CN112501189A

CN112501189A - 一种能杀死马链球菌马亚种的裂解酶及其医用用途

Info

Publication number: CN112501189A
Application number: CN202011598745.4A
Authority: CN
Inventors: 顾敬敏; 韩文瑜; 冀亚路; 董建宝; 朱伟
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-03-16

Abstract

本发明提供一种能杀死马链球菌马亚种的裂解酶及医用用途，提供了一个新的噬菌体裂解酶，可以单独或与其他物质复配使用，具有强裂解活性和较宽的裂解谱，能够有效杀灭马链球菌马亚种及猪链球菌，为预防和治疗由马链球菌马亚种及猪链球菌感染引起的疾病提供一种新的药物。

Description

一种能杀死马链球菌马亚种的裂解酶及其医用用途

技术领域

本发明公开了一个马链球菌马亚种裂解酶LysLF1，该裂解酶对马链球菌马亚种和猪链球菌均具有杀菌活性且具有较宽的裂解谱，属于生物工程技术领域。

背景技术

马链球菌马亚种（Streptococcus equi subspecies equi，S.equi）属于革兰氏阳性菌，在电子显微镜下观察，多成对或链状存在，单个的细菌为圆形，或卵圆形。革兰氏染色后观察呈紫色，5-10 个菌体形成长链，菌体细胞形成的长链与其长轴成直角，在营养匮乏的时候，菌体会成对存在。此外，该菌不能形成芽孢，不具有运动性，在特殊环境下会形成荚膜。马链球菌马亚种宿主为马属动物，传统认为主要感染马，驴骡次之，但近年随着规模化驴场的增加，驴发生腺疫的报道越来越多。马链球菌马亚种主要感染幼驹，2 月龄至 4 岁以下幼驹易感。患畜生发病后，首先会在脖子处出现肿胀，这是由于下颌部淋巴结肿大引起的，随着脓肿的不断增大，脓液会经鼻咽部，以黏脓性鼻液的形式排出体外，继发的炎症反应导致患畜升高。腺疫死亡率低，发病率高，传染性强，分布广泛，使得整个马产业投资增加，严重影响马产业发展，给马业造成了巨大的经济损失，并对世界范围内的马福利构成了相当大的威胁。目前尚缺乏预防和治疗腺疫的有效手段。针对马链球菌马亚种感染的治疗研究主要集中在疫苗研发和抗生素使用。但是根据国内外腺疫疫苗的研究结果表明，尚没有有效的疫苗能提供持久的保护力，免疫保护期均不超过 6 个月，且存在疫苗免疫的安全性问题。对腺疫的治疗方面仍以使用抗生素为主，这不可避免的将产生耐药菌增多、动物免疫机能降低等问题。因此，迫切需要寻找新的治疗途径和抗菌药物。

裂解酶是一种噬菌体编码的酶，在噬菌体裂解细菌的过程中发挥着重要的作用。裂解酶的作用靶点为细菌细胞壁中的肽聚糖，能够降解细菌细胞壁内的特异性键。由于革兰氏阴性菌的细胞壁外还有一层外膜结构，因此裂解酶很难在细菌外达到革兰氏阴性菌的细胞壁使细菌发生裂解。但是，革兰氏阳性菌的细胞壁外没有外膜包裹，这就为裂解酶直接在细菌外面直接杀灭细菌提供了可能性。这种酶代表了一类新型抗病原体感染的抗菌剂。利用裂解酶防治细菌感染有很多的优势。首先，裂解酶具有宿主特异性，一般情况下不会影响到人或动物的真核细胞和正常菌群。其次，裂解酶不需要经过噬菌体吸附、核酸注入、复制装配以及释放子代等过程，而是可以直接作用于细胞壁从而杀灭细菌，因此裂解酶具有更高的杀菌效率和更宽的裂解谱。此外，裂解酶是一种蛋白，利用裂解酶作为抗菌制剂更容易被大众接受。另外，与抗生素不同，细菌细胞壁的结构相对保守，对维持形态和生存是必需的，因此，细菌很难对裂解酶产生抗性，这使裂解酶成为防治马链球菌马亚种感染的潜在候选药物。

目前，关于马链球菌马亚种裂解酶鲜有报道。本实验室对一株马链球菌马亚种临床分离株进行全基因组测序，对测序结果进行分析注释后，找到疑似噬菌体裂解酶基因序列。将该序列在NCBI上进行比对进一步确定该序列与裂解酶序列具有极高相似性。随后对该序列进行载体构建并对该蛋白进行成功表达。将该裂解酶蛋白命名为LysLF1。进一步，我们测定了裂解酶LysLF1体外活性，结果表明该裂解酶对马链球菌马亚种和猪链球菌都具有裂解活性和宽宿主谱。为抗击马链球菌马亚种和猪链球菌感染提供一种潜在的替代药物。

发明内容

本发明公开一个从马链球菌马亚种基因组中表达的裂解酶LysLF1，该裂解酶不仅对马链球菌马亚种具有杀菌活性，对猪链球菌也有杀菌活性，为预防和治疗由马链球菌马亚种和猪链球菌感染引起的疾病提供一个很有潜力的新药物，具有很好的应用价值。

本发明提供了一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1，所述的裂解酶编码基因如：SEQ No.1所示。

本发明还提供了一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1编码基因的表达载体。

本发明进一步提供了一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1表达载体的重组菌株的构建。

本发明所述一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1的制备方法，其特征在于：

1）对裂解酶核苷酸序列进行引物设计，扩增裂解酶的引物为：

上游5'-CGGGATCCATGGCTACATATCAGGAATATAAAAGTC-3'；

下游5'-CGCTCGAGTTATACTTGTGTTGCATTAGAT-3'；

2）将裂解酶核苷酸序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；

3）将步骤1得到的重组质粒转入菌株，得到重组菌株；

4）利用重组菌株诱导表达该裂解酶；

5）进一步纯化步骤3得到的裂解酶。

本发明所述的一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1在裂解马链球菌马亚种和猪链球菌的用途。

本发明所述的一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1在制备用于预防和治疗马链球菌马亚种和猪链球菌引起的动物和人感染性疾病药物中的用途。

本发明一种预防和治疗由马链球菌马亚种和猪链球菌引起的感染性疾病的组合物，其包含来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1作为有效成分。

本发明所述的组合物，其特征在于，包括液体制剂、冻干制剂和固体制剂等医药学上的任何剂型。

本发明的积极效果在于：

提供了一个新的噬菌体裂解酶，可以单独或与其他物质复配使用，具有强裂解活性和较宽的裂解谱，能够有效杀灭马链球菌马亚种及猪链球菌，为预防和治疗由马链球菌马亚种及猪链球菌感染引起的疾病提供一种新的药物。

附图说明

图1. 裂解酶LysLF1的表达与纯化；

图2. 裂解酶LysLF1形成的抑菌空斑；

图3. 裂解酶LysLF1体外杀菌活性测定；

表1. 裂解酶LysLF1裂解谱测定。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1

裂解酶的表达与纯化

扩增裂解酶LysLF1的引物为：

上游5'-CGGGATCCATGGCTACATATCAGGAATATAAAAGTC-3'；

下游5'-CGCTCGAGTTATACTTGTGTTGCATTAGAT-3'；

将扩增的LysLF1基因通过特异性酶切位点XhoI和BamHI连接到Pet28a载体上，构建表达载体pET28a-LysLF1。将构建好的载体转入到大肠杆菌BL21感受态中，在500 mL新鲜LB培养基中进行扩增，同时加入1/1000的硫酸卡那霉素，待菌液OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，加入1/1000的IPTG（终浓度1 mM）进行诱导，诱导温度为16℃，诱导时间16 h。

利用Ni-NTA对蛋白进行亲和层析纯化：将诱导后的菌液进行集菌（4℃，10000 ×g，20min），并用适量Tris-Cl缓冲液（pH=7.5）进行重悬，取80 µ L全菌样品，其余冰浴超声破碎后离心（8000 ×g，30min），留取上清液，取80 µ L上清样品。将其余上清样品过Ni柱，使蛋白与Ni进行结合，随后先分别利用含有20 mM和50 mM咪唑的Tris-Cl缓冲液洗脱杂蛋白，最后用含500 mM咪唑的Tris-Cl缓冲液洗脱目的蛋白。收集洗脱液后经超滤得到纯化的裂解酶LysLF1。使用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的裂解酶LysLF1进行浓度测定。将全菌，上清及纯化后蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析。

结果如图1所示，1、2、3孔分别代表裂解酶LysLF1全菌、上清以及纯化后样品，纯化后的裂解酶LysLF1纯度很高。

SDS-PAGE胶配方如下：

SDS-PAGE分离胶（12%）

溶液成分	体积（mL）
		ddH<sub>2</sub>O	3.3
30%丙烯酰胺	4.0
		1.5 mol/L Tris·HCl（pH8.8）	2.5
10％SDS	0.1
		10％过硫酸胺（AP）	0.1
TEMED	0.004

SDS-PAGE浓缩胶

溶液成分	体积（mL）
		ddH<sub>2</sub>O	6.8
30%丙烯酰胺	1.7
		1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）	1.25
10％SDS	0.1
		10％过硫酸胺（AP）	0.1
TEMED	0.01

实施例2

裂解酶LysLF1固体平板抑菌能力测定

超净台内将对数生长期的马链球菌马亚种3518均匀涂布于BHI固体培养基平板上，晾干后将10 µ L纯化后的裂解酶LysLF1滴于平板上并作标记。另外，将10 µ L的Tris-Cl缓冲液滴于平板上作为对照。将平板放置37℃恒温箱中过夜培养，次日观察抑菌环的形成情况。

结果如图2所示，在标记处出现透亮空斑，表明裂解酶LysLF1对马链球菌马亚种具有裂解活性。

实施例3

裂解酶LysLF1体外杀菌活性测定

将马链球菌马亚种3518培养至对数生长期，用Tris-Cl缓冲液洗涤三次后重悬，并将OD₆₀₀值调至0.6左右。阳性对照设置两组，LysLF1处理组加入单剂量终浓度为100 µ g/mL的LysLF1。LysLF1*处理组每10min加入终浓度为100 µ g/mL的裂解酶LysLF1，连续加入3次。阴性对照组加入等体积的Tris-Cl缓冲液。三组同时放入37℃水浴锅中孵育，每隔10min取样，倍比稀释进行菌落计数，实验进行60 min，重复三次。

结果如图3所示，阴性对照组60 min后菌落数基本保持不变，单剂量裂解酶LysLF1和多剂量LysLF1处理组菌落数显著减少，多剂量裂解酶LysLF1处理组比单剂量LysLF1在各时间段菌落数减少更多。

实施例4

裂解酶LysLF1裂解谱测定

将20株马链球菌马亚种、12株猪链球菌以及10株金黄色葡萄球菌、10株表皮葡萄球菌、10株大肠杆菌，10株沙门氏菌，10株枯草芽孢杆菌，10株粘质沙雷菌以及10株肺炎克雷伯菌分别培养至对数期（OD₆₀₀=0.6），离心后用无菌Tris-Cl缓冲液洗涤三次，并将菌落数调至1*10⁸CFU/mL左右，加入终浓度为20 µ g/mL裂解酶LysLF1，对照组加入等体积的Tris-Cl缓冲液，放置37℃水浴锅孵育，60 min后进行菌落计数，重复三次。

结果如表1所示，LysLF1对20株马链球菌马亚种均具有裂解活性，此外，对3株猪链球菌同样具有裂解活性。对其他阳性和阴性菌株无裂解活性。

表1，

本发明经构建表达后的裂解酶LysLF1对马链球菌马亚种和猪链球菌均具有杀菌活性，并且对马链球菌马亚种具有宽宿主谱。鉴于此，该裂解酶可用于有效预防和治疗由马链球菌马亚种及猪链球菌感染引起的疾病。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种能杀死马链球菌马亚种的裂解酶及医用用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> LysLF1核苷酸序列(LysLF1核苷酸序列)

<400> 2

atggctacat atcaggaata taaaagtcgt tcaaatggca atgcttacga tattgatgga 60

tcgcttggtg cgcaatgttg ggatggctac gcagactact gtaagtatct aggactgcca 120

tacgcaaact gtacaaatac aggatatgca agggatatat gggaacaacg tcacaaaaat 180

ggtattttaa actactttga cgaagtagag actatgcaag ctggagatgt cgcaattttt 240

atggtagttg caggtgttac accgtatagc catgtggcta tttttgatag tgatgcaggt 300

agtggatacg gatggttttt aggtcaaaac cagggtggag caaacggagc atataattta 360

gtaaaaatac catattcaac gacttatcct actgcattta gaccaaaagt ttttaaaaat 420

gcagttactg ttataggtaa tataggacta aataaaggcg attattttat tgatgtatca 480

gcttatcaac aagcagactt aaccgctact tgtcagcaag ctggcactac taaaacgatt 540

atcaaagtat ccgagtcact cgcttggctg tctgataggc atcagcaaca agctaatact 600

agtgacccta ttggttatta tcactttgga cgatttggag gagatagcaa cttagcgcaa 660

cgagaagcag atttatttct gtccaattta ccaaccaaaa aagtctctta cttagtcatt 720

gattatgaag actctgcaag tgccgacaaa gaagctaaca ctaatgcagt tattgcgttt 780

atggataaaa ttgcaaacgc tggatataag cctgtttatt acagctataa accatttacg 840

cttaataata ttgattatca gcaaattatc gctaagtacc caaacagcat ttggatagct 900

ggttatccag actacgaagt acgaacagag ccactttggg agttcttccc ttcaatggat 960

ggtgtgcgct ggtggcagtt cacaagtgta ggagtagcag gtggtttaga taaaaatatt 1020

gtattattag cagatgatag tagcaaagtg gatataccta agattgacaa accacaaagc 1080

cagcttactt ttaatcaaaa gctagatact aacactaaat tagacaactc gaatgtacct 1140

tactacgaag caacccttag cacagactat tatgtagagt ctaagccaaa cgcaagtagc 1200

gctgataaag aatttatcaa ggcaggaact cgtgtaagag tctatgaaaa agtgaatgga 1260

tggtcacgta ttaacgcttc tcagtctgac cagtgggtcg aagataagta tttatctaat 1320

gcaacacaag tataa 1335

Claims

1.一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1，所述的裂解酶编码基因如：SEQ No.1所示。

2.一种包含权利要求书1所述的一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1编码基因的表达载体。

3.一种包含权利要求书1所述一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1表达载体的重组菌株的构建。

4.如权利要求1所述一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1的制备方法，其特征在于扩增裂解酶LysLF1的引物序列如下：

上游5'-CGGGATCCATGGCTACATATCAGGAATATAAAAGTC-3'；

下游5'-CGCTCGAGTTATACTTGTGTTGCATTAGAT-3'。

5.如权利要求1所述一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1的制备方法，步骤如下：

1）对权利要求书2所述的裂解酶核苷酸序列进行引物设计，扩增裂解酶的引物为：

上游5'-CGGGATCCATGGCTACATATCAGGAATATAAAAGTC-3'；

下游5'-CGCTCGAGTTATACTTGTGTTGCATTAGAT-3'；

2）将权利要求书2所述的裂解酶核苷酸序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；

3）将步骤1得到的重组质粒转入菌株，得到重组菌株；

4）利用重组菌株诱导表达该裂解酶；

5）进一步纯化步骤3得到的裂解酶。

6.如权利要求1所述的一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1在裂解马链球菌马亚种和猪链球菌的用途。

7.如权利要求1所述的一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1在制备用于预防和治疗马链球菌马亚种和猪链球菌引起的动物和人感染性疾病药物中的用途。

8.一种预防和治疗由马链球菌马亚种和猪链球菌引起的感染性疾病的组合物，其包含权利要求1所述的一种来源于马链球菌马亚种裂解酶LysLF1作为有效成分。

9.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，包括液体制剂、冻干制剂和固体制剂等医药学上的任何剂型。