CN108379559A

CN108379559A - 草鱼干扰素1在制备抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN108379559A
Application number: CN201810503118.4A
Authority: CN
Inventors: 苏建国; 肖循; 朱文涛
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2018-08-10

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了草鱼干扰素1在制备抗菌药物中的应用，所述的草鱼干扰素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明首次发现草鱼干扰素具有高效的抗菌效果，对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、河流弧菌和嗜水气单胞菌均可发挥功能，具有很好的应用价值。

Description

草鱼干扰素1在制备抗菌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及草鱼干扰素1在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

干扰素是一类分泌型细胞因子，早期根据其强大的抗病毒功能而引起广泛关注。1980初期，随着基因工程IFN蛋白产物研制成功，被应用于临床研究。1982年，我国候云德院士研制出我国首个基因工程创新药物：重组人α1b型干扰素。干扰素也是至今人类最主要的抗病毒药物。

目前研究表明，干扰素功能远不止抗病毒这么简单。从最开始简单治愈流感、肝炎、水痘等疾病，现在还广泛应用于许多肿瘤、癌症和白血病的治疗。因此广泛的研究干扰素的功能具有重要价值。

草鱼IFN1属于干扰素家族蛋白，草鱼该家族蛋白还包括：IFN2，IFN3，IFN4，IFNγ等。

在本发明中申请人发现，草鱼IFN1除了上述功能外，还具有类似抗菌肽的直接杀菌功能。在水产和畜牧养殖业，抗生素的滥用已经产生多种负面效应。多种耐药菌株的出现，给养殖产业造成了巨大的损失。因此，开发出具有新型抗菌功能的药物显得迫在眉睫。所以在此基础上，发现草鱼IFN1的直接抗菌功能具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是草鱼干扰素1在制备抗菌药物中的应用，所述的草鱼干扰素1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。草鱼干扰素1对革兰氏阳性细菌中的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌，革兰氏阴性细菌中的大肠杆菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌都具有一定的杀伤作用。

本发明的另一个目的在于草鱼干扰素1重组蛋白的制备方法，申请人在克隆草鱼干扰素1编码序列的基础上，利用基因工程技术进行重组表达并纯化得到。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

草鱼干扰素1在制备抗菌药物中的应用，所述的草鱼干扰素1的氨基酸序列为SEQID NO.2所示，利用本领域的常规方案制备的草鱼干扰素1均能完成本发明。

所述的应用中，优选的所述的菌包括但不限于金黄色葡萄球菌、无乳链球菌，大肠杆菌、嗜水气单胞菌或河流弧菌。

以上所述的应用中，所述的草鱼干扰素1可通过原核表达获得，其步骤包括：

构建原核表达载体pGEX-4T-1-GC_IFN1，转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)plysS，筛选阳性菌株进行大量表达，通过GST蛋白亲和层析柱纯化GST-IFN1融合蛋白，通过肠激酶酶切，将GST-IFN1融合蛋白分为GST和IFN1两部分，进一步通过阳离子柱层析纯化，获得草鱼IFN1重组蛋白；

所述的原核表达载体pGEX-4T-1-GC_IFN1为将草鱼干扰素ORF序列插入到pGEX-4T-1的Kpn I和EcoR I酶切位点之间得到。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次发现草鱼干扰素1对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌均可产生杀菌作用，对革兰氏阳性细菌中的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌，革兰氏阴性细菌中的大肠杆菌、嗜水气单胞菌、河流弧菌均有强有力的抑制作用，因此，可用于制备治疗细菌病的药物，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为草鱼干扰素1基因开放阅读框(ORF)序列图

图中，划线部分为信号肽区，阴影部分为成熟肽区。

图2为草鱼干扰素1蛋白纯化SDS-PAGE鉴定结果

图中M泳道为蛋白分子量Marker；第1泳道为GST-IFN1亲和层析纯化结果；第2泳道为GST和IFN1肠激酶酶切后结果；第3泳道为IFN1阳离子柱纯化结果。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明所述干扰素的制备和应用。这些实施例仅对本发明进行说明，而不是对本发明进行限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，可参考《基因工程实验技术教程》、《蛋白质纯化与分析技术》、《微生物学实验》(第四版)。

实施例1：

草鱼干扰素1基因开放阅读框(ORF)的克隆：

1)草鱼干扰素1基因开放阅读框(ORF)的克隆

设计用于扩增草鱼干扰素1的ORF区域的引物IFN-F/R：

GC_IFN-F1：ATGAAAACTCAAATGTGGACG

GC_IFN-R2：TTATCGTCTGTTGGCAATGCT

PCR反应体系如表1；

表1 PCR反应体系

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；16℃，5min。反应结束后，20μl PCR产物加入4μl 6╳loadingbuffer混合均匀，用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，150V，30min。

2)PCR产物回收

3)连接和转化

此步骤按照连接试剂盒(TAKARA)公司说明书进行操作，连接反应体系如表2；

表2连接反应体系

反应条件：16℃连接12h。

转化步骤：

(1)将10μl连接产物加入到100μl大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞液中，冰上放置30min，然后放在42℃水浴锅中热激90s，再冰上放置3min。

(2)加入500μl LB液体培养基，37℃震荡培养60min。

(3)吸取100μl菌液，均匀涂布在含有Amp的LB固体培养基平板上。

(4)将平板37℃培养箱正放30min，待表面菌液被吸干后，倒置平板，培养12h。

4)目的片段菌落PCR及测序

(1)在平板上挑去20个白色菌落，分别加入到1ml含有千分之一的Amp的LB液体培养基中。

(2)37℃震荡培养4h。

(3)3000r/min离心3min，吸掉上层400μl上清液。

(4)将菌液当成模板进行PCR扩增，PCR条件参考表1.

(5)电泳检测，选择目的条带亮度大的菌液送公司测序。

实施例2：

草鱼干扰素1基因编码区去除信号肽部分的克隆及原核重组表达质粒的构建：

根据原核表达质粒pGEX-4T-1上的酶切位点的特征,专门设计一对分别添加了KpnI和EcoR I酶切位点的特异性引物GC_IFN-F2/R2：

GC_IFN-F2：CCGGGTACCGAATGGCTCGGCCGATAC

GC_IFN-R2：CGCGAATTCTTATCGTCTGTTGGCAAT

引物序列的划线处分别为Kpn I和EcoR I的酶切位点。使用PCR扩增技术，以实施例1中克隆得到的ORF片段为模板，反应程序参考实施例1。将克隆得到的目的条带切胶回收后与pGEX-4T-1载体进行双酶切，酶切条件见表3。

此步骤按照内切酶(TAKARA)公司说明书进行操作，酶切体系如表3；

表3双酶切体系

酶切条件为37℃1h。酶切完成后，采用AXYGEN PCR清洁回收试剂盒对酶切片段进行回收。将回收产物进行连接，然后将连接产物进行后续转化，筛选阳性克隆并测序。连接体系和条件，转化和阳性克隆筛选测序等实验步骤参考实施例1。

实施例3：

原核重组表达载体在大肠杆菌中诱导与表达：

将构建好的重组表达载体pGEX-4T-1-IFN1导入到大肠杆菌BL21(DE3)plysS感受态细胞中，涂平板挑阳性克隆接种于10ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，加等体积30％甘油-35℃保存备用。

(1)诱导表达：取1ml备用菌加入到9ml LB培养基中，培养到OD₆₀₀等于0.6，同时取相同条件下的pGEX-4T-1空载菌液1ml做对照，两种菌液都加入终浓度为1mM的IPTG，37℃，200rpm培养。菌液诱导4小时后取实验组样品和对照组样品进行检测(样品处理方法：4℃，6000rpm离心，保留菌体沉淀，加入100μl PBS缓冲液涡旋震荡，取20μl加入等体积的2╳SDS蛋白上样缓冲液，100℃水浴加热15min，空载质粒菌液处理同上，进行SDS-PAGE上样检测表达结果)。最终确认重组蛋白GST-IFN1在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达成功。

(2)重组蛋白的可溶性检测：为了确认GST-IFN1是以包涵体还是可溶形式表达。取2ml备用菌加入到98ml LB液体培养基中，培养到OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导培养4h，后4℃，6000rpm离心10min收集沉淀，加入10ml PBS涡轮震荡，加入终浓度为0.1mM的PMSF后进行超声波细菌破碎30min，将破碎后的液体4℃，12000rpm离心15min，后分别取上清50μl，沉淀少许加入50μl PBS缓冲液，后各加入等体积2╳SDS蛋白上样缓冲液，100℃水浴加热15min，空载质粒菌液处理同上，后进行SDS-PAGE上样检测表达结果，重组蛋白主要以可溶性形式存在于上清中。

实施例4：重组蛋白的分离与纯化

(1)重组蛋白的分离：取10ml备用菌加入到490ml含氨苄的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加终浓度为1mM的IPTG继续培养4h，后4℃，6000rpm离心10min收集沉淀，加入30ml PBS缓冲液涡旋震荡，加入终浓度为0.1mM的PMSF后进行超声波细菌破碎30min，将破碎后的液体4℃，12000rpm离心15min，保留上清去除沉淀，以备纯化。

(2)重组蛋白的GST亲和层析纯化：本实验室蛋白纯化方法是根据常州天地人和公司的GSTCap 4FF层析填料，对带有GST标签蛋白的融合蛋白进行纯化。具体方法如下：将所得上清经0.22μm的滤膜进行过滤，向滤液中加入终浓度为0.1mM的PMSF以备过柱。纯化采取10mM还原性谷胱甘肽洗脱液进行洗脱。步骤如下：

①取准备好的GSTCap 4FF琼脂糖凝胶柱固定于铁架台上，首先打开上盖和下方开关，

使其中的酒精保存液流出；

②用20倍柱体积的平衡液(50mM NaH₂PO₄，50mM NaCl pH 8.0)平衡柱子，控制流速1ml/min；

③将过滤好的上清液加入柱中，控制流速1ml/min；

④用10倍柱体积的平衡液过柱，控制流速1ml/min，收集穿透液；

⑤用10倍柱体积的洗脱液(50mM NaH₂PO₄，50mM NaCl，10mM Glutathione pH 8.0)进行洗脱，每管收集1ml，总共收集10管。

将收集的穿透液取样20μl，进行SDS-PAGE鉴定，实验方法同上。

检测结果：通过GST亲和层析柱纯化出目的蛋白，过柱后目的蛋白浓度在1mg/ml左右，SDS-PAGE结果见附图2中第1泳道结果。

(3)重组蛋白肠激酶酶切：为了避免标签蛋白GST对IFN1蛋白产生影响，本实验室利用肠激酶对GST-IFN1融合蛋白进行酶切，将GST-IFN1融合蛋白分为GST蛋白和IFN1蛋白两部分，实验所用肠激酶为上海近岸公司。实验条件体系为1ml重组蛋白加1μl肠激酶溶液，反应条件为37℃水浴16h。取20μl酶切后产物进行SDS-PAGE检测，实验方法同上，结果显示GST-IFN1融合蛋白酶切效率高达90％以上，目的蛋白IFN1与标签蛋白GST成功分开。SDS-PAGE鉴定结果见图2中第2泳道。

(4)IFN1蛋白的阳离子交换柱层析：为了去除酶切产物中GST标签蛋白获取IFN1的最终产物，本实验室利用常州天地人和的SP-FF阳离子层析柱对IFN1蛋白进行纯化。具体方法如下：

①取常州天地人和的SP-FF阳离子层析柱固定在AKTA蛋白纯化仪上。

②用20倍柱体积的平衡液(50mM NaH₂PO₄pH 8.0)平衡柱子，控制流速1ml/min；

③将过滤好的上清液加入柱中，控制流速1ml/min；

④用10倍柱体积的平衡液(50mM NaH₂PO₄pH 8.0)过柱，控制流速1ml/min，收集穿透液；

⑤用含0-1M氯化钠的缓冲液(50mM NaH₂PO₄pH 8.0)进行梯度洗脱，并收集AKTA蛋白洗脱峰。

将收集的穿透液取样20μl，进行SDS-PAGE鉴定，实验方法同上。

检测结果：通过阳离子层析柱纯化出IFN1目的蛋白，过柱后目的蛋白浓度在1mg/ml左右，SDS-PAGE结果见图2中第3泳道结果。

实施例5：

草鱼干扰素1的抑菌活性鉴定。

测试细菌：河流弧菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

具体步骤如下：

(1)先把-80℃条件下保存的五种细菌：河流弧菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌置于4℃熔解，取出平衡至室温，分别进行肉汤液体培养基小量活化接菌种，于30℃条件下恒温摇床培养18小时至对数生长期。

(2)将活化好的菌液接种到肉汤琼脂固体斜面培养基上，30℃恒温摇床培养18小时，用无菌水洗下菌苔,稀释至5×10⁶cfu/ml。

(3)取稀释后的菌液10μl与不同浓度的IFN1蛋白液10μl混合均匀，放在30℃恒温水浴锅内孵育2小时，取出10μl混合液涂平板，每组做3个平行，30℃倒置培养12小时后计数菌落并拍照，阴性对照为菌液+无菌水。

(4)根据以下公式计算抑菌率：

抑菌率(100％)＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100％

(5)结果分析：

表4 IFN1重组蛋白对五种细菌抑制率

由表4可以得到：IFN1重组蛋白在10-1000μg/ml之间对上述5种细菌均具有明显的杀伤效果。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 草鱼干扰素1在制备抗菌药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 543

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaactc aaatgtggac gtatatgttt gtaatgtttt taactctgca gggtcaatgc 60

tctgcttgcg aatggctcgg ccgatacagg atgataagca acgagtcttt gagcctcctg 120

aaggaaatgg gtggaaaata tcctgagggt accaaggtgt catttccagg acgcctgtac 180

aacatgatag acaatgccaa ggtggaggac caggtgaagt ttcttgtcct gaccttagat 240

catatcatcc gcctcatgga tgccagagag cacatgaatt cagtgcagtg gaacctacag 300

actgtagagc attttctaac tgtcctgaac aggcagtcat ctgatcttaa agaatgtgtg 360

gcccgatacc agccatcaca taaggagtcc tacgagaaaa agataaacag acacttcaag 420

attttaaaga agaatctaaa gaaaaaagaa tatagtgctc aagcatggga gcagatccgg 480

agagctgtga aacatcacct tcagaggatg gacatcatcg caagcattgc caacagacga 540

taa 543

<210> 2

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Thr Gln Met Trp Thr Tyr Met Phe Val Met Phe Leu Thr Leu

1 5 10 15

Gln Gly Gln Cys Ser Ala Cys Glu Trp Leu Gly Arg Tyr Arg Met Ile

20 25 30

Ser Asn Glu Ser Leu Ser Leu Leu Lys Glu Met Gly Gly Lys Tyr Pro

35 40 45

Glu Gly Thr Lys Val Ser Phe Pro Gly Arg Leu Tyr Asn Met Ile Asp

50 55 60

Asn Ala Lys Val Glu Asp Gln Val Lys Phe Leu Val Leu Thr Leu Asp

65 70 75 80

His Ile Ile Arg Leu Met Asp Ala Arg Glu His Met Asn Ser Val Gln

85 90 95

Trp Asn Leu Gln Thr Val Glu His Phe Leu Thr Val Leu Asn Arg Gln

100 105 110

Ser Ser Asp Leu Lys Glu Cys Val Ala Arg Tyr Gln Pro Ser His Lys

115 120 125

Glu Ser Tyr Glu Lys Lys Ile Asn Arg His Phe Lys Ile Leu Lys Lys

130 135 140

Asn Leu Lys Lys Lys Glu Tyr Ser Ala Gln Ala Trp Glu Gln Ile Arg

145 150 155 160

Arg Ala Val Lys His His Leu Gln Arg Met Asp Ile Ile Ala Ser Ile

165 170 175

Ala Asn Arg Arg

180

Claims

1.草鱼干扰素1或编码草鱼干扰素1的核苷酸序列在制备抗菌药物中的应用。

2.草鱼干扰素1或编码草鱼干扰素1的核苷酸序列在制备治疗或预防细菌感染引起的疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述应用，所述的草鱼干扰素的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的应用，所述的菌包括但不限于：金黄色葡萄球菌、无乳链球菌，大肠杆菌、嗜水气单胞菌或河流弧菌。