CN115074348B - 一种广谱嵌合裂解酶ClyL、编码基因、重组载体、重组菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种广谱嵌合裂解酶ClyL、编码基因、重组载体、重组菌及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种广谱嵌合裂解酶ClyL、编码基因、重组载体、重组菌及其制备方法和应用，本发明通过将LysGH15的催化域CHAP和Lys0859的细胞壁结合域SH3b进行嵌合得到广谱嵌合裂解酶ClyL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述广谱嵌合裂解酶ClyL具有裂解包括链球菌和葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌的广谱性优点，且裂解效率较高，同时可防治奶牛乳房炎和链球菌病。

Description

一种广谱嵌合裂解酶ClyL、编码基因、重组载体、重组菌及其 制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种广谱嵌合裂解酶ClyL、编码基因、重组载体、重组菌及其制备方法和应用。
背景技术
链球菌和葡萄球菌均是重要的人畜共患传染病病原体，其感染可致脑膜炎、菌血症、心内膜炎和关节炎等症状。其中金黄色葡萄球菌，无乳链球菌、停乳链球菌是在奶牛乳腺内部定植的主要病原菌，而乳房链球菌和包括产色葡萄球菌在内的葡萄球菌属细菌是附着在乳房表面而导致奶牛乳房炎主要的病原菌，这些病原菌感染给奶牛养殖业带来巨大的损失。目前，治疗奶牛乳房炎主要还是依赖抗生素，但随着抗生素的滥用，致病菌对抗生素的耐药性逐渐增强，使得治疗由耐药菌引起的奶牛乳房炎越来越困难。除此之外，使用抗生素治疗费用昂贵并且抗生素在奶制品中残留会严重影响人类的健康。因此，迫切需要新的方式，以控制多重耐药致病菌引起的奶牛乳房炎。
噬菌体裂解酶(lysin)是双链DNA噬菌体在侵入宿主菌后期产生的一种细胞壁水解酶。革兰氏阳性菌裂解酶具有模块化的结构，一般由一至两个催化域和一个结合域组成。裂解酶催化域负责水解肽聚糖，其结合域负责识别细菌细胞壁上的相关受体。因此，结合裂解酶结构上的特点，将来自不同裂解酶的结构域进行组合形成嵌合裂解酶可能有助于提升裂解酶的杀菌活性、裂解谱和表达量。
噬菌体裂解酶具有高效特异的杀菌活性，且不会诱导细菌产生耐受，是替代抗生素的一种新型方案。但裂解酶一般只能裂解同种属的细菌，不能解决像奶牛乳房炎这种多种细菌混合感染的疾病。因此，开发出新型具有广谱裂解活性的嵌合裂解酶对于奶牛乳房炎这类多细菌混合感染的疾病有很重要的意义，同时也为未来实现“无抗养殖”打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种广谱嵌合裂解酶ClyL、编码基因、重组载体、重组菌及其制备方法和应用，所述广谱嵌合裂解酶ClyL可以广谱快速裂解包括链球菌和葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌，且表达量高，活性稳定。
本发明提供了一种广谱嵌合裂解酶ClyL，所述广谱嵌合裂解酶ClyL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组载体，所述重组载体包括所述广谱嵌合裂解酶ClyL的编码基因和初始载体。
优选的，所述初始载体包括pET28a质粒载体。
本发明还提供了一种表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组菌，包括上述技术方案所述的重组载体和大肠杆菌。
本发明还提供了一种广谱嵌合裂解酶ClyL的制备方法，包括如下步骤：
将上述技术方案所述的重组菌于IPTG诱导培养基中诱导培养16～18h，将得到的菌体破碎，离心和过滤，将得到的裂解上清液纯化，得到所述广谱嵌合裂解酶ClyL。
本发明还提供了上述技术方案所述的广谱嵌合裂解酶ClyL、编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因、重组载体、重组菌或上述技术方案所述的制备方法制备得到的广谱嵌合裂解酶ClyL在制备裂解革兰氏阳性菌的药物中的应用。
优选的，所述革兰氏阳性菌包括链球菌和/或葡萄球菌。
优选的，所述链球菌包括猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌中的一种或多种；
所述葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌、溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌中的一种或多种。
本发明还提供了一种防治奶牛乳房炎和/或链球菌的药物，所述药物的活性成分包括上述技术方案所述的广谱嵌合裂解酶ClyL、编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因、重组载体、重组菌和上述技术方案所述的制备方法制备得到的广谱嵌合裂解酶ClyL中的任意一种或多种。
有益效果：
本发明提供了一种广谱嵌合裂解酶ClyL，本发明通过将LysGH15的催化域CHAP和Lys0859的细胞壁结合域SH3b进行嵌合得到广谱嵌合裂解酶ClyL，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述广谱嵌合裂解酶ClyL具有裂解包括链球菌和葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌的广谱性优点，且裂解效率较高，同时可防治奶牛乳房炎和链球菌病；
其次，所述广谱嵌合裂解酶ClyL可以在大肠杆菌中可溶性表达，表达量高，活性稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为PCR扩增ClyL的结果，M为DL2000 DNAmarker，1为ClyL片段，大小为807bp；2为LysGH15 CHAP 2片段，大小为495bp；
图2为广谱嵌合裂解酶ClyL和LysGH15 CHAP的SDS-PAGE图，M为EpiZyme WJ03Marker，1为纯化的pET28a-ClyL蛋白，蛋白大小约为34kDa，2为纯化的pET28a-LysGH15CHAP蛋白，蛋白大小约为18kDa；
图3为广谱嵌合裂解酶ClyL和LysGH15 CHAP在体外裂解链球菌的结果图；
图4为广谱嵌合裂解酶ClyL在体外裂解链球菌和葡萄球菌广谱性结果图；
图5为广谱嵌合裂解酶ClyL在体外裂解金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213的时间变化结果图；
图6为广谱嵌合裂解酶ClyL在体外裂解无乳链球菌标准菌株ATCC13813的时间变化结果图；
图7为广谱嵌合裂解酶ClyL在体外清除生物被膜的结果图；
图8为广谱嵌合裂解酶ClyL在小鼠体内裂解无乳链球菌标准菌株的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种广谱嵌合裂解酶ClyL，所述广谱嵌合裂解酶ClyL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体序列如下：MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGGSSGSDSTAVATQSSSGNLGKVKDEQGTMTVKVSLLNVRDKPGLDGKVVATYTNSEQFNYDSVYIADGYIWVSYVSRSGVRRYVAAGEESNRRNVVPYGIFK。
本发明所述广谱嵌合裂解酶ClyL优选由噬菌体裂解酶LysGH15的催化域CHAP和猪链球菌Lys0859的细胞壁结合域SH3b嵌合组成。本发明所述噬菌体裂解酶LysGH15的催化域CHAP的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.3所示，具体序列为：MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKA；所述猪链球菌Lys0859的细胞壁结合域SH3b的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4所示，具体序列为：DSTAVATQSSSGNLGKVKDEQGTMTVKVSLLNVRDKPGLDGKVVATYTNSEQFNYDSVYIADGYIWVSYVSRSGVRRYVAAGEESNRRNVVPYGIFK；连接所述噬菌体裂解酶LysGH15的催化域CHAP和猪链球菌Lys0859的细胞壁结合域SH3b的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.5所示，具体为GGSSGS，所述SEQ ID NO.5序列不仅可以连接两个结构域，且可以使两个结构域不相互影响。本发明优选采用重叠延伸PCR技术将所述噬菌体裂解酶LysGH15的催化域CHAP和猪链球菌Lys0859的细胞壁结合域SH3b连接形成所述广谱嵌合裂解酶ClyL。
本发明还提供了一种编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；具体序列如下：5’-ATGGCAAAAACACAAGCTGAAATAAATAAGCGCCTGGATGCGTACGCGAAAGGTACAGTGGACAGCCCGTATCGTATTAAAAAGGCTACCTCCTACGACCCGTCGTTCGGCGTGATGGAAGCGGGTGCAATTGACGCGGATGGCTACTACCATGCACAGTGCCAGGATCTGATCACCGATTATGTGCTGTGGCTGACCGATAACAAAGTTCGTACCTGGGGCAACGCGAAGGACCAAATCAAGCAAAGCTACGGCACTGGTTTTAAAATCCACGAAAACAAGCCAAGCACGGTGCCGAAAAAGGGCTGGATTGCTGTCTTCACGAGCGGTTCTTACCAGCAATGGGGTCATATTGGTATTGTTTATGACGGCGGTAACACCTCCACCTTCACCATCTTGGAGCAGAATTGGAATGGTTATGCCAATAAGAAGCCGACCAAACGTGTTGACAACTATTACGGCTTGACCCACTTTATCGAGATCCCGGTTAAAGCCGGAGGCTCGTCTGGATCGGACTCTACTGCAGTGGCAACACAGTCAAGCAGTGGCAATCTCGGTAAGGTCAAAGACGAGCAGGGGACAATGACCGTTAAAGTATCTTTGCTCAATGTCCGAGACAAGCCTGGTTTAGACGGTAAAGTTGTGGCAACGTACACGAATAGCGAGCAGTTTAATTATGATTCGGTCTATATTGCCGATGGATACATTTGGGTATCGTATGTTAGCCGTAGCGGTGTACGTCGCTATGTAGCAGCAGGCGAGGAATCAAACCGTCGCAATGTTGTGCCTTATGGTATTTTCAAA-3’。
本发明还提供了一种表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组载体，所述重组载体包括所述广谱嵌合裂解酶ClyL的编码基因和初始载体。本发明所述初始载体优选包括pET28a质粒载体，所述广谱嵌合裂解酶ClyL的编码基因的插入位点优选位于所述pET28a质粒载体的BamHI和HindIII酶切位点之间。本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规重组载体制备方法即可。
本发明还提供了一种表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组菌，包括上述技术方案所述的重组载体和大肠杆菌。本发明优选将所述表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组载体转入到大肠杆菌中获得所述表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组菌。本发明所述大肠杆菌优选包括大肠杆菌BL21(DE3)。本发明对所述大肠杆菌的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。
本发明还提供了一种广谱嵌合裂解酶ClyL的制备方法，包括如下步骤：
将上述技术方案所述的重组菌于IPTG诱导培养基中诱导培养16～18h，将得到的菌体破碎，离心和过滤，将得到的裂解上清液纯化，得到所述广谱嵌合裂解酶ClyL。
本发明将所述重组菌于IPTG诱导培养基中培养之前，优选还包括将所述重组菌进行活化培养和扩大培养，得到重组菌液。本发明优选将所述重组菌进行活化，所述活化培养的培养基优选为含卡那青霉素的LB液体培养基，所述卡那青霉素的浓度优选为50～100μg/mL，更优选为100μg/mL。本发明所述活化培养优选为振荡培养，所述振荡培养的温度优选为35～37℃，更优选为37℃；所述振荡培养的转速优选为180～220rpm，更优选为220rpm；所述振荡培养优选为过夜培养。
完成所述活化培养后，本发明优选将活化培养得到的菌液转至LB液体培养基中进行扩大培养，得到重组菌液。本发明所述活化培养得到的菌液与LB液体培养基的体积比优选为(0.8～1.0)：(80～100)，更优选为1：100。本发明所述扩大培养优选为振荡培养，所述振荡培养的，所述振荡培养的温度优选为35～37℃，更优选为37℃；所述振荡培养的转速优选为180～220rpm，更优选为220rpm。本发明优选将所述活化培养得到的菌液扩大培养至OD600为0.4～0.6时，更优选为0.6时，得到所述重组菌液。
得到所述重组菌液后，本发明将所述重组菌液于IPTG诱导培养基中诱导培养16～18h，得到诱导培养菌液。本发明所述IPTG诱导培养基优选为将所述重组菌液与IPTG混合而成，所述IPTG的浓度优选为0.2～1.0mmol/L，更优选为0.8mmol/L。本发明所述诱导培养的时间优选为18h；所述诱导培养的温度优选为15～17℃，更优选为16℃。
得到所述诱导培养菌液后，本发明将收集的菌体破碎，离心和过滤，取上清，得到裂解上清液。本发明对所述收集菌体的方式没有特殊限定，采用本领域常规收集方式即可。本发明优选采用超声波进行菌体破碎。本发明对所述超声波的具体参数没有特殊限定，采用本领域常规参数即可。本发明所述离心的温度优选为4～10℃，更优选为4℃；所述离心的转速优选为6000～10000rpm，更优选为10000rpm时间优选为15～30min，更优选为20min。本发明优选采用滤膜进行过滤，所述滤膜的孔径优选为0.22～0.45μm，更优选为0.22μm。
得到裂解上清液后，本发明将所述上清液纯化，得到所述广谱嵌合裂解酶ClyL。进行所述纯化前，本发明优选还包括采用SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表达情况，本发明对所述SDS-PAGE的具体过程没有特殊限定，采用本领域中常规过程即可。本发明优选采用His亲和层析镍柱进行所述纯化。本发明对所述纯化的过程没有特殊限定，采用本领域常规纯化过程即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的广谱嵌合裂解酶ClyL、编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因、重组载体、重组菌或上述技术方案所述的制备方法制备得到的广谱嵌合裂解酶ClyL在制备裂解革兰氏阳性菌的药物中的应用。本发明所述革兰氏阳性菌优选包括链球菌和葡萄球菌；所述链球菌优选包括猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌中的一种或多种，更优选包括猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌；所述葡萄球菌优选包括金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌、溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌中的一种或多种，更优选包括金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌、溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌。本发明所述广谱嵌合裂解酶ClyL对包括链球菌和葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌均具有裂解活性，广谱裂解活性较好；并且值得说明的是，与LysGH15 CHAP相比，所述广谱嵌合裂解酶ClyL对链球菌的裂解效率和裂解谱得到了有效提升和扩大，可用于制备用于防治由包括链球菌和葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌所引起的疾病的药物，如由链球菌和葡萄球菌混合感染引起的奶牛乳房炎。
本发明还提供了一种防治奶牛乳房炎和/或链球菌的药物，所述药物的活性成分包括上述技术方案所述的广谱嵌合裂解酶ClyL、编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因、重组载体、重组菌和上述技术方案所述的制备方法制备得到的广谱嵌合裂解酶ClyL中的任意一种或多种。本发明所述药物优选包括奶牛乳房炎和链球菌病。本发明所述药物优选还包括药学上可接受的辅料。本发明对所述辅料的类型和来源没有特殊限定，采用本领域常规类型和来源的辅料即可。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，本领域常规剂型均可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明所使用的试剂、菌株和设备，如无特殊说明，均可市售获得。本发明下述实施例，如无特别说明，均是常规的实验方法；所用的引物、测序工作和序列合成均在北京擎科生物科技有限公司完成。
在下述实施例中所用到的菌株的拉丁名称与中文名称对照如下表：
实施例1
广谱嵌合裂解酶ClyL的表达与纯化
1.1表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组表达载体的构建
1.1.1LysGH15的催化域CHAP、Lys0859的细胞壁结合域SH3b的制备
噬菌体裂解酶LysGH15全基因片段来自金黄色葡萄球菌噬菌体GH15全基因组(GenBank accession number：NC_019448)，Lys0859的全基因组片段来自猪链球菌S.suis0859全基因组(GenBank accession number：PONU00000000)；将合成的裂解酶LysGH15全基因片段序列连接在pET28a载体上。以LysGH15基因为模板，分别以LysGH15CHAP-F和LysGH15CHAP-R1以及LysGH15CHAP-F和LysGH15CHAP-R2为引物，扩增得到LysGH15的催化域CHAP 1和LysGH15的催化域CHAP 2，以猪链球菌S.suis 0859全基因组为模板，以Lys0859SH3b-F和Lys0859SH3b-R为引物，扩增得到Lys0859的结合域SH3b。需要说明的是，在本发明中，LysGH15 CHAP 1和LysGH15 CHAP 2两条序列的区别在于序列的C端，LysGH15CHAP 1的C端是linker(GGSSGS)是用来与Lys0859的结合域SH3b片段连接从而得到嵌合裂解酶ClyL，LysGH15CHAP 2的C端是HindIII酶切位点，目的是将LysGH15CHAP构建到pET28a载体上进行蛋白表达。
在本发明中，所述LysGH15 CHAP 1的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.11所示，具体为MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGGSSGS；编码所述LysGH15 CHAP 1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.12所示，具体为5’-ATGGCAAAAACACAAGCTGAAATAAATAAGCGCCTGGATGCGTACGCGAAAGGTACAGTGGACAGCCCGTATCGTATTAAAAAGGCTACCTCCTACGACCCGTCGTTCGGCGTGATGGAAGCGGGTGCAATTGACGCGGATGGCTACTACCATGCACAGTGCCAGGATCTGATCACCGATTATGTGCTGTGGCTGACCGATAACAAAGTTCGTACCTGGGGCAACGCGAAGGACCAAATCAAGCAAAGCTACGGCACTGGTTTTAAAATCCACGAAAACAAGCCAAGCACGGTGCCGAAAAAGGGCTGGATTGCTGTCTTCACGAGCGGTTCTTACCAGCAATGGGGTCATATTGGTATTGTTTATGACGGCGGTAACACCTCCACCTTCACCATCTTGGAGCAGAATTGGAATGGTTATGCCAATAAGAAGCCGACCAAACGTGTTGACAACTATTACGGCTTGACCCACTTTATCGAGATCCCGGTTAAAGCCGGAGGCTCGTCTGGATCG-3’；所述LysGH15 CHAP 2的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.13所示，具体为GSMAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDADGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHENKPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNGYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAFE；编码所述LysGH15 CHAP 1的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.14所示，具体为5’-ATGGCAAAAACACAAGCTGAAATAAATAAGCGCCTGGATGCGTACGCGAAAGGTACAGTGGACAGCCCGTATCGTATTAAAAAGGCTACCTCCTACGACCCGTCGTTCGGCGTGATGGAAGCGGGTGCAATTGACGCGGATGGCTACTACCATGCACAGTGCCAGGATCTGATCACCGATTATGTGCTGTGGCTGACCGATAACAAAGTTCGTACCTGGGGCAACGCGAAGGACCAAATCAAGCAAAGCTACGGCACTGGTTTTAAAATCCACGAAAACAAGCCAAGCACGGTGCCGAAAAAGGGCTGGATTGCTGTCTTCACGAGCGGTTCTTACCAGCAATGGGGTCATATTGGTATTGTTTATGACGGCGGTAACACCTCCACCTTCACCATCTTGGAGCAGAATTGGAATGGTTATGCCAATAAGAAGCCGACCAAACGTGTTGACAACTATTACGGCTTGACCCACTTTATCGAGATCCCGGTTAAAGCCTTCGAA-3’。
载体构建过程中用到的引物和酶切位点如下：
LysGH15CHAP-F：5’-GGATCCATGGCAAAAACACAAGCTGA-3’(SEQ ID NO.6)；
LysGH15CHAP-R1：5’-CGATCCAGACGAGCCTCCGGCTTTAACCGGGATC-3’(SEQ ID NO.7)；
LysGH15CHAP-R2：5’-AAGCTTGGCTTTAACCGGGATC-3’(SEQ ID NO.8)；
Lys0859SH3b-F：5’-GGAGGCTCGTCTGGATCGGACTCTACTGCAGTGGCA-3’(SEQ IDNO.9)；
Lys0859SH3b-R：5’-AAGCTTTTATTTGAAAATACCATAAGGC-3’(SEQ ID NO.10)；
在引物LysGH15CHAP-F的5’端设置BamHI限制性酶切位点，在引物LysGH15CHAP-R2的5’端设置HindIII限制性酶切位点，在引物Lys0859SH3b-R的5’端设置HindIII限制性酶切位点。
扩增上述片段步骤如下：
扩增体系：模板2μL，10μM引物各2.5μL，Primerstar 2x Mix为25μL，总体系50μL，用ddH2O补齐50μL。
扩增条件：98℃预变性10min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸25s，30个循环；72℃延伸5min。
反应结束后，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、验证基因大小正确后，通过胶回收试剂盒纯化回收基因片段，结果见图1，其中M为DL2000 DNA marker，1为ClyL片段，大小为807bp；2为LysGH15 CHAP 2片段，大小为495bp。
1.1.2表达广谱嵌合裂解酶ClyL和裂解酶LysGH15的催化域CHAP的重组表达载体的构建
以1.1中回收的LysGH15CHAP 1片段和Lys0859SH3b片段为模板，以LysGH15CHAP-F和Lys0859SH3b-R为引物，通过重叠延伸PCR技术(genesplicing by overlap extensionPCR，SOE PCR)将LysGH15CHAP 1片段和Lys0859SH3b片段连接在一起，具体步骤如下：
扩增体系：LysGH15CHAP 1片段和Lys0859SH3b片段作为模板各1μL，10μM引物各2.5μL，Primerstar 2x Mix为25μL，总体系50μL，用ddH2O补齐50μL。
扩增条件：98℃预变性10min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸25s，30个循环；72℃延伸5min。
反应结束后，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、验证基因大小正确后，使用BamHI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶进行双酶切，37℃，水浴孵育2h，1％琼脂糖电泳，胶回收试剂盒将片段纯化回收，并将该片段与pET28a载体于16℃连接过夜，得到重组表达载体pET28a-ClyL，次日转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将转化的菌液涂布于含有卡那霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜；挑选阳性克隆子，进行测序验证。
1.1.3表达裂解酶LysGH15的催化域CHAP的重组表达载体的构建
以1.1中回收的LysGH15CHAP 2片段为模板，使用BamHI限制性内切酶和HindIII限制性内切酶进行双酶切，37℃，水浴孵育2h，1％琼脂糖电泳，胶回收试剂盒将片段纯化回收，并将该片段与pET28a载体于16℃连接过夜，得到重组表达载体pET28a-LysGH15 CHAP，次日转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。将转化的菌液涂布于含有卡那霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜；挑选阳性克隆子，进行测序验证。
1.2广谱嵌合裂解酶ClyL和裂解酶LysGH15的催化域CHAP的诱导表达与纯化
将重组菌BL21(DE3)(pET28a-ClyL)和BL21(DE3)(pET28a-LysGH15 CHAP)接种到含卡那青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37℃振荡过夜培养；次日，按1：100的体积比转接至1000mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD600值约为0.6时，加入IPTG至终浓度0.8mmol/L，16℃诱导16-18h。收集菌体，超声波破碎细胞，4℃，10000rpm/min离心20min，收集上清，并将上清经0.22μm滤膜过滤，SDS-PAGE分析裂解上清中的蛋白表达情况。将过滤的裂解上清用His亲和层析镍柱(GE Healthcare,Sweden)纯化。
SDS-PAGE分析结果如图2所示，重组菌BL21(DE3)(pET28a-ClyL)和BL21(DE3)(pET28a-LysGH15 CHAP)经IPTG诱导表达后，重组菌BL21(DE3)(pET28a-ClyL)上清在约34kD处有目的蛋白条带，重组菌BL21(DE3)(pET28a-LysGH15 CHAP)其上清在约18kD处有目的蛋白条带。由此表明，重组菌BL21(DE3)(pET28a-ClyL)和BL21(DE3)(pET28a-LysGH15CHAP)构建正确，且表达的裂解酶蛋白产物ClyL和LysGH15 CHAP为可溶性蛋白。
实施例2
广谱嵌合裂解酶ClyL和LysGH15 CHAP在体外裂解链球菌的结果
将多种不同的链球菌(如图3横坐标所示)培养至对数期(OD600＝0.6)，低温离心(4℃，6000rpm/min)收集沉淀，用PBS清洗两次后用PBS重悬，得到不同菌株菌液。取实施例1中广谱嵌合裂解酶ClyL和裂解酶LysGH15的催化域CHAP各100μL分别与100μL上述菌液混合，使得广谱嵌合裂解酶ClyL和LysGH15 CHAP终浓度均为50μg/mL，体系OD600nm＝0.6～0.8。
同时以等量PBS和上述菌液的混合液作为阴性对照，37℃孵育30min后测定OD600nm，重复三次，浊度下降比率通过以下公式计算得到：(对照组OD600-实验组OD600)/对照组OD600。得到的结果见图3。
由图3的结果可以看出，浓度为50μg/mL的广谱嵌合裂解酶ClyL能使链球菌的浊度下降31.7～55.4％。然而，其亲本裂解酶LysGH15的催化域CHAP对链球菌的浊度下降全部在10％以下。结果表明，嵌合裂解酶ClyL提升了亲本LysGH15 CHAP对链球菌的裂解效率。
实施例3
广谱嵌合裂解酶ClyL在体外裂解链球菌和葡萄球菌的广谱性结果
将多种不同的链球菌和葡萄球菌(见图4)培养至对数期(OD600＝0.6)，低温离心(4℃，6000rpm/min)收集沉淀，用PBS清洗两次后用PBS重悬，得到不同菌株菌液。取实施案例1中嵌合裂解酶ClyL 100μL与100μL上述菌液混合，使得广谱嵌合裂解酶ClyL终浓度为50μg/mL，体系OD600＝0.6～0.8。
同时以等量PBS和上述菌液的混合液作为阴性对照，37℃孵育30min后测定OD600，重复三次，得到的结果见图4和表1所示，其中S.suis SC19和S.suis SS0859于Effects ofEnvironmental and Management-Associated Factors on Prevalence and Diversityof Streptococcus suis in Clinically Healthy中公开发表使用，其他菌株为可常规购买获得的标准株。
表1广谱嵌合裂解酶ClyL在体外裂解链球菌和葡萄球菌广谱性结果
/>
从图4的结果可以看出，嵌合裂解酶ClyL在体外可以高效地裂解猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌、溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌。这也表明广谱嵌合裂解酶ClyL对链球菌和葡萄球菌具有广谱裂解活性。
实施例4
广谱嵌合裂解酶ClyL在体外裂解金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213的时间变化结果
将金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213培养至对数期(OD600nm＝0.6)，低温离心(4℃，6000rpm/min)收集沉淀，用PBS清洗两次后用PBS重悬，得到菌株菌液。取实施例1中广谱嵌合裂解酶ClyL 100μL与100μL上述菌液混合,使得广谱嵌合裂解酶ClyL终浓度为50μg/mL，体系OD600nm＝0.8。同时以等量PBS和上述菌液的混合液作为阴性对照，在37℃的条件下孵育，分别在不同的时间点取样，测定OD600nm，重复三次，得到的结果见图5。
从图5结果可以看出，在孵育第60min时，浓度为50μg/mL的广谱嵌合裂解酶ClyL的实验组的吸光度大幅度下降，其吸光度可以从OD600nm＝0.738降至OD600nm＝0.442。结果表明，广谱嵌合裂解酶ClyL在体外对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213表现出高效地杀菌活性。
实施例5
广谱嵌合裂解酶ClyL在体外裂解无乳链球菌标准菌株ATCC13813的时间变化结果
将无乳链球菌标准菌株ATCC13813培养至对数期(OD600nm＝0.6)，低温离心(4℃，6000rpm/min)收集沉淀，用PBS清洗两次后用PBS重悬，得到菌株菌液。取实施例1中广谱嵌合裂解酶ClyL 100μL与100μL上述菌液混合，使得嵌合裂解酶ClyL终浓度为50μg/mL，体系OD600nm＝0.8。同时以等量PBS和上述菌液的混合液作为阴性对照，在37℃的条件下孵育，分别在不同的时间点取样，测定OD600nm，重复三次，得到的结果见图6。
从图6结果可以看出，在孵育第10min时，浓度为50μg/mL的广谱嵌合裂解酶ClyL的实验组的吸光度大幅度下降，在第60min时，实验组吸光度可以从OD600nm＝0.790降至OD600nm＝0.225。结果表明，广谱嵌合裂解酶ClyL在体外对无乳链球菌标准菌株ATCC13813表现出高效地杀菌活性。
实施例6
广谱嵌合裂解酶ClyL在体外清除生物被膜的结果
将金黄色葡萄球菌、猪链球菌和乳房链球菌在37℃180rpm的条件下培养12h后，将菌液用对应培养基稀释至106CFU/mL。将稀释好的菌液各取200μL加到96孔板内，在37℃培养培养24h后，弃掉培养基后用PBS清洗两遍后加入200μL浓度为50μg/mL的实施例1中的嵌合裂解酶ClyL，PBS作为阴性对照，在37℃孵育1h后用PBS清洗两遍，在室温环境下倒置96孔板晾干。晾干后每孔加入200μL 1％结晶紫在室温下孵育30min后用PBS清洗三遍，在室温倒置晾干。晾干后每孔加入33％冰醋酸在室温孵育1h后检测其OD590。试验重复三次。结果见图7。
从图7的结果可以看出，浓度为50μg/mL的嵌合裂解酶ClyL可以将金黄色葡萄球菌ATCC29213形成的生物被膜由OD590＝0.673降至OD590＝0.194、可以将猪链球菌SS0859形成的生物被膜由OD590＝0.277降至OD590＝0.164和可以将乳房链球菌017-2形成的生物被膜由OD590＝0.851降至OD590＝0.266。结果表明，广谱嵌合裂解酶ClyL可以很好地清除葡萄球菌和链球菌形成的生物被膜。
实施例7
广谱嵌合裂解酶ClyL在小鼠体内裂解无乳链球菌标准菌株ATCC13813的结果
选取6-8周龄BALB/c小鼠24只，随机分为4组，每组6只。第一组每只小鼠腹腔注射2×108CFU(200μL)的无乳链球菌标准菌株ATCC13813，1h后，每只小鼠注射200μL的无菌PBS；第二组每只小鼠腹腔注射2×108CFU(200μL)的无乳链球菌标准菌株ATCC13813，1h后，每只小鼠注射750μg实施例1中广谱嵌合裂解酶ClyL；第三组每只小鼠腹腔注射2×108CFU(200μL)的无乳链球菌标准菌株ATCC13813，1h后，每只小鼠注射500μg实施例1中的广谱嵌合裂解酶ClyL；第四组每只小鼠腹腔2×108CFU(200μL)的无乳链球菌标准菌株ATCC13813，1h后，每只小鼠注射300μg实施例1中广谱嵌合裂解酶ClyL；观察这四组小鼠在7天内的存活率。得到的结果见图8。
从图8的结果可以看出，小鼠在感染致死剂量的无乳链球菌ATCC13813后，每只小鼠给予750μg的嵌合裂解酶ClyL治疗可以使小鼠存活率达到100％，每只小鼠给予500μg的嵌合裂解酶ClyL治疗可以使小鼠存活率达到40％。结果表明，在体内嵌合裂解酶ClyL对链球菌可以发挥出高效地杀菌活性，可用于治疗无乳链球菌导致的全身感染。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 武汉鑫诺维生物技术有限责任公司
<120> 一种广谱嵌合裂解酶ClyL、编码基因、重组载体、重组菌及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly
35 40 45
Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp
50 55 60
Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile
65 70 75 80
Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser
85 90 95
Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr
100 105 110
Gln Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser
115 120 125
Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys
130 135 140
Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu
145 150 155 160
Ile Pro Val Lys Ala Gly Gly Ser Ser Gly Ser Asp Ser Thr Ala Val
165 170 175
Ala Thr Gln Ser Ser Ser Gly Asn Leu Gly Lys Val Lys Asp Glu Gln
180 185 190
Gly Thr Met Thr Val Lys Val Ser Leu Leu Asn Val Arg Asp Lys Pro
195 200 205
Gly Leu Asp Gly Lys Val Val Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Glu Gln Phe
210 215 220
Asn Tyr Asp Ser Val Tyr Ile Ala Asp Gly Tyr Ile Trp Val Ser Tyr
225 230 235 240
Val Ser Arg Ser Gly Val Arg Arg Tyr Val Ala Ala Gly Glu Glu Ser
245 250 255
Asn Arg Arg Asn Val Val Pro Tyr Gly Ile Phe Lys
260 265
<210> 2
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcaaaaa cacaagctga aataaataag cgcctggatg cgtacgcgaa aggtacagtg 60
gacagcccgt atcgtattaa aaaggctacc tcctacgacc cgtcgttcgg cgtgatggaa 120
gcgggtgcaa ttgacgcgga tggctactac catgcacagt gccaggatct gatcaccgat 180
tatgtgctgt ggctgaccga taacaaagtt cgtacctggg gcaacgcgaa ggaccaaatc 240
aagcaaagct acggcactgg ttttaaaatc cacgaaaaca agccaagcac ggtgccgaaa 300
aagggctgga ttgctgtctt cacgagcggt tcttaccagc aatggggtca tattggtatt 360
gtttatgacg gcggtaacac ctccaccttc accatcttgg agcagaattg gaatggttat 420
gccaataaga agccgaccaa acgtgttgac aactattacg gcttgaccca ctttatcgag 480
atcccggtta aagccggagg ctcgtctgga tcggactcta ctgcagtggc aacacagtca 540
agcagtggca atctcggtaa ggtcaaagac gagcagggga caatgaccgt taaagtatct 600
ttgctcaatg tccgagacaa gcctggttta gacggtaaag ttgtggcaac gtacacgaat 660
agcgagcagt ttaattatga ttcggtctat attgccgatg gatacatttg ggtatcgtat 720
gttagccgta gcggtgtacg tcgctatgta gcagcaggcg aggaatcaaa ccgtcgcaat 780
gttgtgcctt atggtatttt caaa 804
<210> 3
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr Ser Tyr
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Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly
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Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp
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Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile
65 70 75 80
Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser
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Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr
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165
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 6
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<210> 11
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggcaaaaa cacaagctga aataaataag cgcctggatg cgtacgcgaa aggtacagtg 60
gacagcccgt atcgtattaa aaaggctacc tcctacgacc cgtcgttcgg cgtgatggaa 120
gcgggtgcaa ttgacgcgga tggctactac catgcacagt gccaggatct gatcaccgat 180
tatgtgctgt ggctgaccga taacaaagtt cgtacctggg gcaacgcgaa ggaccaaatc 240
aagcaaagct acggcactgg ttttaaaatc cacgaaaaca agccaagcac ggtgccgaaa 300
aagggctgga ttgctgtctt cacgagcggt tcttaccagc aatggggtca tattggtatt 360
gtttatgacg gcggtaacac ctccaccttc accatcttgg agcagaattg gaatggttat 420
gccaataaga agccgaccaa acgtgttgac aactattacg gcttgaccca ctttatcgag 480
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<210> 13
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Ser Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala
1 5 10 15
Tyr Ala Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr
20 25 30
Ser Tyr Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala
35 40 45
Asp Gly Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val
50 55 60
Leu Trp Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Gln Ile Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys
85 90 95
Pro Ser Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Tyr Gln Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn
115 120 125
Thr Ser Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn
130 135 140
Lys Lys Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe
145 150 155 160
Ile Glu Ile Pro Val Lys Ala Phe Glu
165
<210> 14
<211> 501
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggcaaaaa cacaagctga aataaataag cgcctggatg cgtacgcgaa aggtacagtg 60
gacagcccgt atcgtattaa aaaggctacc tcctacgacc cgtcgttcgg cgtgatggaa 120
gcgggtgcaa ttgacgcgga tggctactac catgcacagt gccaggatct gatcaccgat 180
tatgtgctgt ggctgaccga taacaaagtt cgtacctggg gcaacgcgaa ggaccaaatc 240
aagcaaagct acggcactgg ttttaaaatc cacgaaaaca agccaagcac ggtgccgaaa 300
aagggctgga ttgctgtctt cacgagcggt tcttaccagc aatggggtca tattggtatt 360
gtttatgacg gcggtaacac ctccaccttc accatcttgg agcagaattg gaatggttat 420
gccaataaga agccgaccaa acgtgttgac aactattacg gcttgaccca ctttatcgag 480
atcccggtta aagccttcga a 501

Claims (9)

1.一种广谱嵌合裂解酶ClyL，其特征在于，所述广谱嵌合裂解酶ClyL的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括权利要求1所述广谱嵌合裂解酶ClyL的编码基因和初始载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述初始载体包括pET28a质粒载体。
5.一种表达广谱嵌合裂解酶ClyL的重组菌，其特征在于，包括权利要求3或4所述的重组载体和大肠杆菌。
6.一种广谱嵌合裂解酶ClyL的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求5所述的重组菌于IPTG诱导培养基中诱导培养16~18h，将得到的菌体破碎，离心和过滤，将得到的裂解上清液纯化，得到所述广谱嵌合裂解酶ClyL。
7.权利要求1所述的广谱嵌合裂解酶ClyL、权利要求2所述的编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因、权利要求3或4所述的重组载体、权利要求5所述的重组菌或权利要求6所述的制备方法制备得到的广谱嵌合裂解酶ClyL在制备裂解革兰氏阳性菌的药物中的应用；
所述革兰氏阳性菌包括链球菌和/或葡萄球菌。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述链球菌包括猪链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌中的一种或多种；
所述葡萄球菌包括金黄色葡萄球菌、产色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、木糖葡萄球菌、溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌中的一种或多种。
9.一种防治奶牛乳房炎和/或链球菌的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括权利要求1所述的广谱嵌合裂解酶ClyL、权利要求2所述的编码所述广谱嵌合裂解酶ClyL的基因、权利要求3或4所述的重组载体、权利要求5所述的重组菌和权利要求6所述的制备方法制备得到的广谱嵌合裂解酶ClyL中的任意一种或多种。
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