNA提取：Trizol(Gibco BRL,USA)；逆转录试剂盒：RNA PCR kit(AMV)Ver3.0 (TaKaRa,USA)。

1.2实验方法：

1.2.1干扰素诱导及组织提取

将草鱼分成3组，每组4条鱼。第1组为对照组；第2组为草鱼出血病病毒诱导，诱导剂量为0.5ml病毒/尾鱼；第3组为polyI:C诱导组，诱导剂量为2ml/尾鱼(2mg)。第2组、第3组草鱼背鳍皮下注射诱导物，36小时后解剖取组织。第3组同时取肝、脾、头肾、肠、肌肉、心肌和脑七种组织，分别从4条鱼中取大小相同的组织块，放于冷冻管；每种组织取两管(一管实验用，一管备用)；用液氮迅速冷却；再于－80℃保存。

1.2.2提取总RNA

提取总RNA方法同实施例1中草鱼组织总RNA提取。

1.2.3总RNA的质量检测及定量

方法同实施例1中总RNA的质量检测及定量。

1.2.4 RT-PCR

反转录反应：逆转录体系如实施例1(四)1，反应体系如实施例1(四)2第一组PCR反应。

2.结果与讨论

总RNA质量测定及定量结果如下表。

2.组织分布表达

对提取的3组模板做RT-PCR，结果如图5所示。

图5为2组诱导组PT-PCR产物电泳图，组织依次为肝脏、脑、头肾、心肌、脾脏和鳃；图的上部分为poly I:C诱导组；下部分为草鱼出血病病毒诱导组。

3.讨论

我们从草鱼的6个成体组织包括脑、心肌、头肾、肝脏、脾脏、肠提取总RNA，通过RT-PCR 探讨草鱼干扰素基因GcIFN在这些组织中的表达情况。对照组各种组织内均未见GcIFN表达，在两个诱导组中，除病毒组的脾脏见微量表达外，其余的均有较明显表达，且脑与心肌组织中呈强表达。经草鱼出血病病毒诱导后，GcIFN在头肾和鳃组织都有较强表达；经poly I:C诱导的草鱼头肾、肝脏，鳃，GcIFN也有较强表达。相比较而言，poly I:C为草鱼干扰素的良好诱导剂。

实施例3草鱼干扰素在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSC1中的表达

1、GcIFN转化载体的构建及在E.coli中扩增

1.1材料与方法

1.1.1菌种和质粒

大肠杆菌菌种TOP10为本实验室保存，pYES2为带有酵母GAL1启动子的E.coli－酵母穿梭表达质粒，来自清华大学。

1.1.2试剂和工具酶

1.1.3培养基

各种酵母基本培养基和选择培养基。

1.2方法

1.2.1载体的构建：引物的设计，上游引物自GcIFN ATG起始，5’端含HindⅢ酶切位点和 Kozak序列ACC,gc－IFN－F3:5’-CCC AAG CTT GGG ACC ATG GAA ACT CAA ATG TGG-3’(SEQ ID NO.16),下游引物自终止密码字TAA开始，5’端加入XhoⅠ酶切位点。

gc－IFN－R3:5’-GGC GAG CTC GCC TTA TCG TCT GTT GGC AAT GC-3’(SEQ IDNO.17), 引物由博亚公司合成。

1.2.2 PCR扩增目的片段

反应体系如下：

反应条件如下：预变性94℃5min、变性94℃30s、退火58℃30s、延伸72℃30s、循环35、在延伸72℃8min。

1.2.3目的片段的纯化

方法同实施例1(四)4。

1.2.4目的片段的双酶切

使用HindⅢ和XhoⅠ对目的片段进行双酶切，酶切的反应体系如下：

/>

1.2.5质粒pYES2的制备和酶切

碱裂解法小量提取质粒DNA，方法如第一部分(四)5.3a。质粒pYES2的双酶切，使用Hind Ⅲ和XhoⅠ对pYES2进行双酶切，酶切的反应体系如下：

37℃反应过夜。

1.2.6质粒pYES2的双酶切产物的割胶回收

方法同实施例1(四)4。1％琼脂糖凝胶电泳检测，观察回收结果，并大约估计DNA浓度。连接反应，在200ul PCR薄壁管中，建立目的片段GcIFN/HindⅢ/XhoⅠ和pYES2/HindⅢ/XhoⅠ 的连接反应，反应体系如下：

16℃反应15～18小时。

1.2.7转化与重组转化子的鉴定

方法同实施例1(四)5.2。质粒DNA的快速小量制备，随机挑去单菌落接种于含Amp50ug/ml 的LB液体培养基中，37℃培养12～16小时。取菌液倒入1.5ml EP管中。按第一部分(四)5.3a 碱裂解法抽提少量质粒。重组质粒的PCR检测，根据已知的pYES2通用引物基因序列，设计了一对引物，由上海博亚合成。

pYES2－F：5’AAA ACC CCG GAT CGG ACT AC 3’(SEQ ID NO.18)；

pYES2－R：5’GGG AGG GCG TGA ATG TAA GC 3’(SEQ ID NO.19)。

以初步筛选出的重组子质粒做模板，以pYES2－F和pYES2－R为引物进行PCR检测，并设空载体对照，筛选插入位点和长度正确的重组子。反应体系如下：

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察连接结果。将重组质粒进行基因测序。

2结果与分析

2.1草鱼干扰素基因酵母表达载体的构建

pYES2为带有酵母GAL1启动子的E.coli－酵母穿梭表达质粒，它含有以下结构：MCS为多克隆位点，允许外源基因插入；Amp为氨苄抗性基因，允许在大肠杆菌中筛选。URU3用于尿嘧啶营养缺陷型筛选。PCR产物Gc－IFN－ORF含完整的GcIFN基因，长度约560bp，包括长为22个aa 的信号肽。基因5’端有Ⅲ酶切位点，3’端含有XhoⅠ酶切位点，双酶切Gc－IFN－ORF并电泳分离出 560bp的GcIFN基因，同时用HindⅢ和XhoⅠ双酶切pYES2质粒，再经连接、转化，筛选出带有 GcIFN基因的E.coli－酵母穿梭表达质粒，为IFN－pYES2，大小为6.6kb，基因插入方向正确。其构建过程及酶切过程如图6所示。

2.1.2 GcIFN基因酵母转化载体的鉴定

2.1.2.1目的基因(GcIFN基因)的PCR扩增

采用引物pYES2－F和pYES2－R，以质粒IFN－pYES2为模板，进行PCR扩增，同时以质粒 pYES2为阴性对照，空质粒pYES2有200bp的条带，在插入GcIFN基因后，质粒IFN－pYES2出现760bp的条带，结果如图7所示。

2.1.2.2含GcIFN基因的质粒IFN－pYES2酶切鉴定

酶切鉴定结果如图8所示。

实施例4GcIFN基因转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSC1菌株

1材料

1.1质粒与菌株，酵母菌种来自清华，质粒pYES2为带有酵母GAL1启动子的E.coli－酵母穿梭表达质粒。来自清华大学，质粒IFN－pYES2由前期实验构建。

1.1.2试剂和工具酶

1.1.3仪器,电转化仪：Eppendorf公司,0.2cm电击杯：Eppendorf公司出品。

2方法

2.1重组表达质粒电转入酵母

重组表达质粒的少量提取,按第一部分(四)5.3a方法进行。酵母感受态细胞的制备,挑取YPD培养基中一单克隆INVSC1于2mlYPD液体培养基中，30℃，250～300rpm振荡培养过夜；取少量SC悬浮液涂SC平板，鉴定表型；取200ul接种至100ml含YPD培养基的三角摇瓶中，30℃，250～300rpm 振荡培养过夜至OD₆₀₀为1.3～1.5；细胞冰浴15min，终止生长；4℃，3000rpm，5min离心收集细胞，用100ml预冷的无菌水重悬；4℃，3000rpm，5min离心收集细胞，用50ml预冷的无菌水重悬；4℃， 3000rpm，5min离心收集细胞，用4ml预冷的1M山梨醇重悬；4℃，2000rpm，5min离心收集细胞，用100ul预冷的1M山梨醇重悬，终体积约为200～300ul，按40ul/管分装，4℃，保存一周。

2.2电脉冲转化酿酒酵母

将40ul酵母悬浮液与<5ul质粒DNA混合于预冷的电穿孔管(0.2cm)，轻摇管底，以确保样品与铝管两侧接触，冰浴5min；脉冲参数：V＝1.5kV,25uF,200Ohms，4-5ms；电转化后立刻加1ml预冷的1M山梨醇，用无菌移液管转移至无菌eppendorf管；涂布SC-U培养基中选择培养，每200ul涂布一块平板；将平板至于30℃培养，直至单个菌落出现。

2.3筛选阳性转化子

酵母质粒DNA提取,取1～5ml酵母培养物，13，000rpm(～17，900×g)离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；向菌体沉淀中加入100ul裂解液LB，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮酵母沉淀；向细胞悬液中加入5ul Lyticase溶液，37℃放置 30～60分钟；500rpm(～4，000×g)离心5min，吸除上清，保留沉淀；用250ul溶液YP1重悬沉淀，彻底悬浮菌体；向管中加入250ul溶液YP2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解；向管中加入35oul 溶液YP3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。13，000rpm(～17， 900×g)离心10min；小心地将上清液加入吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，13,000rpm(～17， 900×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；向吸附柱CB2中加入500ul 去蛋白液PD，13，000rpm(～17，900×g)离心30sec，倒掉废液；向吸附柱CB2中加入700ul漂洗液 PW，13，000rpm(～17，900×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液；向吸附柱CB2中加入700ul 漂洗液PW，13,000rpm(～17，900×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液；将吸附柱CB2重新放回收集管中置于13，000rpm(～17，900×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB2置于室温或50℃温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB2 放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位悬空滴加50～100ul经65～70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，13，000rpm(～17，900×g)离心1min将质粒溶液收集到离心管中。

2.4酵母质粒在大肠杆菌中的扩增与鉴定

将所得到的酵母质粒重新转化大肠杆菌。然后按第一部分(四)5.3a碱裂解法抽提质粒。PCR 检测含有GC－IFN片段的阳性转化子，以pYES2－F和pYES2－R为引物进行PCR检测并设空载体对照，筛选长度正确的重组子。反应体系如本章1.2.3.2，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，100V， maker DL2000(TaKaRa)，观察鉴定结果。将酵母质粒用HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定，使用HindⅢ和 XhoⅠ对pYES2进行双酶切，酶切的反应体系如下：

37℃反应过夜，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，100V，maker DL2000(TaKaRa)，观察鉴定结果。

2.结果与分析

2.1酵母电转化

将pYES2空质粒以及pYES2－IFN重组质粒分别电转酵母INVSC1，30℃培养数日，结果分别在SC-U选择培养基上长出十数个单克隆。从结果来看，脉冲参数：V＝1.5kV,25uF,200Ohms，4-5ms 能得到较多的阳性克隆。

2.2酵母阳性转化子的分子水平鉴定

以pYES2－F和pYES2－R为引物进行PCR检测并设空载体对照，筛选长度正确的重组子。在插入GcIFN基因后，酵母质粒PCR出现760bp的条带；若未插入，空质粒出现200bp的条带，结果如图9所示。

为了进一步确定酵母菌株中GC-IFN的连入，利用GC-IFN基因两端的HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，从酵母重组质粒中能切出约560bp的草鱼干扰素基因片段。酶切结果如图10所示，结果与预期一致。

实施例5酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中重组草鱼干扰素的表达

1材料

试剂：一般化学试剂，Protein Marker，D301A(TaKaRa)。

2方法

2.1重组酵母的诱导表达实验

挑单菌落重组子与含2％葡萄糖或2％棉籽糖的15ml SC-U培养基中，30℃振荡培养过夜；取过夜培养物测OD₆₀₀值，由此计算在50ml诱导培养基中所需加入的过夜培养物的数量，诱导培养基初始OD值需达到0.4(0.4OD/ml)(50ml)，按照步骤2中计算的量所得取过夜培养物，4℃，1，500g，离心5min，收集细胞；用1～2ml诱导培养基重悬细胞，接种与50ml诱导培养基，30℃振荡培养；

在0、2、4、6、8、10、12小时的时候收集细胞。每个时段取样5ml，分别测OD₆₀₀值；4℃，1，500g，离心5min，收集细胞；弃上清，用500ul灭菌水重悬细胞；将细胞转移至1.5mleppendorf 管中，最高速离心30sec；弃上清；－80℃保存。

2.2重组蛋白表达的鉴定

酵母破壁，蛋白释放,细胞菌溶液可用冻存细胞或新鲜细胞；用500ul裂解液重悬细胞，4℃，1， 500g，离心5min，收集细胞；弃上清，用裂解液重悬细胞，将OD₆₀₀值调到50－100，按1.2.1.2中所述方法计算所需加入的裂解液的体积；加入等体积的玻璃珠；(SigmaG-8772),振荡30sec，冰浴 30sec，重复4次裂解细胞，然后取部分镜检观察细胞破碎效果；最高速离心10min；吸取上清液转移至另一干净的离心管中；加入SDS－PAGE样品缓冲液至终浓度1×，煮沸5min；取20ul溶菌液加样；SDS－PAGE电泳分析。

凝胶配方：

上样缓冲液：0.1％溴酚兰，40％甘油,电泳缓冲液：25mM Tris，250mM甘氨酸，pH8.3。

2、结果与分析

SDS－PAGE作为蛋白的检测手段之一，可以确定各种蛋白的分子量。我们利用SDS－PAGE电泳系统，检测所表达的草鱼干扰素蛋白的分子量。结果如图11所示，从电泳图来看，pYES2－IFN/ INVSC1菌株在分子量38，000Da的位置有一明显的蛋白条带，而pYES2/INVSC1菌株没有，因此确定该蛋白即为酵母所表达出的草鱼干扰素蛋白。酵母所表达出的草鱼干扰素蛋白大于预期的分子量，分析其可能的原因为：草鱼干扰素蛋白预期的分子量为21.4kDa，而实际为38kDa，可能为草鱼干扰素基因上存在潜在的糖基化位点。

通过诱导表达实验，我们发现在发酵一开始，由于初始细胞密度较高，草鱼干扰素的表达量就比较高，此后随着时间的增加，表达量逐步降低，第5天后，草鱼干扰素的条带几乎不可见，而杂蛋白则大大增加。

实施例6重组GcIFN的活性测定

I实验方法

1.GcINF在草鱼细胞上的抗病毒活性测定

1.1重组GcIFN的分离

采用非变性梯度PAGE(6％～20％)电泳分离GcIFN，电极液为0.025mol/Ltris-0.192mol/Lgly (pH8.3),100V电泳6小时后，从凝胶中电泳洗脱GcIFN(25mA 4小时)，样品经冰冻干燥浓缩后，再用高效液相层析(HPLC)纯化，用岛津Shim-Pack DIOL-150凝胶分离柱(柱长25cm，直径0.79cm), 洗脱液为含0.2mol/Lna2SO4的10mmol/LPB缓冲液(pH7.2)，流速1mL/min,检测波长280nm,干扰素样品经冰冻干燥浓缩，测定活性。

1.2重组GcIFN的抗病毒活性测定

采用半数细胞病变抑制(CPEI50)法进行，草鱼ZC7901和CP80胚胎细胞株，经不同稀释度的 GCIFN作用后，加入100TCID50草鱼出血病病毒GCHV攻击，以能抑制50％细胞病变的最高稀释度为一个干扰素活性单位，用Log2CPEI50/0.1ml表示。

2.鱼体抗病毒活性测定

2.1注射试验

一龄草鱼(10～12cm长)，背鳍皮下注射GcIFN，0.1ml(10μg)/尾,12小时后分别感染GCHV 和GCPV 0.1ml(500TCID₅₀)/尾,28℃水温饲养2周，统计发病死亡率。对照组注射空白PBS液。

2.2饲喂试验

一龄草鱼饲喂GcIFN(每公斤饲料添加GcIFN工程菌粉33mg,GcIFN在酵母中的表达量30％，则10mg GcINF/Kg饲料)，连续饲喂1周，分别感染GCHV和GCPV 0.1ml(500TCID₅₀)/尾,28℃水温饲养2周，统计发病死亡率。对照组饲喂不含干扰素的正常饲料。

2.3养殖抗病试验

从2005年6月开始，在义乌东太养殖有限公司和松阳良种繁育场进行养殖草鱼和鲈鱼抗病试验，将养殖网箱分成8组，其中5组网箱为试验组，3组为对照组，使用含GcIFN的饲料(每公斤饲料添加GcIFN工程菌粉33mg,GcIFN在酵母中的表达量30％，10mg GcINF/Kg饲料)投喂，连续投喂 4周，统计自然发病死亡率。

II结果

1.重组GcIFN的抗病毒活性测定

结果见如下表1。显示草鱼重组干扰素具有很高的抗病毒活性。

表1.GcIFN在ZC7901和CP80细胞中的活性测定

^*用100TCID50 GCHV(TCID₅₀＝10^5.8/0.1ml)进行感染。

^**IFN滴度:Log2CPEI50/0.1ml,(X±SD),n＝5。

2.鱼体抗病毒活性测定

2.1注射试验结果

见如下表2。结果显示重组GcIFN通过注射方式，有明显的抗病效果,其注射组的成活率比对照组提高47.68％。

表2.鱼体注射GcIFN的抗病试验结果

2.2饲喂试验结果

见如下表3。结果显示重组GcIFN通过饲喂方式，也有明显的抗病效果,其试验组的成活率比对照组提高23.92％。

表3.鱼体饲喂含GcIFN饲料的抗病试验结果

3、养殖抗病试验

结果见表下表4、5。结果显示，使用GcIFN的实验组，成活率明显提高，表明GcIFN能明显提高鱼体免疫抗病能力。

表4喂养草鱼抗病试验效果表

表5喂养鲈鱼抗病试验效果表

实施例7 GcIFN突变体

1.为了获得对草鱼出血病病毒(GCHV)和草鱼小RNA病毒(GCPV)更高抗病毒活性的干扰素，对GcIFN进行了突变，获得了GcIFN突变体，该突变体相较于GcIFN在S94C和Y131F两个位点引入突变点。

2.参照实施例3的步骤构建含GcIFN突变体基因的质粒IFN－pYES2；参照实施例4的步骤构建得到上述充足质粒转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSC1菌株，获得能够表达GcIFN突变体的酿酒酵母；参照实施例5的步骤诱导表达GcIFN突变体；参照实施例6的步骤分离纯化GcIFN 突变体。

3.重组GcIFN的抗病毒活性测定

4.鱼体抗病毒活性测定

4.1注射试验

一龄草鱼(10～12cm长)，背鳍皮下注射GcIFN和GcIFN突变体，0.1ml(10μg)/尾,12小时后分别感染GCHV和GCPV 0.1ml(500TCID50)/尾,28℃水温饲养2周，统计发病死亡率。

4.2饲喂试验

一龄草鱼饲喂GcIFN(每公斤饲料添加GcIFN工程菌粉33mg,GcIFN在酵母中的表达量30％，则10mg GcINF/Kg饲料)和GcIFN突变体(每公斤饲料添加GcIFN突变体工程菌粉33mg,GcIFN突变体在酵母中的表达量30％，则10mg GcINF/Kg饲料)，连续饲喂1周，分别感染GCHV和GCPV 0.1ml(500TCID₅₀)/尾,28℃水温饲养2周，统计发病死亡率。

4.3养殖抗病试验

从2018年6月开始，在松阳良种繁育场进行养殖草鱼和鲈鱼抗病试验，将养殖网箱分成6组，使用含GcIFN的饲料(每公斤饲料添加GcIFN工程菌粉33mg,GcIFN在酵母中的表达量30％，10mg GcINF/Kg饲料)和GcIFN突变体的饲料(每公斤饲料添加GcIFN突变体工程菌粉33mg,GcIFN突变体在酵母中的表达量30％，10mg GcINF/Kg饲料)投喂，连续投喂4周，统计自然发病死亡率。

II结果

1.重组GcIFN突变体的抗病毒活性测定

结果见如下表1。显示草鱼重组干扰素突变体具有很高的抗病毒活性。

表1.GcIFN突变体在ZC7901和CP80细胞中的活性测定

^*用100TCID50 GCHV(TCID₅₀＝10^5.8/0.1ml)进行感染。

^**IFN滴度:Log2CPEI50/0.1ml,(X±SD),n＝5。

2.鱼体抗病毒活性测定

2.1注射试验结果

见如下表2。结果显示重组GcIFN突变体通过注射方式，有明显的抗病效果,其注射组的成活率比对照组提高8.8％。

表2.鱼体注射GcIFN突变体的抗病试验结果

2.2饲喂试验结果

见如下表3。结果显示重组GcIFN突变体通过饲喂方式，也有明显的抗病效果,其试验组的成活率比对照组提高9.1％。

表3.鱼体饲喂含GcIFN突变体饲料的抗病试验结果

3、养殖抗病试验

结果见表下表4、5。结果显示，使用GcIFN突变体的实验组，成活率明显提高，表明GcIFN 突变体能明显提高鱼体免疫抗病能力。

表4喂养草鱼抗病试验效果表

表5喂养鲈鱼抗病试验效果表

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江皇冠科技有限公司

<120> 草鱼干扰素、草鱼干扰素突变体及其应用和产品

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Thr Gln Met Trp Thr Tyr Met Phe Val Met Phe Leu Thr Leu

1 5 10 15

Gln Gly Gln Cys Ser Ala Cys Glu Trp Leu Gly Arg Tyr Arg Met Ile

20 25 30

Ser Asn Glu Ser Leu Ser Leu Leu Lys Glu Met Gly Gly Lys Tyr Pro

35 40 45

Glu Gly Thr Lys Val Ser Phe Pro Gly Arg Leu Tyr Asn Met Ile Asp

50 55 60

Asn Ala Lys Val Glu Asp Gln Val Lys Phe Leu Val Leu Thr Leu Asp

65 70 75 80

His Ile Ile Arg Leu Met Asp Ala Arg Glu His Met Asn Ser Val Gln

85 90 95

Trp Asn Leu Gln Thr Val Glu His Phe Leu Thr Val Leu Asn Arg Gln

100 105 110

Ser Ser Asp Leu Lys Glu Cys Val Ala Arg Tyr Gln Pro Ser His Lys

115 120 125

Glu Ser Tyr Glu Lys Lys Ile Asn Arg His Phe Lys Ile Leu Lys Lys

130 135 140

Asn Leu Lys Lys Lys Glu Tyr Ser Ala Gln Ala Trp Glu Gln Ile Arg

145 150 155 160

Arg Ala Val Lys His His Leu Gln Arg Met Asp Ile Ile Ala Ser Ile

165 170 175

Ala Asn Arg Arg

180

<210> 2

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Thr Gln Met Trp Thr Tyr Met Phe Val Met Phe Leu Thr Leu

1 5 10 15

Gln Gly Gln Cys Ser Ala Cys Glu Trp Leu Gly Arg Tyr Arg Met Ile

20 25 30

Ser Asn Glu Ser Leu Ser Leu Leu Lys Glu Met Gly Gly Lys Tyr Pro

35 40 45

Glu Gly Thr Lys Val Ser Phe Pro Gly Arg Leu Tyr Asn Met Ile Asp

50 55 60

Asn Ala Lys Val Glu Asp Gln Val Lys Phe Leu Val Leu Thr Leu Asp

65 70 75 80

His Ile Ile Arg Leu Met Asp Ala Arg Glu His Met Asn Cys Val Gln

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Trp Asn Leu Gln Thr Val Glu His Phe Leu Thr Val Leu Asn Arg Gln

100 105 110

Ser Ser Asp Leu Lys Glu Cys Val Ala Arg Tyr Gln Pro Ser His Lys

115 120 125

Glu Ser Phe Glu Lys Lys Ile Asn Arg His Phe Lys Ile Leu Lys Lys

130 135 140

Asn Leu Lys Lys Lys Glu Tyr Ser Ala Gln Ala Trp Glu Gln Ile Arg

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Arg Ala Val Lys His His Leu Gln Arg Met Asp Ile Ile Ala Ser Ile

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180

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cagtgtagaa agctactact acctgaatac aaagatgaaa actcaaatgt ggacgtatat 60

gtttgtaatg tttttaactc tgcagggtca atgctctgct tgcgaatggc tcggccgata 120

caggatgata agcaacgagt ctttgagcct cctgaaggaa atgggtggaa aatatcctga 180

gggtaccaag gtgtcatttc caggacgcct gtacaacatg atagacaatg ccaaggtgga 240

ggaccaggtg aagtttcttg tcctgacctt agatcatatc atccgcctca tggatgccaa 300

gagcacatga attcagtgca gtggaaccta cagactgtag agcattttct aactgtcctg 360

aacaggcagt catctgatct taaagaatgt gtggcccgat accagccatc acataaggag 420

tcctacgaga aaaagataaa cagacacttc aagattttaa agaagaatct aaagaaaaaa 480

gaatatagtg ctcaagcatg ggagcagatc cggagagctg tgaaacatca ccttcagagg 540

atggacatca tcgcaagcat tgccaacaga cgataagaca taatgacgga tgaatgactt 600

gtgacacatt ccatggagtg aagaaaagtt aatgtaaaca atgccttaaa agctaaaact 660

gaatgtaaca aatatttatt tacatgactg tattttattt caactagagt tgaaagtttt 720

gcctaatgtc tggtgttgta atatagagtt taccttatgt gtttcctatg aaaacttgaa 780

gtaatctgat caagcaagct aattatgttt cttacaaaaa cctgagaaac cttgtattta 840

ttttattttg gtgcaaatag gcctatgtgc ctaaactata cccagatttt ttgctgaatg 900

tgaaaaaaat gtttaaaaaa acaagcatgc catgtatttc aagtcatgta tttattaacg 960

gtcaatcaat tatgttgtga tgcacatgga tatgatgtat gttttgtgat tgtttcagat 1020

atttattata cttaatttac ttcatacatt gttgtgcaca atttttgtat ctctgaatat 1080

tttattcttt ttatatgtac tgaatgcttg cgataatgat ttgctctatt tgcttgcaaa 1140

atatttttgt acttttaaat aaaaaattga ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 1190

<210> 4

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<212> DNA

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gtttgtaatg tttttaactc tgcagggtca atgctctgct tgcgaatggc tcggccgata 120

caggatgata agcaacgagt ctttgagcct cctgaaggaa atgggtggaa aatatcctga 180

gggtaccaag gtgtcatttc caggacgcct gtacaacatg atagacaatg ccaaggtgga 240

ggaccaggtg aagtttcttg tcctgacctt agatcatatc atccgcctca tggatgccaa 300

gagcacatga attgtgtgca gtggaaccta cagactgtag agcattttct aactgtcctg 360

aacaggcagt catctgatct taaagaatgt gtggcccgat accagccatc acataaggag 420

tcctttgaga aaaagataaa cagacacttc aagattttaa agaagaatct aaagaaaaaa 480

gaatatagtg ctcaagcatg ggagcagatc cggagagctg tgaaacatca ccttcagagg 540

atggacatca tcgcaagcat tgccaacaga cgataagaca taatgacgga tgaatgactt 600

gtgacacatt ccatggagtg aagaaaagtt aatgtaaaca atgccttaaa agctaaaact 660

gaatgtaaca aatatttatt tacatgactg tattttattt caactagagt tgaaagtttt 720

gcctaatgtc tggtgttgta atatagagtt taccttatgt gtttcctatg aaaacttgaa 780

gtaatctgat caagcaagct aattatgttt cttacaaaaa cctgagaaac cttgtattta 840

ttttattttg gtgcaaatag gcctatgtgc ctaaactata cccagatttt ttgctgaatg 900

tgaaaaaaat gtttaaaaaa acaagcatgc catgtatttc aagtcatgta tttattaacg 960

gtcaatcaat tatgttgtga tgcacatgga tatgatgtat gttttgtgat tgtttcagat 1020

atttattata cttaatttac ttcatacatt gttgtgcaca atttttgtat ctctgaatat 1080

tttattcttt ttatatgtac tgaatgcttg cgataatgat ttgctctatt tgcttgcaaa 1140

atatttttgt acttttaaat aaaaaattga ttgaaaaaaa aaaaaaaaaa 1190

<210> 5

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 11

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatgactgcc tg 12

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aggtggaaaa tatcctgagg g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aaggtgtcat ttccaggagc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagccattcg caagcagagc 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cgcaagcaga gcattgaccc 20

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccaagcttg ggaccatgga aactcaaatg tgg 33

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggcgagctcg ccttatcgtc tgttggcaat gc 32

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaaaccccgg atcggactac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gggagggcgt gaatgtaagc 20

Claims

1. 一种草鱼干扰素突变体，其特征在于，所述草鱼干扰素突变体的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

2.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述草鱼干扰素突变体。

3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因具有如SEQ ID NO.4所示的序列。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括载体和权利要求2或3所述的基因。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述载体包括pYES2质粒。

6.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求4或5所述的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包括酵母菌。

8.权利要求1所述的草鱼干扰素突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4或5所述的重组质粒或者权利要求6或7所述的基因工程菌在制备抗水产动物病毒产品中的应用；

所述水产动物病毒为草鱼出血病病毒或草鱼小RNA病毒。

9.一种饲料添加剂，其特征在于，包括权利要求6或7所述的基因工程菌。