CN105177033A - 利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法 - Google Patents
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Abstract
利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，涉及基因工程和蛋白质工程。1)工程菌构建；2)工程菌发酵：将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体。3)纯化。应用SUMO表达系统高效稳定、可溶性地表达SUMO-bFGF融合蛋白，在SUMO肽段N端前设计组氨酸标签，融合蛋白可以特异结合Ni-NTA？resin，经过同样含有组氨酸标签的SUMO蛋白酶ULP1切割后可以获得无任何氨基酸残基残留的高纯度的bFGF蛋白。经SDS-PAGE分析，诱导表达量高达28％，最终得到的bFGF蛋白纯度达到97％。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程，具体是涉及一种利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法。
背景技术
成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor,简称FGF)是一类结构类似、生物功能相近的肝素结合蛋白，目前共分离鉴别出23种FGFs，碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,简称bFGF)是FGFs家族的主要成员之一，具有广泛的生物学活性，可刺激血管内皮细胞和成纤维细胞的增殖，对许多细胞有化学催化作用，诱导内皮细胞合成胶原酶和纤溶酶原激活因子，在体内诱导血管形成，还能促进软骨、骨组织及神经组织的损伤修复，促进肢体再生，对大脑皮层、中脑和小脑神经元均有促活作用，除用于医疗外还被大量的运用于美容和整形，显示出广阔的应用前景。
天然的bFGF来源于垂体等组织中，含量极少，难以大量制备。运用基因工程在大肠杆菌中发酵生产是常用的最为经济和可持续的方法。然而在大肠杆菌中bFGF以包涵体的形式表达，需要重折叠以恢复生物活性，而非融合的bFGF在大肠杆菌中的表达量过低。而公开号为CN1594565A的专利使用家蚕表达bFGF，每头家蚕产量仅600～700μg，且生产周期过长；公开号为CN1345927A的专利使用酵母发酵表达bFGF，其产量低，仅20～100mg/L。公开号为CN102675473A的专利融合bFGF与人胶原蛋白，其医疗方面的应用受限制。公开号为CN103882028A的专利融合PDI辅助可溶性表达，但未提及表达量。
SUMO(SmallUbiquitin-likeModifier)是一种小分子泛素样修饰蛋白，广泛存在于各种真核细胞中，参与调节细胞凋亡、信号转导、RNA转录、蛋白的核质运输以及细胞周期等多种生理进程。近年来发现SUMO可作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，具有抗蛋白酶水解、显著增加重组蛋白表达量、促进靶蛋白正确折叠、提高可溶性等功能。目前尚未见有利用SUMO促进bFGF高效表达的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法。
本发明包括以下步骤：
1)工程菌构建：
bFGF的原始基因序列如SEQIDNO.1，氨基酸序列如SEQIDNO.2，原始基因序列中存在Ncol酶切位点，故将其第6位的C突变成A，其氨基酸序列仍保持不变，全序列合成优化后的基因序列如SEQIDNO.3。
SUMO蛋白酶ULP1在SUMOC端Gly-Gly后酶切，且经实验证明，Gly-Gly后为Met也不影响酶切；由于不存在合适的限制性内切酶酶切位点，因此使用overlapPCR将SEQIDNO.3序列与SUMODNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列内部并无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQIDNO.4；使用Ncol和Xhol酶切拼接序列与质粒pRSFD连接；设计引物如下：
PartA：
模板：pSUMO
UpprimerforpSUMO-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA
bFGFDownprimerforA:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC
PartB:
模板：bFGFgene
bFGFUpPrimerforB:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA
bFGFDownprimerforB-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA
将构建好的质粒pRSFD-SUMO-bFGF转化至感受态细胞E.ColiBL21(DE3)中；
2)工程菌发酵：
将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体。
3)纯化：
裂解菌体，离心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His-Tag，可以被Ni胶亲和吸附，将上清液与Ni胶混合使之结合到Ni胶上，加入SUMO蛋白酶ULP1酶切，因为SUMO与ULP1都有His-Tag，都可以被Ni胶特异吸附而bFGF不能被吸附，所以可用砂芯漏斗将之过滤出来；
收集的bFGF溶液中还有少量杂质，可以使用Heparin柱亲和吸附bFGF，冲洗杂质后，用缓冲液洗脱，纯化后的bFGF溶液进行冻干，即得到bFGF蛋白冻干粉。纯化后的bFGF纯度可以达到97％。
在步骤2)中，所述液体培养基可采用加有Kana霉素的LB培养基。
在步骤3)中，所述缓冲液的配方可为：1XPBS，1mMPMSF，0.3MNaCl，0.1％TritonX-100。
本发明应用SUMO表达系统高效稳定、可溶性地表达SUMO-bFGF融合蛋白，在SUMO肽段N端前设计组氨酸标签，融合蛋白可以特异结合Ni-NTAresin，经过同样含有组氨酸标签的SUMO蛋白酶ULP1切割后可以获得无任何氨基酸残基残留的高纯度的bFGF蛋白。经SDS-PAGE分析，诱导表达量高达28％，最终得到的bFGF蛋白纯度达到97％。
附图说明
图1是实施例1中载体pRSFD-SUMO-bFGF的质粒图谱。
图2是实施例2中重组工程菌诱导表达前后的SDS-PAGE电泳图。在图2中，泳道1为诱导前，泳道2为诱导后，泳道3为蛋白分子量Marker。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限制于这些实施例。
实施例1：工程菌构建
全序列合成SEQIDNO.3。bFGF的原始基因序列存在Ncol酶切位点，故将第6位原来的C突变成A，蛋白质序列仍保持不变。
SUMO蛋白酶I在SUMOC端Gly-Gly后酶切，且经实验证明，Gly-Gly后为Met也不影响酶切。由于不存在合适的限制性内切酶酶切位点，因此使用overlapPCR将SEQIDNO.1序列与SUMODNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列内部并无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQIDNO.4。使用Ncol和Xhol酶切拼接序列及pRSFD连接。设计引物如下：
PartA：
模板：pSUMO
UpprimerforpSUMO-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA
bFGFDownprimerforA:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC
PartB:
模板：bFGFgene
bFGFUpPrimerforB:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA
bFGFDownprimerforB-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA
构建好的质粒如图1所示，其中T7Promoter为启动子，Ncol和Xhol为酶切位点，Kan为Kana霉素抗性基因。
按照《分子克隆实验指南》上所述的方法将构建好的质粒转化至感受态细胞E.ColiBL21(DE3)中。
实施例2：工程菌发酵。
将实施例1中构建好的工程菌涂布在加有Kana霉素的LB平板上，37℃培养箱过夜培养，挑选单菌落接种于250ml加有Kana霉素的LB培养基中，在摇床上过夜培养，培养条件37℃，220rpm。培养好的菌液作为菌种，接种到装有灭菌的15LLB培养基的发酵罐中，培养至OD600＝0.8～1.2时，加诱导剂IPTG诱导10h。4000g离心收集菌体。分别取诱导前及诱导结束时的样品，进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示，其中泳道1为诱导前样品，泳道2为诱导结束样品，泳道3为蛋白Marker。泳道2中在分子量35kd处诱导产生的蛋白条带为SUMO-bFGF，表达量为28％。
实施例3：蛋白纯化
将实施例2得到的菌体混匀于5～10倍体积的裂解缓冲液中，缓冲液配方：1XPBS，1mMPMSF，0.3MNaCl，0.1％TritonX-100。超声破碎上述混合液，12000g离心，收集上清液。该上清液即为SUMO-FGF蛋白粗提液。将粗提液与Ni-NTAresin混合，4℃低温振荡过夜。使SUMO-bFGF蛋白完全结合到Ni-NTAresin上。
缓冲液冲洗SUMO-bFGF蛋白-Ni混合物。加入酶切缓冲液，适量的SUMO蛋白酶I，低温过夜酶切。过滤酶切混合物，收集流穿液即为bFGF蛋白初制液。将上述初制液过Heparin柱层析，用2MNaCl洗脱，收集洗脱液。洗脱液过夜透析去除NaCl，得到的即为bFGF精制液。
将上述bFGF精制液进行冻干，即得到bFGF蛋白冻干粉。
Claims (3)
1.利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)工程菌构建：
bFGF的原始基因序列如SEQIDNO.1，氨基酸序列如SEQIDNO.2，原始基因序列中存在Ncol酶切位点，故将其第6位的C突变成A，其氨基酸序列仍保持不变，全序列合成优化后的基因序列如SEQIDNO.3；
SUMO蛋白酶ULP1在SUMOC端Gly-Gly后酶切，使用overlapPCR将SEQIDNO.3序列与SUMODNA序列拼接，并在拼接序列两端设计Ncol和Xhol酶切位点，拼接序列内部并无这两内切酶酶切位点，最终得到的序列为SEQIDNO.4；使用Ncol和Xhol酶切拼接序列与质粒pRSFD连接；设计引物如下：
PartA：
模板：pSUMO
UpprimerforpSUMO-Ncol:CATGCCATGGGCAGCAGCCATCATCA
bFGFDownprimerforA:CCGCCGCCATTGTGCCTCCACCAATCTGTTCTC
PartB:
模板：bFGFgene
bFGFUpPrimerforB:AACAGATTGGTGGAGGCACAATGGCGGCGGGCAGCATTA
bFGFDownprimerforB-Xhol:CCGCTCGAGTTAGCTTTTCGCGCTCATCGGCA
将构建好的质粒pRSFD-SUMO-bFGF转化至感受态细胞E.ColiBL21(DE3)中；
2)工程菌发酵：
将构建好的工程菌涂布在有Kana霉素的LB平板上选育菌种，在液体培养基中发酵培养，加诱导剂IPTG诱导表达，离心收集菌体；
3)纯化：
裂解菌体，离心收集上清液，SUMO蛋白N端前段有His-Tag，可以被Ni胶亲和吸附，将上清液与Ni胶混合使之结合到Ni胶上，加入SUMO蛋白酶ULP1酶切，bFGF用砂芯漏斗过滤；收集的bFGF溶液中还有少量杂质，使用Heparin柱亲和吸附bFGF，冲洗杂质后，用缓冲液洗脱，纯化后的bFGF溶液进行冻干，即得到bFGF蛋白冻干粉。
2.如权利要求1所述利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于在步骤2)中，所述液体培养基采用加有Kana霉素的LB培养基。
3.如权利要求1所述利用pSUMO系统制备碱性成纤维细胞生长因子的方法，其特征在于在步骤3)中，所述缓冲液的配方为：1XPBS，1mMPMSF，0.3MNaCl，0.1％TritonX-100。
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