CN101092618B - 溶葡萄球菌酶的制备方法和其衍生物及衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及溶葡萄球菌酶的制备方法和其衍生物及衍生物的制备方法。溶葡萄球菌酶的制备方法主要包括：设计并合成优化的溶葡萄球菌酶基因，构建表达载体后转化大肠杆菌工程菌，筛选高表达菌株，发酵培养工程菌，表达产物分离纯化。其中所述的表达载体质粒是pET系列载体质粒。本发明的方法，表达方案简单，表达量高，纯化工艺简单，收率高，表达产物可溶，不需要复性，直接用层析方法进行纯化，纯化收率大大提高，适合大规模制备。本发明公开的溶葡萄球菌酶衍生物由PEG修饰后免疫原性降低，半衰期延长，适合临床应用于葡萄球菌感染的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及溶葡萄球菌酶的制备方法和其衍生物及衍生物的制备方法。
背景技术
葡萄球菌(Staphylococcus)是革兰氏阳性球菌的一种，广泛分布于自然界，如空气、水、土壤、饲料和一些物品上，也存在于人和动物的体表、鼻咽部及肠道，绝大多数不致病，少数可引起人和动物致病，其中金黄色葡萄球菌致病力最强，常引起皮肤、组织及器官的化脓性炎症，是烧伤创面感染、急性肝功能衰竭和血源性肾炎等疾病的主要病源菌。金黄色葡萄球菌还和G-脓毒病菌同时发生，协同作用，严重威胁患者的生命。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素还可污染食物而导致食物中毒。医院的医师和护士中鼻腔带菌达到80～100％，而且常为耐药菌株，是医院感染的重要因素。
1940年，青霉素G的发现和使用有效的控制了金黄色葡萄球菌的感染，90％的金葡菌对青霉素敏感。1944年，英国发现了耐青霉素的金葡菌。随着β-类酰胺类抗生素在临床的广泛使用，耐药菌比例不断增加。耐药菌通过产生β-类酰胺酶分解抗生素表现出耐药性。1960年，甲氧西林研制成功，因其对青霉素酶稳定而在临床上对耐青霉素金葡菌表现出良好的治疗效果。但随着新型抗生素的使用，耐甲氧西林金葡菌(MRSA)比例不断增加，目前金黄色葡萄球菌占所有革兰氏阳性球菌感染的第一位。金黄色葡萄球菌中耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌占75％。
万古霉素是治疗MRSA的首选药物，然而1997年日本就分离出第一株对万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌，万古霉素对其最小抑菌浓度为8mg/L。2002年，美国首次报道了万古霉素耐药金黄色葡萄球菌，万古霉素对其最小抑菌浓度为32mg/L。万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的出现使细菌感染再次成为非常棘手的临床问题，2003年美国CDC制定了“VRSA/VISA检测和控制指南”，2005年NCCLS药敏试验执行标准中增加了万古霉素耐药金黄色葡萄球菌检测方法，要求各实验室开展对万古霉素耐药菌的监测。
面对金葡菌对传统抗菌药物耐药状况日益严重的情况，开发新型抗菌制剂显得尤为迫切。溶葡萄球菌酶作为葡萄球菌细胞壁裂解酶引起了人们的重视。1964年，Schindler和Schuhardt首次从一株编号为NRRL B-2628的模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)培养物中发现并分离了溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)。该酶为246个氨基酸组成的单链分子，分子量27kDa，锌为必须的辅助因子。氨基酸组成中缺少半胱氨酸，碱性氨基酸的比例较高，等电点在10.4～11.4之间。溶葡萄球菌酶能特异性地水解细菌细胞壁肽聚糖交联结构甘氨酸五肽桥联中第二位和第三位甘氨酸形成的肽键，因此具有破壁溶菌作用。由于甘氨酸五肽桥联结构仅大量存在于葡萄球菌细胞壁，其中又以金葡菌细胞壁分布最广，因此溶葡萄球菌酶主要对葡萄球菌尤其是金葡菌具有溶菌杀菌作用。
早期获得溶葡萄球菌酶的主要手段是从模仿葡萄球菌培养物中分离提取((Schindler C.A.et al(1965)″Purification and properties of lysostaphin：a lyticagent for the Staphylococcus aureus.″Biochem.Biophys.Acta.97：242-250；IversonO.J.et al(1973)″Studies on lysostaphin，separation and characterization of threeenzymes.″Eur.J.Biochem.38：293-300；Valisena S.，F.E.et al(1982)″Purificationand Characterization of three separate bacteriolytic enzymes excreted by S.aureus，S.simulans and S.saprophyticus.″J.Bact.151：636-647；Sugai M.，T.et al(1990)″Rapid purification of lysostaphin for analysis of cell-wall proteins.″J.Microb.Meth.12：133-138；Marova I.et al(1993)″Modified simplified method for isolation oflysostaphin from the culture filtrate of Staphylococus staphylolyticus.″FoliaMicrobiol.38：245-252)，产物纯度不高而且不均一，容易被热源和过敏原污染。基因工程和蛋白质分离纯化技术的发展为大量制备高纯度的溶葡萄球菌酶开辟了新的途径。1987年，Heath，L.S.等表达了溶葡萄球菌酶基因(″Cloning ofthelysostaphin gene of S.simulans biovar staphylolyticus.″Abstr.Ann.Meet.Am.Soc.Microb.H58p 149；″Plasmid encoded lysostaphin endopeptidase gene of S.simulansbiovar staphylolyticus.″FEMS Microb.Lett.44：129-133)，Recsei P.A.等克隆了完整基因(″Cloning，sequence，and expression of the lysostaphin gene fromStaphylococcus simulans.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：1127-1131，1987)，Heinrich P.，R.等(″The molecular organization of the lysostaphin gene and itssequences repeated in tandem.″Mol.Gen.Genet.209：563-569，1987)和美国专利U.S.Pat.No.4,931,390报道和公开了完整的基因序列。目前溶葡萄球菌酶已经实现了在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌等多种工程菌中的重组表达。重组产品的产量和纯度均有很大的提高，其理化性质、酶活性等和天然酶没有本质区别，为临床应用奠定了基础。
Dajes等动物试验研究表明重组溶葡萄球菌酶的局部有效治疗剂量眼部0.28％，Kokai-kun等鼻腔使用剂量0.5％，Patron等对动物全身给药的剂量为5mg/kg，每日3次，因此有效的溶葡萄球菌酶治疗剂量是很高的，因此构建高效表达菌株，开发大规模的工业化制备技术对此酶的临床应用十分重要。
1990年印度生物技术国际有限公司申请了国际专利WO01/29201“Expression of recombinant mature lysostaphin”，该方法直接表达溶葡萄球菌酶成熟肽基因，表达产物在细胞内以可溶形式表达，表达量为20.2％，蛋白回收率8.9mg/L。中国专利CN190290A公开了一种大肠杆菌高效外分泌表达溶葡萄球菌酶的方法，该方法用3升培养液经过分离纯化得到溶葡萄球菌酶83mg，回收率27.7mg/L。以上专利的方法生产溶葡萄球菌酶都存在表达量低，收率低的问题。
另外，溶葡萄球菌酶作为异源蛋白质，在机体内的主要不良反应是产生免疫反应，引起过敏反应。动物药代动力学研究表明该酶进入体内1小时95％的酶已经降解。聚乙二醇(PEG)修饰技术的应用使聚乙二醇(PEG)的许多优良特性转移到修饰蛋白中去。当聚乙二醇(PEG)偶联到蛋白质分子表面时，可减少蛋白质药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使蛋白质药物不易被免疫系统的细胞识别。PEG类修饰剂的药物动力学性质也发生很大改变，半衰期延长。2003年Walsh等报道了溶葡萄球菌酶的PEG修饰，采用了分支PEG，PEG化溶葡萄球菌酶半衰期延长到24小时。该方法的主要问题是分支PEG成本很高，不适合产业化的要求。
现有技术表达溶葡萄球菌酶产量无法满足大规模制备的要求，PEG修饰的成本很高，因此有必要开发适合大量制备溶葡萄球菌酶的方法及低成本的修饰技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达量高，收率高，适合大规模制备的溶葡萄球菌酶的制备方法。
本发明的另外一个目的在于提供一种低成本的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶。
本发明还有一个目的是提供上述的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶的制备方法。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用的溶葡萄球菌酶的制备方法，包括以下的步骤：
(1)、溶葡萄球菌酶基因的获得；
(2)、表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌：将溶葡萄球菌酶基因片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后直接转化大肠杆菌宿主菌，其中所述的表达载体质粒是pET系列载体质粒；
(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；
(4)、表达产物的分离、纯化：首先将大肠杆菌工程菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化。
上述的溶葡萄球菌酶cDNA序列是已知的，编码一个全长246个氨基酸的蛋白质。溶葡萄球菌酶的编码序列可以来源于基因文库，或根据文献报道的溶葡萄球菌酶cDNA序列全基因合成，还可以设计引物，通过PCR扩增获得。
作为优选，上述的溶葡萄球菌酶基因序列如SEQ ID NO.1所述。这里是根据大肠杆菌高效表达的需要优化设计溶葡萄球菌酶基因序列。
作为优选，上述的pET系列载体质粒是pET-11b、pET-22b、pET-15b、pET-19b、pET-30a-c和pET-32a-c中的一种或多种。
作为优选，上的步骤(2)酶切位点是Nde I/BamHI或Nco I/BamHI位点。
作为优选，上的步骤(3)中阳性克隆筛选是用氨苄青霉素做抗性筛选。
作为优选，上述的步骤(3)中培养的温度控制在28℃～40℃。再优选的培养的温度控制在30℃～35℃。
作为优选，上述的步骤(3)中诱导表达使用浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG作为诱导剂。再优选的诱导表达使用浓度为0.4～1.0mmol/L。
作为优选，上述的步骤(3)中诱导的温度控制在20℃～40℃。再优选的培养的温度控制在25℃～30℃。
作为优选，上述的步骤(4)中层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析和亲和层析中的一种或多种方法。
为了实现上述的第二个目的，本发明的聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶由溶葡萄球菌酶与聚乙二醇采用单点或多点修饰构成。
作为优选，上述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇。作为再优选，上述的单甲氧基聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇醛中的一种或多种。作为最优选，上述的单甲氧基聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇醛。
作为优选，上述的聚乙二醇的分子量为5kDa～100kDa。再优选的分子量为5kDa～40kDa。最优选的分子量为20kDa～40kDa。
为了实现上述的第三个目的，本发明的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶的制备方法，包括了上述实现第一个目的的溶葡萄球菌酶的制备步骤和纯化后的溶葡萄球菌酶聚乙二醇修饰步骤。
上述的聚乙二醇修饰反应的条件为：配制修饰反应缓冲液，离子强度为5～500mmol/L，pH值为4～8；时间8～24小时，反应温度4～25℃。
作为优选，上述的聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的重量比例为0.5～20。再优选的重量比例为2～10。
作为优选，上述的聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的缓冲液的pH值为3～8。再优选的pH值为5～7。
作为优选，上述的聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的温度为4℃～37℃。再优选的温度为4℃～25℃。
作为优选，上述的聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的时间为4～48小时。再优选的时间为16～24小时。
本发明的溶葡萄球菌酶的制备方法，其表达方案简单，表达量高，达到30％以上，纯化工艺简单，收率高，表达产物可溶，不需要复性，直接用层析方法进行纯化，纯化收率大大提高，纯化收率达到1～3g/L，适合大规模制备。
本发明聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶由溶葡萄球菌酶与聚乙二醇采用单点或多点修饰构成，聚乙二醇修饰的溶葡萄球菌酶免疫原性降低，半衰期延长，适合临床应用于葡萄球菌感染的治疗，且修饰的成本低。
附图说明
图1：目标蛋白的表达分析
M：蛋白分子量，从上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd；
1～3：诱导菌体全蛋白；4：未诱导菌体。
图2：阳离子交换层析图谱。
图3：疏水层析图谱。
图4：纯化产物的电泳分析
1～3：纯化中间体；4：纯化Lysostaphin；
M：蛋白分子量，从上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd。
图5：纯化产物的RP-HPLC分析结果。
图6：聚乙二醇修饰的Lysostaphin电泳分析
1～3：未修饰的Lysostaphin；4：聚乙二醇化Lysostaphin；
M：蛋白分子量，从上而下97.4、66.2、43、30、20.1、14.4kd。
具体实施方式
实施例1 溶葡萄球菌酶基因的合成、克隆和表达
表达载体采用pET-22b(Invitrogen)，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
根据Genebank公布的Staphylococcus simulans的Lysostaphin基因序列(AX828346)及专利WO03074689的溶葡萄球菌酶基因序列，根据大肠杆菌高效表达的需要优化设计溶葡萄球菌酶基因序列，见SEQ ID NO.1，基因编码产物的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。合成20段互补的寡核苷酸，并在5’端和3’端分别引如酶切位点Nde I、BamH I，按分子克隆的常规方法，首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30min，磷酸化的各寡核苷酸片段以等摩尔混合，94℃变性5min，立即65℃退火10min，然后加入T4连接酶，16℃连接过夜。取连接产物用下述引物进行扩增：
引物1：5‘--TATACATATGGCTGCAACACATGAACA
引物2：3‘--TCTGGATCCTCAGTTACTTTATAGTTCCCCAAA
扩增条件：95℃、30s；55℃、30s；70℃、60s，循环次数：30次。最后70℃保温延伸10min。用Nde I和BamH I消化所述的溶葡萄球菌酶的PCR产物。
pET-22b质粒用Nde I、BamH I双酶切回收大片段，与合成的溶葡萄球菌酶基因片段连接，20μL反应体系基因片段与载体大片段的比例为10∶1，加T4DNA连接酶300单位，15℃连接过夜，取10μL连接产物直接转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得工程菌经进一步筛选。氨苄青霉素做抗性筛选，得到阳性克隆。提取质粒，用限制性内切酶进行鉴定。阳性转化子用通用引物进行序列分析，结果克隆序列与设计序列完全一致。
接种阳性克隆进行培养，经1mmol/L的IPTG诱导，结果见图1。
实施例2、不同培养条件对表达的影响
采用培养基(0.5％Yeast Extract，1.0％Peptone，0.5％NaCl，0.05mg/LAmp，pH7.4)研究了不同温度条件诱导对产物表达状态的影响。接种量：5％(种子液体积占培养基体积的比例)，诱导前培养温度37℃，采用IPTG诱导，剂量1mmol/L。培养后4个温度进行诱导，结果见下表。
| 诱导温度 | 表达量 | 目标蛋白上清％ | 目标蛋白沉淀％ |
| 20℃ | 20％ | 90％ | 10％ |
| 25℃ | 30％ | 90％ | 10％ |
| 30℃ | 30％ | 65％ | 35％ |
| 37℃ | 30％ | 50％ | 50％ |
总结：加诱导剂后25℃培养4小时，表达量可以达到30％，而且目标蛋白主要表达在破菌上清中，如果延长表达时间，如表达8小时，则目标蛋白超过80％在破菌后的沉淀中，因此优选的条件是37℃培养后，25℃诱导表达4小时，目标蛋白主要在破菌后上清中，有利于分离纯化。
实施例3 表达产物的分离、纯化
用菌体破碎缓冲液(40mM Tris-Cl，02M NaCl，0.5mM EDTA，pH8.0)按照20ml/g的比例悬浮湿菌体。超声波法破碎菌体(220V，20khz，900W，冰水浴条件下超声破碎)。
将破菌液用高速离心进行离心(10000g，30min，4℃)，去掉沉淀，收集上清。收集到的破菌上清液用离子交换层析法分离纯化，其过程为用pH值为8.5的20mmol/L Tris.CL缓冲液稀释，使其电导率小于5mS/cm。用同样的缓冲液平衡层析柱，层析凝胶可选用CM-Sepharose Fast Flow、SP-Sepharose Fast Flow、Mono-S(Amersham Pharmacia)。上样后用平衡缓冲液洗至基线，用缓冲液(0.01～0.5mol/L NaCL，20mM Tris-C1，pH8.0)进行梯度洗脱，当NaCL浓度达到30％时出现目标蛋白，收集目标蛋白峰，层析图谱见图2。洗脱出来的蛋白样品纯度在85-90％。将离子交换目标蛋白峰补加(NH4)2SO4使终浓度为0.6～0.8mol/L，疏水层析柱(XK26/20)用缓冲体系A(20mM Tris-Cl，pH8.5，0.6M(NH4)2SO4)平衡，疏水凝胶可选用Phenyl-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose High Perforance及Butyl-Sepharose Fast Flow，流速10ml/min，上样后用缓冲液B(20mM Tris-Cl；pH8.5)通过降低盐浓度梯度洗拖，收集目标蛋白峰，疏水层析图谱见图3。目标蛋白电泳纯度95％，分析结果见图4。
得到的疏水层析峰经Sephadex G-25脱盐，平衡液为20mmol/L PB，pH7.4。样品脱盐后即为精细纯化的溶葡萄球菌酶。
实施例4 纯化产物的酶活性分析
酶活性分析采用比浊法，参照Piotr Szweda等的方法(Cloning，Expression，and Purfication of the Staphylococcus simulans Lysostaphin Using theIntein-Chitin-Binding Domain(CBD)System(Protein)，受试菌为金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus。活化的金黄色葡萄球菌在LB培养基中37℃培养至OD620nm为0.25，加入适量纯化溶葡萄球菌酶(10μL，约1μg)，37℃保温10min后测定OD620nm的吸收值。酶活性单位定义为pH7.5条件下37℃保温10min，将6ml金黄色葡萄球菌悬液OD620nm为0.25降至0.125所需的酶量为1个的单位。本发明的溶葡萄球菌酶比活性达到412U/mg。
实施例5 纯化产物的纯度分析
纯化溶葡萄球菌酶的纯度采用RP-HPLC方法进一步进行分析，分析柱为Alltech公司Vydac 214TP5415，150mmX4.6mm，5μm，流动相A：0.1％TFA，ACN-H2O(5∶95)；流动相B：0.1％TFA，ACN-H2O(95∶5)，流速0.8ml/min，检测波长214nm，分析方法见下表：
| Step | Time(min) | B (％) | Max Press(bar) |
| 1 | 0 | 20 | 200 |
| 2 | 10 | 20 | 200 |
| 3 | 30 | 40 | 200 |
| Step | Time(min) | B (％) | Max Press(bar) |
| 4 | 40 | 40 | 200 |
| 5 | 65 | 80 | 200 |
样品纯度达到99％，分析结果见图5。
实施例6 溶葡萄球菌酶的聚乙二醇修饰
将纯化的溶葡萄球菌酶(LSS)溶于pH 8.0、100mM的磷酸盐缓冲液中，按溶葡萄球菌酶∶单甲氧基聚乙二醇醛＝1∶5(w/w)的比例加入溶解后，加入NaCNBH3使其终浓度为8mM，冰箱2～8℃反应16～24小时。修饰反应结束后采用分子筛柱(Sephacryl-200)去除未修饰的LSS以及游离的聚乙二醇。以pH 8.0、20mM PB为洗脱液，流速5ml/min，收集第一个蛋白峰为修饰蛋白峰，电泳分析结果见图6。
序列表
<110>杭州北斗生物技术有限公司
<120>一种溶葡萄球菌酶及其衍生物的制备方法
<160>2
<210>1
<211>757
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(741)
<220>
<221>misc feature
<223>Lysostaphin编码序列
<400>1
ATGGCTGCAA CACATGAACA TTCAGCACAA TGGTTGAATA ATTACAAAAA 50
AGGATATGGT TACGGTCCTT ATCCATTAGG TATAAATGGC GGTATGCACT 100
ACGGAGTTGA TTTTTTTATG AATATTGGAA CACCAGTAAA AGCTATTTCA 150
AGCGGAAAAA TAGTTGAAGC TGGTTGGAGT AATTACGGAG GAGGTAATCA 200
AATAGGTCTT ATTGAAAATG ATGGAGTGCA TAGACAATGG TATATGCATC 250
TAAGTAAATA TAATGTTAAA GTAGGAGATT ATGTCAAAGC TGGTCAAATA 300
ATCGGTTGGT CTGGAAGCAC TGGTTATTCT ACAGCACCAC ATTTACACTT 350
CCAAAGAATG GTTAATTCAT TTTCAAATTC AACTGCCCAA GATCCAATGC 400
CTTTCTTAAA GAGCGCAGGA TATGGAAAAG CAGGTGGTAC AGTAACTCCA 450
ACGCCGAATA CAGGTTGGAA AACAAACAAA TATGGCACAC TATATAAATC 500
AGAGTCAGCT AGCTTCACAC CTAATACAGA TATAATAACA AGAACGACTG 550
GTCCATTTAG AAGCATGCCG CAGTCAGGAG TCTTAAAAGC AGGTCAAACA 600
ATTCATTATG ATGAAGTGAT GAAACAAGAC GGTCATGTTT GGGTAGGTTA 650
TACAGGTAAC AGTGGCCAAC GTATTTACTT GCCTGTAAGA ACATGGAATA 700
AATCTACTAA TACTTTAGGT GTTCTTTGGG GAACTATAAA GTAACTGAGG 750
ATCCAGA 757
<210>2
<211>247
<212>PRT
<213>大肠杆菌(Escherichia Coli)
<400>2
Met Ala Ala The His Glu His Ser Ala Gln Trp Leu Asn Asn Tyr Lys Lys Gly Tyr Gly
1 5 10 15 20
Tyr Gly Pro Tyr Pro Leu Gly Ile Asn Gly Gly Met His Tyr Gly Val Asp Phe Phe Met
25 30 35 40
Asn Ile Gly The Pro Val Lys Ala Ile Ser Ser Gly Lys Ile Val Glu Ala Gly Trp Ser
45 50 55 60
Asn Tyr Gly Gly Gly Asn Gln Ile Gly Leu Ile Glu Asn Asp Gly Val His Arg Gln Trp
65 70 75 80
Tyr Met His Leu Ser Lys Tyr Asn Val Lys Val Gly Asp Tyr Val Lys Ala Gly Gln Ile
85 90 95 100
Ile Gly Trp Ser Gly Ser The Gly Tyr Ser The Ala Pro His Leu His Phe Gln Arg Met
105 110 115 120
Val Asn Ser Phe Ser Asn Ser The Ala Gln Asp Pro Met Pro Phe Leu Lys Ser Ala Gly
125 130 135 140
Tyr Gly Lys Ala Gly Gly The Val The Pro The Pro Asn The Gly Trp Lys The Asn Lys
145 150 155 160
Tyr G1y The Leu Tyr Lys Ser Glu Ser Ala Ser Phe The Pro Asn The Asp Ile Ile The
165 170 175 180
Arg The The Gly Pro Phe Arg Ser Met Pro Gln Ser Gly Val Leu Lys Ala Gly Gln The
185 190 195 200
Ile His Tyr Asp Glu Val Met Lys Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly Tyr The Gly Asn
205 210 215 220
Ser Gly Gln Arg Ile Tyr Leu Pro Val Arg The Trp Asn Lys Ser The Asn The Leu Gly
225 230 235 240
Val Leu Trp Gly The Ile Lys
245
Claims (10)
1.溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于包括以下的步骤：
(1)、溶葡萄球菌酶基因的设计与合成，溶葡萄球菌酶基因序列如SEQ IDNO.1所述；
(2)、表达载体的构建及转化大肠杆菌工程菌：将溶葡萄球菌酶基因片段插入到表达载体质粒的酶切位点，然后直接转化大肠杆菌宿主菌，其中所述的表达载体质粒是pET-22b；
(3)、阳性克隆的筛选、培养、诱导表达：筛选出阳性克隆在培养基上进行培养，经诱导使目标蛋白表达；
(4)、表达产物的分离、纯化：将大肠杆菌工程菌菌体收集、破菌，经离心得到破菌液上清，然后对破菌液上清用层析技术纯化。
2.根据权利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于溶葡萄球菌酶基因的获得是通过全基因合成。
3.根据权利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于步骤(3)中培养的温度控制在28℃～40℃。
4.根据权利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于步骤(3)中诱导温度控制在20℃-37℃。
5.根据权利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于步骤(4)中层析技术是离子交换层析、分子筛层析、疏水层析和亲和层析中的一种或多种方法。
6.聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于：该方法包括如权利要求1所述的溶葡萄球菌酶的制备步骤和纯化后的溶葡萄球菌酶聚乙二醇修饰步骤，溶葡萄球菌酶与聚乙二醇采用单点或多点修饰构成。
7.根据权利要求6所述的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的重量比例为0.5～20。
8.根据权利要求6或7所述的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于聚乙二醇与溶葡萄球菌酶发生共价结合反应的缓冲液的pH值为4～8，反应的温度为2℃～37℃，反应的时间为4～48小时。
9.根据权利要求6或7所述的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于所述的聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯和单甲氧基聚乙二醇醛中的一种或多种。
10.根据权利要求6或7所述的聚乙二醇修饰溶葡萄球菌酶的制备方法，其特征在于聚乙二醇的分子量为5kDa～100kDa。
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