CN105238773B

CN105238773B - 一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105238773B
Application number: CN201510844661.7A
Authority: CN
Inventors: 孙利厂; 王冉; 魏瑞成
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-11-27
Filing date: 2015-11-27
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2035-11-27
Also published as: CN105238773A

Abstract

本发明公开一种葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，氨基酸序列如Seq ID NO.2所示；该裂解酶用于防治多种葡萄球菌，该抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶可以单独或复配使用，或制备成酶制剂，用以防治由葡萄球菌引起的各种污染和感染，特别是奶牛养殖场中由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染，具有极高的防治效果，且安全无毒副作用。

Description

一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶及其制备方法与应用。

背景技术

葡萄球菌广泛分布于空气、饮水、地面、物体表面及饲料。人及畜禽的皮肤、黏膜、肠道、呼吸道及乳腺也有寄生。致病性葡萄球菌引起各种化脓性感染、败血症及脓毒败血症，污染食品时，可引起食物中毒。根据生化反应和产生色素不同，葡萄球菌属有20多种，其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种重要的人兽共患病原菌，可以引起伤口感染、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合征等多种疾病。除金黄色葡萄球菌外其余种葡萄球菌可以称为凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative staphyloeocci，CNS)，如：表皮葡萄球菌、模仿葡萄球菌、溶血葡萄球菌、缓慢葡萄球菌等，主要为条件致病菌，引起人和动物持续性感染。葡萄球菌也是感染奶牛乳腺炎的主要致病菌，引起牛奶中体细胞数(Somatic cell count，SCC)升高，严重影响产奶量及牛奶质量，严重威胁食品安全。

目前通常采用注射抗生素的方式治疗葡萄球菌的感染，然而葡萄球菌易于对抗生素产生抗性，包括常见的各种抗生素和新型的抗微生物制剂，此外虽然使用抗生素能够在一定程度上抑制金黄色葡萄球菌引起的细菌感染，但抗生素的长期使用和滥用，又带来了世界范围内不可逆转的致病菌危害，例如：抗生素的使用导致多年来不断产生多重耐药金葡菌，如耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)及和耐万古霉素金葡菌(vancomycin-resistant S.aureus，VRSA)；另一方面，抗生素的滥用也带来了严重的食品安全隐患，间接危害了人类的健康。因此，研发新型的抗菌药物成为迫在眉睫的社会需要和各国科学家的研究热点。

噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶，大小通常为25kD～40kD，具备位于N端的具有裂解功能的结构域和位于C端的决定宿主特异性的结构域，能够直接破坏细菌细胞壁的肽聚糖从而使细菌裂解。近年来的研究表明，对于革兰氏阳性菌，某些噬菌体的裂解酶能够从菌外，对细菌细胞壁进行强烈的破坏作用，并且噬菌体裂解酶作为一种新型抗菌药物具有高效快速、裂解谱广、安全性高；由于裂解酶针对细菌保守的肽聚糖结构发挥作用，因而具有难产生抗性菌、能够有效裂解多重耐药菌等优点，国内外多项体内动物试验也表明裂解酶具有很高的杀菌性。

抗菌肽通常由少于100个残基和正电荷的氨基酸构成，在自然生物中广泛分布，抗菌肽的作用机理主要是通过结合到细胞膜上，当浓度到达一定阈值时，膜肽之间的相互作用可以形成临时孔道，引起细胞膜去极化、内容物泄漏，最终导致细胞裂解死亡。抗菌肽杀菌活性高，其杀菌速度优于普通噬菌体裂解酶；抗菌肽主要作用于细菌的细胞膜，因此细菌很难产生针对抗菌肽的抗性。但是抗菌肽的规模化应用受以下两点限制：一是目前利用化学合成技术能够得到正确配对的二硫键，但化学合成法成本高，阻碍了抗菌肽分子的生产，因此很难规模化生产；二是抗菌肽能对病毒、真菌、革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌等多种微生物进行无选择性的攻击，在杀灭致病菌的同时破坏体内正常菌群的平衡，因此对哺乳动物产生一定的细胞毒性，从而阻碍抗菌肽的进一步应用。目前，将噬菌体裂解酶与抗菌肽基因相结合进行基因改造，用于防治由多种葡萄球菌引起的人和动物感染，尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶及其制备方法，该裂解酶对葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染具有显著的防治效果，可以特异性的灭活金葡菌，为工业化生产抗菌制剂提供原料来源，本发明是这样实现的：

一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

进一步，本发明所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶的制备方法如下：

(1)利用嵌合裂解酶AP-LyS1基因与pET32a原核表达载体合成重组表达质粒，pET32a-AP-LyS1，将重组表达质粒导入转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，用质粒提取试剂盒提取重组质粒并进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶鉴定，37℃水浴孵育3h，1％琼脂糖电泳，同时用pET32a(+)空质粒作为对照；

(2)将双酶切鉴定正确的，将重组表达质粒导入转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将转化的菌液涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜；次日挑取阳性克隆接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，获得重组菌；

(3)将重组菌接种到含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1:100比例转接至100mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.3时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，20℃诱导20h；然后收集菌体，超声波破碎细胞，获得纯化后的裂解酶；

(4)将纯化后的裂解酶经去毒素试剂盒进行去毒处理，内处理后毒素≤0.01EU/μg，即获得所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶。

进一步，本发明所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶在防治葡萄球菌感染和污染中的应用。

进一步，本发明所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶在制备防治牛乳房炎药物中的应用

进一步，一种含有如本发明所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶用于防治牛乳房炎的药物。

本发明结合裂解酶及抗菌肽的优点，针对细菌细胞壁及细胞膜作为靶标进行杀菌，同时减小两者的劣势，将抗菌肽嵌合于葡萄球菌噬菌体裂解酶，用于防治多种葡萄球菌，该抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶可以单独或复配使用，或制备成酶制剂，用以防治由葡萄球菌引起的各种污染和感染，特别是奶牛养殖场中由葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染，具有极高的防治效果，且安全无毒副作用。

附图说明

图1为重组质粒pET32a-AP-LyS1酶切验证电泳图；

其中，泳道1：重组质粒pET32a-AP-LyS1-1Nde I和Xho I酶切验证；

泳道2：重组质粒pET32a-AP-LyS1-2Nde I和Xho I酶切验证；

泳道3：空载体pET32a Nde I和Xho I酶切对照。

图2为抗菌肽嵌合裂解酶AP-LyS1原核表达及纯化结果电泳图；

其中，泳道1.细菌裂解液浓缩10倍过柱前；

泳道2.细菌裂解液浓缩10倍过柱后；

泳道3.10mM咪唑洗涤流川；

泳道4.20mM咪唑洗涤流川；

泳道5.50mM咪唑洗涤流川；

泳道6.200mM咪唑洗脱流川；

泳道7.500mM咪唑洗脱流川；

泳道8.170KD marker。

图3:为AP-LyS1裂解速率测定结果示意图。

图4:为AP-LyS1裂解酶细胞毒性实验。

图5：AP-LyS1在原料乳中杀灭葡萄球菌菌株的污染实验

图6：病牛牛奶体细胞数变化结果示意图。

图7：病牛牛奶细菌数变化结果示意图。

具体实施方式

实施例中所使用的葡萄球菌：金黄色葡萄球菌标准菌种ATCC25923、CMCC26001本实验室购自美国菌种保藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心；以及本实验室分离鉴定保存菌种JYG1、JYG2、YZ-34、YZ-42、YZ-49、YZ-56、XG-9、XB-2、TQ1、TQ2、SF-37、SF-46、SF-54、SF-56、56A、MP0070、S4、S6；人表皮葡萄球菌975、987、999、S09099；溶血葡萄球菌(946)；产色葡萄球菌(S10165)；琥珀葡萄球菌(S07117)；模仿葡萄球菌(S09053)；

其它类型细菌标准菌种副伤寒沙门菌(ATCC 50073)、肠炎沙门菌(ATCC 13073)以及大肠杆菌(ATCC 25922)、无乳链球菌(BAA61)是由本实验室购自美国菌种保藏中心；

以及本实验室分离鉴定保存菌种沙门氏菌(S10177)；肺炎克雷伯(K10170)；肠球菌(29)；大肠杆菌(E10170)。

实施例涉及培养基的配制方法，下述配方提到的浓度均为终浓度:

LB平板配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，15g/L琼脂粉，最后用NaOH调节pH＝7.4，在15psi高压下蒸汽灭菌20min；10ml倒1个培养皿，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟后备用。

LB液体培养基配方：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，

氯化钠(NaCl)10g/L，最后用NaOH调节pH＝7.4，在15psi高压下蒸汽灭菌20min后备用。

TSB平板配方：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，以及占溶液总重1.2％的琼脂，最后用NaOH调节pH＝7.4，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，一般10ml倒1个培养皿，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟后备用。

TSB培养基配方：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，最后用NaOH调节pH＝7.4，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。

实施例1重组嵌合裂解酶AP-LyS1基因的克隆、表达载体的构建

(a)根据葡萄球菌细胞壁及细胞膜结构特点以及本研究室分离葡萄球菌烈性噬菌体JS25裂解酶基因序列设计嵌合裂解酶AP-LyS1基因，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示。

(b)将嵌合裂解酶AP-LyS1基因交由南京金斯瑞生物合成基因并进行亚克隆获得重组表达质粒pET32a-AP-LyS1，将重组表达质粒导入转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自天根生化科技有限公司，具体操作步骤按照产品说明书进行)，然后将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，用质粒提取试剂盒(广州东盛生物科技有限公司)提取重组质粒(具体操作按试剂盒说明进行)并进行NdeⅠ和XhoⅠ双酶鉴定(购自NEB公司，具体鉴定步骤依照操作说明配制50μl酶切反应体系)，37℃水浴孵育3h，1％琼脂糖电泳，同时用pET32a(+)空质粒作为对照，电泳结果如图1所示，图1中，泳道1和2均为重组质粒pET32a-AP-LyS1-1的Nde I和Xho I酶切验证结果，泳道3为空载体pET32a的Nde I和Xho I酶切对照，泳道4为marker。如图1所示，泳道1、2均在5.4kb和1kb处出现pET32a(+)载体带和AP-LyS1基因带，大小与预期相符，表明构建正确。

(c)将双酶切鉴定正确的质粒送交测序公司测序，将测序鉴定正确的质粒命名为pET32a-AP-LyS1，将质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞(天根生化有限公司产品，具体按操作说明进行)，将转化后的菌液涂布于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜；次日挑取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃培养过夜，重组菌命名为BL21(pET32a-AP-LyS1)。

实施例2嵌合裂解酶AP-LyS1蛋白的诱导表达及纯化

将重组菌BL21(pET32a-AP-LyS1)接种到含氨苄青霉素(50μg/mL)的4ml LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养；次日，按1:100比例转接至100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.3时，加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，20℃诱导20h；然后收集菌体，超声波破碎细胞(超声程序：工作3s,暂停3s,50％功率，超声总时间5min)；于4℃，10,000rpm离心10min，收集上清；然后将上清用His亲和层析镍柱(购自GE Healthcare,Sweden)纯化(具体步骤按试剂盒说明步聚进行)，将获得蛋白自命名为裂解酶AP-LyS1；

分析结果如图2所示，泳道1为细菌裂解液浓缩10倍过柱前，泳道2.细菌裂解液浓缩10倍过柱后，泳道3.10mM咪唑洗涤流川，泳道4.20mM咪唑洗涤流川，泳道5.50mM咪唑洗涤流川，泳道6.200mM咪唑洗脱流川，泳道7.500mM咪唑洗脱流川，泳道8.170KD marker；由图2可见，重组菌BL21(pET32a-AP-LyS1)经IPTG诱导后，其上清中在约50kD的位置有较粗的诱导蛋白条带，与预期大小相符；经过梯度浓度咪唑洗脱，在200mM咪唑洗脱流川中得到纯度较高的目的蛋白。从而表明，重组菌BL21(pET32a-AP-LyS1)构建正确，且表达的裂解酶蛋白产物AP-LyS1为可溶性蛋白。

将纯化后的裂解酶AP-LyS1产物经去毒素试剂盒(Novagen公司)进行去毒处理，处理后内毒素含量≤0.01EU/μg。

实施例3嵌合裂解酶AP-LyS1的杀菌谱的分析

将如下细菌：金黄色葡萄球菌ATCC25923、CMCC26001、JYG1、JYG2、YZ-34、YZ-42、YZ-49、YZ-56、XG-9、XB-2、TQ1、TQ2、SF-37、SF-46、SF-54、SF-56、56A、MP0070、S4、S6；表皮葡萄球菌975、987、999、S09099；溶血葡萄球菌(946)；产色葡萄球菌(S10165)；琥珀葡萄球菌(S07117)；模仿葡萄球菌(S09053)；无乳链球菌(BAA61)；沙门氏菌(S10177)；肺炎克雷伯(K10170)；肠球菌(29)；大肠杆菌(E10170)；

分别接入TSB培养基，37℃过夜培养，然后分别取0.1ml过夜培养物(菌含量10⁹cfu/ml)加入TSB平板中，

然后取实施例2获得的纯化后的裂解酶AP-LyS1产物(浓度100ug/ml)0.01mL滴于TSB平板正中央，将菌液均匀地涂开，37℃培养1h，正放待自然晾干后，分别置于37℃温箱培养10h后，观察裂解酶产物对不同宿主菌的裂解作用，结果如表1所示：

表1 AP-LyS1的裂菌谱鉴定

由表1可见，嵌合裂解酶产物仅对葡萄球菌有特异性裂解活性，而对其他种属菌株无反应。

实施例4：嵌合裂解酶AP-LyS1裂解金黄色葡萄球菌效果实验

设添加裂解酶和不添加裂解酶对照，向在PBS液体的金黄色葡萄球YZ34(OD₆₀₀＝1)(S.aureus)中添加实施例2获得的裂解酶AP-LyS1(终浓度1uM)，在0.5min、2.0min、5.0min、10.0min、15.0min、20.0min时分别取菌液1ml，测定细菌数目(CFU)及OD₆₀₀。

结果如图3所示，嵌合裂解酶在30秒内杀死85％的细菌可以做到快速杀菌；在5min内杀灭99％，杀菌完全。

实施例5:嵌合裂解酶液细胞毒性实验

以Caco-2细胞为例评价该裂解酶的安全性，将Caco-2细胞以每孔5×10³个的浓度接种到96孔板中，培养24小时后，分别向孔板中加入裂解酶AP-LyS1(终浓度分别为1mg/mL、10mg/mL和20mg/mL)以及阳性对照丝裂霉素C(终浓度15mg/mL)，继续培养24小时；培养结束后，向孔板中加入染色剂WST-8，静置后在酶标仪上读取450nm吸光值。所得到的结果见图4，图4中，1为PBS对照，2为丝裂霉素C(15mg/ml)，3为1mg/ml AP-LyS1，4为10mg/ml AP-LyS1，5为20mg/ml AP-LyS1

结果显示即使高浓度的AP-LyS1也无细胞毒性，而作为阳性对照的丝裂霉素显示了较高的细胞毒性。

实施例6：AP-LyS1在原料乳中控制葡萄球菌污染实验

将下述葡萄球菌：金黄色葡萄球菌YZ34、金黄色葡萄球菌TQ1、金黄色葡萄球菌JYG1、金黄色葡萄球菌S09099、溶血葡萄球菌(946)、产色葡萄球菌(S10165)、琥珀葡萄球菌(S07117)、模仿葡萄球菌(S09053)；

分别接种至4mlTSB培养基中(图5所示)过夜培养，离心收集后用PBS洗涤一次后，重悬于10ml奶牛场采集原料乳中(采集于南京某奶牛场)，然后加入实施例2获得的终浓度为0.1mg/ml的AP-LyS1，混合后在37℃放置30min，然后稀释平板计算其中的活菌数目。试验得到的杀灭效果见图5。结果显示AP-LyS1能在原料乳中快速抑杀多种葡萄球菌菌株、控制细菌污。

实施例7：裂解酶酶用于治疗金黄色葡萄球菌引发的奶牛乳房炎实验

在南京某奶牛场，选取10头已经确诊为主要由金黄色葡萄球菌引发的患奶牛乳房炎奶牛的泌乳期荷斯坦奶牛，在隔离区开展治疗试验(经乳汁细菌分离鉴定主要致病菌是金黄色葡萄球菌)。将牛随机分为两组，噬菌体实验组和对照组(不治疗组)，每组5头奶牛。

实验组牛用实施例2提供的纯化的裂解酶释液(终效价为10⁸pfu/mL)，在每天最后一次挤奶后每头牛每个乳区用裂解酶溶液进行乳房灌注10mL,，一个疗程5天，连续2个疗程；对照组灌注10mL PBS溶液，连续2个疗程。

结果发现：2个疗程后，实验组奶牛乳房红肿现象显著降低，乳汁颜色显著变浅，仪器检测(美国PORTASCC，SCC Digital Reader)体细胞数显著变少(图6)，而对照组出现增多现象。按国家标准GB4789.3-2010采用平板法检测细菌数目，如图7所述，对照组细菌数目增多，而试验组细菌数目显著减少(图7)，实验组5头奶牛乳房炎症状全部消失，治愈率100％。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶及其制备方法与应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atgggttgcc gtaaatggtg gaaattcaaa ttcaactgga aaatcctgcc gtggcgtcgt 60

tggtggaaat tcggtggtgg tggttctggt ggtggttctg ctaaaaccca ggctgaaatc 120

aacaaacgtc tggacgctta cgctaaaggt accgttgact ctccgtaccg tgttaaaaaa 180

gctacctctt acgacccgtc tttcggtgtt atggaagctg gtgctatcga cgctgacggt 240

tactaccacg ctcagtgcca gtgcctgtgc accgactacg ttctgtggct gaccgacaac 300

aaagttcgta cctggggtaa cgctaaagac cagatcaaac agtcttacgg taccggtttc 360

aaaatccacg aaaacaaacc gtctaccgtt ccgaaaaaag gttggatcgc tgttttcacc 420

tctggttctt acgaacagtg gggtcaccat ggcatcgtct acgacggggg taacacctct 480

accttcacca tcctggaacg taactggaac ggttacgcta acaaaaaacc gaccaaacgt 540

gttgacaact actacggtct gacccacttc atcgaaatcc cggttaaagc tggtaccacc 600

gttaaaaaag aaaccgctaa aaaatctgct tctaaaaccc cggctccgaa aaaaaaagct 660

accctgaaag tttctaaaaa ccacatcaac tacaccatgg acaaacgtgg taaaaaaccg 720

gaaggtatgg ttatccacaa cgacgctggt cgttctaccc cggctacccg tccggttacc 780

ggttcttgga aaaaattcca gtacggtacc tggtacaaac cggaaaactc taccttcgtt 840

aacggtaacc agccgatcgt tacctggatc ggttctccgt tcctgaacgc tccggttggt 900

ggtaacctgc cggctggcgc gaccatcgta taccgagaag tttgcatcca ggctggtcac 960

atctggatcg gttacaacgc ttacaacggc aatcgtgtat actgcccggt acgtacctgc 1020

cagggtgttc cgccgaacca gatcccgggt gttgcgtggg gtgtgttcaa ataa 1074

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Gly Cys Arg Lys Trp Trp Lys Phe Lys Phe Asn Trp Lys Ile Leu

1 5 10 15

Pro Trp Arg Arg Trp Trp Lys Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Ser Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala

35 40 45

Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Val Lys Lys Ala Thr Ser Tyr

50 55 60

Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly

65 70 75 80

Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Cys Leu Cys Thr Asp Tyr Val Leu Trp

85 90 95

Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile

100 105 110

Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser

115 120 125

Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr

130 135 140

Glu Gln Trp Gly His His Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser

145 150 155 160

Thr Phe Thr Ile Leu Glu Arg Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys

165 170 175

Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu

180 185 190

Ile Pro Val Lys Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys

195 200 205

Ser Ala Ser Lys Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val

210 215 220

Ser Lys Asn His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro

225 230 235 240

Glu Gly Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Thr Pro Ala Thr

245 250 255

Arg Pro Val Thr Gly Ser Trp Lys Lys Phe Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr

260 265 270

Lys Pro Glu Asn Ser Thr Phe Val Asn Gly Asn Gln Pro Ile Val Thr

275 280 285

Trp Ile Gly Ser Pro Phe Leu Asn Ala Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro

290 295 300

Ala Gly Ala Thr Ile Val Tyr Arg Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His

305 310 315 320

Ile Trp Ile Gly Tyr Asn Ala Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro

325 330 335

Val Arg Thr Cys Gln Gly Val Pro Pro Asn Gln Ile Pro Gly Val Ala

340 345 350

Trp Gly Val Phe Lys

355

Claims

1.一种抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶，其核苷酸序列如Seq ID NO.1所示，氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）利用嵌合裂解酶AP-LyS1基因与pET32a原核表达载体合成重组表达质粒，pET32a-AP-LyS1，将重组表达质粒导入转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布于含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜后，用质粒提取试剂盒提取重组质粒并进行Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶鉴定，37℃水浴孵育3 h，1%琼脂糖电泳，同时用pET32a(+)空质粒作为对照；

（2）将双酶切鉴定正确的重组表达质粒导入转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将转化的菌液涂布于含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜；次日挑取阳性克隆接种于含有50 μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，获得重组菌；

（3）将重组菌接种到含50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1:100比例转接至100mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.3时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，20℃诱导20 h；然后收集菌体，超声波破碎细胞，获得纯化后的裂解酶；

（4）将纯化后的裂解酶经去毒素试剂盒进行去毒处理，内处理后毒素≤0.01 EU/μg，即获得所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶。

3.如权利要求1所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶在抑制或杀灭原料乳内葡萄球菌中的应用。

4.如权利要求1所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶在制备防治牛乳房炎药物中的应用。

5.一种含有如权利要求1所述抗葡萄球菌的宽谱噬菌体嵌合裂解酶的药物。