CN113025675A - 多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多肽的制备方法。该制备方法包括以下步骤：构建Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株，并诱导工程菌株可溶表达多肽；从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白；对含有多肽前体的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶进行酶切，切除Sumo标签；采用乙腈结合加热沉淀的方法或采用六氟异丙醇沉淀的方法纯化Ulp1蛋白酶的酶切产物，得到多肽。本发明建立了高效的基于可溶性重组表达药用多肽或其前体的技术，建立了基于一步沉淀纯化的简单纯化工艺，进一步的结合HPLC精制即可达到97%以上多肽纯度。

Description

多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种多肽的制备方法。
背景技术
多肽类药物因其具有类似蛋白和小分子药物双重特性而备受关注，仅2015年多肽药物的销售就占据药物市场的5%，达到500亿美元，并且以每年9-10%的速度上涨，因此亟待建立高效的低成本的多肽合成和纯化技术。多肽合成主要包括化学法、化学/酶法和生物法。其中，化学方法需要复杂的保护和脱保护过程，需要用到大量的有毒试剂，且可能产生消旋体；化学/生物法通常是用化学方法合成多肽，进一步通过特定的肽连接酶将多个肽段进行连接，工艺相对复杂，连接效率和特异性受到多肽序列的影响；生物法包括采用水解酶水解植物蛋白或动物蛋白然后提取获得特定的有功能的多肽，但是通常产量较低，周期长，污染重，难实现工业化生产；另一种较为普遍的方法是重组表达，即采用基因工程的技术手段在原核或真核生物中引入目标基因表达元件，通过微生物发酵实现目标多肽的高效合成，然而由于多肽自身比较短，很难形成特定的空间结构，导致其非常容易被表达宿主的蛋白酶所降解，此外复杂的纯化工艺又降低了产物收率，增加了成本。
目前，利用重组法生产的多肽包括多肽类抗生素、干扰素、利拉鲁肽前体（GLP-1）和胰岛素等，其中的GLP-1是由诺和诺德开发的用于治疗II型糖尿病的多肽药物，每年的销售额达到数十亿美元，其最初的合成方式是基于酿酒酵母分泌表达的工程菌株，然而由于其胞外蛋白酶的作用导致产物容易被降解，产量较低，敲除蛋白酶后表达的最高水平只有59 mg/L。毕赤酵母中融合表达GLP-1, 发酵5天的表达量只有26 mg/L。大肠杆菌作为一种常用的宿主，已被广泛用于多肽的生物合成，然而同样存在蛋白酶降解的风险，通过融合表达可以解决此类问题。目前GLP-1主要采用包涵体融合表达，如KSI标签，内涵肽intein和信号肽-肠激酶酶切位点-GLP-1等，虽然包涵体表达量较高，可以避免蛋白酶降解，但复杂的变性和复性的过程要用到大量变性剂如尿素或盐酸胍，纯化工艺复杂导致最终得率非常低。同时为了将融合标签完全去除通常需要用到肠激酶，该酶不仅难表达且会造成非特异切割。近来采用MFH融合标签构建的包涵体表达，结合甲酸切割和变性条件下纯化的工艺，避免了复性过程，但需用到尿素，进一步通过Tev蛋白酶切割获得N端含有一个Gly的GLP-1，且Tev酶生物活性较低和产生非特异切割，生产步骤繁琐，成本高。其他的融合标签如GST，MBP，TrxA等多用作可溶表达的标签，且一些肽经过这些标签获得了可溶表达，但是这些标签的分子量相对某些目标肽来说都偏大，导致去除标签后目标肽的得率偏低。此外GLP-1及其衍生物多呈聚合体状态，纯化需要在变性条件下进行，目前的纯化步骤复杂，得率低下。
总的来说，现有技术主要存在以下问题：1）化学合成：工艺复杂，化学试剂有毒，可能产生消旋体，周期较长，产品的质量控制比较困难；2）包涵体表达：变复性纯化工艺复杂，用到大量的尿素，切割过程中用到的肠激酶或Tev价格昂贵，易产生非特异性切割；复杂的变复性工艺导致纯化过程非常复杂，得率降低；3）可溶表达：目前用到的可溶表达标签主要包括TrxA，GST，MBP，在目标肽段和标签需要加上酶切位点，常用到的酶通常难表达，且会造成非特异切割，没有将Sumo标签用于利拉鲁肽前体融合表达的研究。
发明内容
本发明旨在提供一种多肽的制备方法，以解决现有技术中多肽纯化步骤复杂、得率较低的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种多肽的制备方法。该制备方法包括以下步骤：构建Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株，并诱导工程菌株可溶表达多肽；从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白；对含有多肽前体的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶进行酶切，切除Sumo标签；采用乙腈结合加热沉淀的方法或采用六氟异丙醇沉淀的方法纯化Ulp1蛋白酶的酶切产物，得到多肽。
进一步地，多肽为利拉鲁肽前体、奈西利肽或特立帕肽。
进一步地，Ulp1蛋白酶为通过构建Ulp1蛋白酶表达菌株并诱导表达获得，其中，Ulp1蛋白酶与伴侣蛋白共表达。
进一步地，伴侣蛋白为GroEL/S伴侣蛋白。
进一步地，乙腈结合加热沉淀的方法包括：将Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入乙腈，混匀后在60~80℃热处理0.5~3 h（优选在70℃热处理2 h），之后离心分离上清和沉淀。
进一步地，乙腈为质量百分含量为20~70%的乙腈水溶液。
进一步地，从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白包括：将工程菌株的、超声破碎、离心、过滤膜后获得粗酶液，然后采用亲和层析或阴离子柱进行纯化，得到粗蛋白。
进一步地，六氟异丙醇沉淀的方法包括：将Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入六氟异丙醇，混匀后在室温沉淀1 h，之后离心分离上清和沉淀。
进一步地，六氟异丙醇为质量百分含量为20~70%的六氟异丙醇水溶液；优选的，六氟异丙醇为质量百分含量为50%的六氟异丙醇水溶液。
进一步地，制备方法包括采用HPLC 纯化目标多肽的步骤。
本发明建立了高效的基于可溶性重组表达药用多肽或其前体的技术，建立了基于一步沉淀纯化的简单纯化工艺，进一步的结合HPLC精制即可达到97%以上多肽纯度。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1和5中Sumo-Lira融合蛋白表达、亲和层析纯化的目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane 1：蛋白分子量标准；Lane 2：Sumo-Lira可溶表达部分；Lane3：流穿样品；Lane 4：60 mM咪唑洗脱产品；Lane 5：300 mM咪唑洗脱产品；
图2示出了实施例2和3中Sumo-Nesi和Sumo-Teri融合表达的目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane 1：蛋白分子量标准；Lane 2、3：Sumo-Teri 可溶表达部分；Lane 4：Sumo-Teri 沉淀部分；Lane 5：Sumo-Nesi 可溶表达部分；Lane 6：Sumo-Nesi 沉淀部分；
图3示出了实施例4中Ulp1的表达优化过程中目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane 1：IPTG诱导Ulp1，37 ℃，6 h，可溶表达部分；Lane 2：蛋白分子量标准；Lane 3：IPTG诱导Ulp1，37 ℃，6 h，沉淀部分；Lane 4：IPTG诱导Ulp1和GroEL/S共表达菌株，37 ℃， 6h，可溶表达部分；Lane 5：IPTG诱导Ulp1和GroEL/S共表达菌株，37 ℃，6 h，沉淀部分；
图4示出了实施例5中阴离子柱层析纯化Sumo-Lira目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane 1：蛋白分子量标准；Lane 2：Sumo-Lira破碎液上清；Lane 3：流穿样品；Lane 4：50 mM NaCl洗脱；Lane 5：100 mM NaCl 洗脱；Lane 6：500 mM NaCl 洗脱；Lane 7：700 mMNaCl 洗脱；
图5示出了实施例7中Ulp1 亲和层析纯化目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane1： 蛋白分子量标准；Lane 2： Ulp1可溶表达部分；Lane 3： 流穿样品；Lane 4： 500 mM咪唑洗脱；
图6示出了实施例9中乙腈沉淀利拉鲁肽前体目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane 1： 20% 乙腈，pH5.6，70℃处理，上清部分；Lane 2：20% 乙腈，pH5.6，70℃处理，沉淀部分；Lane 3： 30% 乙腈，pH5.6，70℃处理，上清部分；Lane 4：30% 乙腈，pH5.6，70℃处理，沉淀部分；Lane 5： 蛋白分子量标准；Lane 6： 40% 乙腈，pH5.6，70℃处理，上清部分；Lane7：40% 乙腈，pH5.6，70℃处理，沉淀部分；Lane 8： 蛋白分子量标准；Lane 9： 50% 乙腈，pH5.6，70℃处理，上清部分；Lane 10：50% 乙腈，pH5.6，70℃处理，沉淀部分；Lane 11： 60%乙腈，pH5.6，70℃处理，上清部分；Lane 12：60% 乙腈，pH5.6，70℃处理，沉淀部分；Lane13： 70% 乙腈，pH5.6，70℃处理，上清部分；Lane 14：70% 乙腈，pH5.6，70℃处理，沉淀部分；
图7示出了实施例9中乙腈沉淀Nesi和Teri目标蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane 1： 蛋白分子量标准；Lane 2： Ulp1 切割Sumo-Nesi；Lane 3： 沉淀法处理Sumo-Nesi的Ulp1酶切体系，上清部分；Lane 4： 沉淀法处理Sumo-Nesi的Ulp1酶切体系，沉淀部分；Lane 5： Ulp1 切割Sumo-Teri；Lane 6： 沉淀法处理Sumo-Teri的Ulp1酶切体系，上清部分；Lane 7：沉淀法处理Sumo-Teri的Ulp1酶切体系，沉淀部分；
图8示出了实施例9中，HFIP沉淀法纯化利拉鲁肽前体的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane 1，18%HFIP选择性沉淀的上清液；Lane 2，18%HFIP选择性沉淀的沉淀部分；Lane 3，50%HFIP选择性沉淀的上清液；Lane 4，50%HFIP选择性沉淀的沉淀部分；Lane 5，70%HFIP选择性沉淀的上清液；Lane 6，70%HFIP选择性沉淀的沉淀部分；
图9示出了实施例9和10中利拉鲁肽前体制备HPLC纯化色谱图；
图10示出了实施例10中利拉鲁肽前体纯度分析色谱图；
图11示出了实施例10中Nesi制备HPLC纯化色谱图；
图12示出了实施例10中Nesi纯度分析色谱图；
图13示出了实施例10中Teri制备HPLC纯化色谱图；
图14示出了实施例10中Teri纯度分析色谱图；
图15示出了实施例11中质谱解析的Liraglutide分子量；
图16示出了实施例11中质谱解析的Nesiritide分子量
图17示出了实施例11中质谱解析的Teriparatide分子量。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
名词解释
多肽，英文名称polypeptide，由10-50个的氨基酸残基组成的肽。
利拉鲁肽，一种人胰高糖素样肽-1（GLP-1）类似物，Liraglutide，简称Lira。
奈西利肽，Nesiritide，简称Nesi。
特立帕肽，Teriparatide，简称Teri。
多肽前体，在本发明中是指含有Sumo标签的多肽。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种多肽的制备方法。该制备方法包括以下步骤：构建Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株，并诱导工程菌株可溶表达多肽；从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白；对含有多肽前体的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶进行酶切，切除Sumo标签；采用乙腈结合加热沉淀的方法或采用六氟异丙醇沉淀的方法纯化Ulp1蛋白酶的酶切产物，得到多肽。
本发明基于Sumo标签可以促进蛋白可溶表达，并且其作为融合标签可以被特异识别其三级结构的Ulp1蛋白酶（SUMO蛋白酶）高效切除，而且不会造成非特异切割的方法获得目标多肽，避免了包涵体变复性的问题，构建了Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株。
典型的，本发明中的多肽可以为利拉鲁肽前体、奈西利肽或特立帕肽。
此外针对融合表达标签去除所需要的蛋白酶比较昂贵，且可造成非特异切割的问题，采用了Ulp1特异切割Sumo标签的策略，Ulp1识别的是Sumo标签的空间结构，并且只在特异位点进行切割；为了获得高效的Ulp1工程菌株和方便Ulp1的纯化，构建Ulp1和伴侣蛋白共表达的菌株，优选的，伴侣蛋白为GroEL/S伴侣蛋白，大大提高了Ulp1的表达水平。
根据本发明一种典型的实施方式，乙腈结合加热沉淀的方法包括：将Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6（结合等电点的数据获得），然后加入乙腈，混匀后在60~80℃热处理0.5~3 h（优选在70℃热处理2 h），之后离心分离上清和沉淀。优选的，乙腈为质量百分含量为20~70%的乙腈水溶液，乙腈浓度从20~70%都有着较好的初步纯化效果。
在本发明一典型的实施方式中，从工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白包括：将工程菌株的、超声破碎、离心、过滤膜后获得粗酶液，然后采用亲和层析或阴离子柱进行纯化，得到粗蛋白。
根据本发明一种典型的实施方式，六氟异丙醇沉淀的方法包括：将Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入六氟异丙醇，混匀后在室温沉淀1 h，之后离心分离上清和沉淀；优选的，六氟异丙醇为质量百分含量为20~70%的六氟异丙醇水溶液；优选的，使用50%的六氟异丙醇选择性沉淀后，上清液中的利拉鲁肽前体浓度约90%。
优选的，制备方法进一步包括采用HPLC 纯化目标多肽的步骤。利拉鲁肽前体容易聚集，本发明采用的是有机溶剂处理和反相纯化的方法，可以避免因聚集效应造成的纯化问题。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
构建Sumo标签融合表达利拉鲁肽前体（简称Lira）的基因工程菌株
构建基于可溶表达多肽的策略，具体是采用Sumo标签和目标多肽序列进行融合，构建于pET-28a(+)或pET-22b(+)表达载体。由金唯智进行全基因合成经过密码子优化的Sumo-Lira序列，在序列5’端引入NdeI酶切位点，在序列3’端引入XhoI酶切位点，构建于pUC57 克隆载体，序列如下：
SEQ ID NO：1，CATATGGGCGGCAGTCTGCAAGATAGCGAAGTGAATCAAGAAGCGAAGCCAGAAGT GAAACCGGAAGTTAAACCGGAGACCCACATCAATCTGAAGGTGAGCGACGGCAGCAGCGAGATCTTCTTCAAGATC AAGAAGACGACCCCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCCTTCGCCAAACGCCAAGGCAAAGAAATGGACAGTCTGCGCT TTCTGTACGATGGTATCCGCATCCAAGCCGATCAAGCCCCGGAAGATCTGGACATGGAGGACAACGACATCATCGA GGCGCATCGCGAACAGATCGGCGGCCATGCCGAAGGCACCTTCACCAGCGATGTTAGCAGCTATCTGGAAGGCCAAGCCGCCAAAGAATTCATCGCGTGGCTGGTTCGCGGCCGCGGTTAGCTCGAG。其中，具有下划线的部分为Sumo标签，后边的是利拉鲁肽前体序列。
合成的基因片段从pUC57-Sumo-Lira上经过NdeI和XhoI酶切，切胶回收之后和经过同样酶切的pET-28a(+) 或pET-22b(+)进行16℃过夜连接，之后转化BL21（DE3）感受态细胞，单克隆进行测序分析获得正确的克隆表达载体pET-28a-Sumo-Lira 或pET-22b-Sumo-Lira，每种转化挑取3个正确的克隆活化后作为种子250 mL 摇瓶预筛选，从中选出一个最优的作为最终的表达菌株。取含有重组质粒的BL21（DE3）菌株4 mL，接种于含600 mL LB培养基的2 L三角瓶，37℃ 200 rpm振荡培养至OD600为1.0时，加入终浓度为1 mM IPTG，37℃诱导6 h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，12% 分离胶SDS-PAGE结果表明目标蛋白主要呈可溶表达（图1）。
实施例2
构建Sumo标签融合表达Nesiritide（奈西利肽，简称Nesi）的基因工程菌株
同样采用Sumo标签融合表达的策略，载体构建策略同实施例1，合成基因序列如下：
SEQ ID NO：2，CATATGGGCGGCAGTCTGCAAGATAGCGAAGTGAATCAAGAAGCGAAGCCAGAAGT GAAACCGGAAGTTAAACCGGAGACCCACATCAATCTGAAGGTGAGCGACGGCAGCAGCGAGATCTTCTTCAAGATC AAGAAGACGACCCCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCCTTCGCCAAACGCCAAGGCAAAGAAATGGACAGTCTGCGCT TTCTGTACGATGGTATCCGCATCCAAGCCGATCAAGCCCCGGAAGATCTGGACATGGAGGACAACGACATCATCGA GGCGCATCGCGAACAGATCGGCGGCTCTCCGAAAATGGTTCAGGGTTCTGGTTGCTTCGGTCGTAAAATGGACCGTATCTCTTCTTCTTCTGGTCTGGGTTGCAAAGTTCTGCGTCGTCACTAGCTCGAG。其中，具有下划线的部分为Sumo标签，后边的是奈西利肽序列。
基因经过酶切连接构建于pET-28a(+)，测序获得正确的表达质粒pET-28a-Sumo-Nesi及含有该表达的重组BL21（DE3）菌株，采用和Sumo-Lira同样的方法，IPTG诱导后融合蛋白呈可溶表达（图2）。
实施例3
构建Sumo标签融合表达Teriparatide（特立帕肽，简称Teri）的基因工程菌株
同样采用Sumo标签融合表达的策略，载体构建策略同实施例1，合成基因序列如下：
SEQ ID NO：3，CATATGGGCGGCAGTCTGCAAGATAGCGAAGTGAATCAAGAAGCGAAGCCAGAAGT GAAACCGGAAGTTAAACCGGAGACCCACATCAATCTGAAGGTGAGCGACGGCAGCAGCGAGATCTTCTTCAAGATC AAGAAGACGACCCCGCTGCGTCGTCTGATGGAAGCCTTCGCCAAACGCCAAGGCAAAGAAATGGACAGTCTGCGCT TTCTGTACGATGGTATCCGCATCCAAGCCGATCAAGCCCCGGAAGATCTGGACATGGAGGACAACGACATCATCGA GGCGCATCGCGAACAGATCGGCGGCTCTGTTTCTGAAATCCAGCTGATGCACAACCTGGGTAAACACCTGAACTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTGCGTAAAAAACTGCAGGACGTTCACAACTTCTAACTCGAG。其中，具有下划线的部分为Sumo标签，后边的是特立帕肽序列。
基因经过NdeI 和XhoI 酶切连接构建于pET-28a(+)，测序获得正确的表达质粒pET-28a-Sumo-Teri及含有该表达的重组BL21（DE3）菌株，采用和Sumo-Lira同样的表达条件，IPTG诱导后融合蛋白呈可溶表达（图2）。
实施例4
构建Ulp1蛋白酶表达菌株
Ulp1 蛋白酶的C端部分（D390到K621）直接通过PCR方法从酿酒酵母S288C基因组扩增，所用到的引物是Ulp1-F（SEQ ID NO：4）：gggcatatgGATCTTAAAAAAAAGAAAGAACAATTGGCCAAGAAGAAACTTG 和Ulp1-R （SEQ ID NO：5）：Gggctcgaggtattttaaagcgtcggttaaaatcaaatgggc，基因序列如下所示（或可以按照如下序列进行人工合成）：
SEQ ID NO：:6，GATCTTAAAAAAAAGAAAGAACAATTGGCCAAGAAGAAACTTGTTCCTGAATTAAATGAAAAAGACGATGACCAAGTACAAAAAGCTTTGGCATCTAGAGAAAATACTCAGTTAATGAATAGAGATAATATAGAGATAACAGTACGTGATTTTAAGACCTTGGCACCACGAAGATGGCTAAATGACACTATCATTGAGTTTTTTATGAAATACATTGAAAAATCTACCCCTAATACAGTGGCGTTTAATTCATTTTTCTATACCAATTTATCAGAAAGGGGTTATCAAGGCGTCCGGAGGTGGATGAAGAGAAAGAAGACACAAATTGATAAACTTGATAAAATCTTTACACCAATAAATTTGAACCAATCCCACTGGGCGTTGGGCATAATTGATTTAAAAAAGAAAACTATAGGTTACGTAGATTCATTATCGAATGGTCCAAATGCTATGAGTTTCGCTATACTGACTGACTTGCAAAAATATGTTATGGAGGAAAGTAAGCATACAATAGGAGAAGACTTTGATTTGATTCATTTAGATTGTCCGCAGCAACCAAATGGCTACGACTGTGGAATATATGTTTGTATGAATACTCTCTATGGAAGTGCAGATGCGCCATTGGATTTTGATTATAAAGATGCGATTAGGATGAGAAGATTTATTGCCCATTTGATTTTAACCGACGCTTTAAAATAG。
扩增的基因片段通过NdeI 和XhoI酶切后连接在pET-28a（+）获得表达载体pET-28a-Ulp1，转化BL21(DE3)，转化子进行测序。对测序正确的克隆挑选3个作为种子进行250mL 摇瓶预筛选，从中选出一个最优的作为最终的表达菌株。取含有重组质粒的BL21（DE3）菌株4 mL，接种于含600 mL LB培养基的2 L三角瓶，37℃ 200 rpm振荡培养至OD600为1.0时，加入终浓度为1 mM IPTG，37℃诱导6 h，诱导结束，4℃离心收集菌体。通过超声破碎，收集上清，12% 分离胶SDS-PAGE结果表明目标蛋白部分呈可溶表达。为了进一步提高Ulp1的表达水平，将表达载体pET-28a-Ulp1和伴侣蛋白GroEL/S的表达质粒pGRO7进行了共表达，SDS-PAGE结果表明，Ulp1的表达水平进一步提高（图3）。
实施例5
Sumo-Lira 纯化
将表达的Sumo-Lira菌泥以20%菌浓重悬，超声破碎（5 s超声，6 s间隔，35%功率），离心，过0.45 μm滤膜后获得粗酶液，然后采用亲和层析进行纯化（AKTA系统装配5 mLHisTrap HP）。具体流程是：滤膜过滤样品以5 mL/min流速上样，然后采用结合缓冲液（20mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.4）冲洗直至未结合蛋白完全洗脱，接着采用60 mM咪唑洗脱杂蛋白4个柱体积，然后在500 mM洗脱目标蛋白（图1）。该样品可以直接进行Ulp1酶切，不用脱盐和去除咪唑。1 g菌泥可以获得纯化的Sumo-Lira融合蛋白35-40 mg, 1 g 菌泥可以获得纯化的Sumo-Nesi 15.2 mg，1 g 菌泥可以获得纯化的Sumo-Teri 18.3 mg （经过条件优化可以进一步提高）。
为了降低成本，表达Sumo-Lira尝试采用阴离子柱进行了纯化，粗蛋白的获取方式和亲和层析相同，采用AKTA系统装配有阴离子柱（Q FF，5 mL），流速5 mL/min，结合缓冲液50 mM Tris-HCl pH8.0，上样之后采用结合缓冲液冲洗至未结合蛋白完全洗脱，然后采用50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 M NaCl梯度洗脱在500 mM梯度下获得目标蛋白，SDS-PAGE分析表明目标蛋白可以达到80%以上纯度（图4），经过试验该步纯化的样品同样可以被Ulp1直接进行酶切，不需进行脱盐。
实施例6
Sumo-Teri和Sumo-Nesi 纯化
重组菌株诱导表达获得的菌泥经过和Sumo-Lira样品同样的方式获得粗蛋白，进一步同样采用相同的亲和层析的方式进行纯化获得目标融合蛋白。
实施例7
Ulp1 纯化
将表达的Ulp1菌泥以10%菌浓重悬，超声破碎（5 s超声，6 s间隔，35%功率），离心，过0.45 μm滤膜后采用亲和层析进行纯化（AKTA系统装配5 mL HisTrap HP）。具体流程是：滤膜过滤样品以4 mL/min流速上样，然后采用结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.4）冲洗直至未结合蛋白完全洗脱，接着采用60 mM咪唑洗脱杂蛋白4个柱体积，然后在500 mM洗脱目标蛋白, 结果如图5 SDS-PAGE所示目标蛋白纯度达到70%左右，获得的目标蛋白可以不用脱盐，直接用于融合蛋白Sumo-Lira、Sumo-Teri和Sumo-Nesi的酶切（实施例5和6的产物）。
实施例8
酶切
Ulp1酶切反应在30℃进行，具体过程是：50 mM Tris-HCl, 10 mM DTT, pH 8.0纯化的Sumo-Lira（实施例5的产物）和Ulp1质量比是10:1~1:1(mg/mg)，在不同时间取样，采用Tricine检测其切割效率，并检测是否有目标多肽生成，24 h切割效率就能到达80%以上。Sumo-Teri和Sumo-Nesi的酶切条件与Sumo-Lira相同。
实施例9
乙腈/加热沉淀法纯化目标多肽
实施例8的酶切完成之后，调整pH于5.6，然后在反应体系加入不同终浓度的乙腈（20%，30%，40%，50%，60%，70%），混匀后在70度热处理2 h，之后12000 rpm离心分离上清和沉淀，Tricine检测多肽的分步情况，结果发现在组合条件下，乙腈浓度从20-70%都有着较好的初步纯化效果，处理后利拉鲁肽前体粗品的纯度可以达到90%以上（图 6），Nesi的纯度可以达到80%，Teri纯度达到50%（图 7）。进一步采用旋转蒸发或冻干法去除多肽粗品中的乙腈，然后重溶于50 mM Tris-HCl pH7.0, 并进行制备级HPLC纯化。
六氟异丙醇（hexafluoroisopropanol，HFIP）沉淀利拉鲁肽前体
实施例8的酶切完成之后，调整pH于5.6，向反应体系中分别加入10%-70 %（v/v）的六氟异丙醇，室温沉淀1 h，离心收集上清和沉淀，使用Tricine-SDS-PAGE检测不同浓度六氟异丙醇对于利拉鲁肽前体的选择性沉淀效果，结果如图9所示：使用50%的六氟异丙醇选择性沉淀后，上清液中的利拉鲁肽前体浓度约90% （图 8）。进一步采用旋转蒸发或冻干法去除多肽粗品中的六氟异丙醇，然后重溶于50 mM Tris-HCl pH7.0, 并进行制备级HPLC纯化。
实施例10
制备HPLC 纯化目标多肽
实施例9的产物，采用 UniSil AQ C18 10μm 21.5*250mm，所用的所用缓冲液为缓冲液A为0.1% TFA，缓冲液B为乙腈。Lira采用梯度洗脱方式如下：0 min 5% B，5 min 5%B，25 min 50% B，27 min 95% B，33 min 95% B，38 min 5%B，紫外检测器210 nm，流速25 mL/min，温度为25℃，结果如图9所示：Lira在24 min附近被洗脱，之后将样品收集旋转蒸发去除大部分溶剂后冻干，纯度采用HPLC方法加测，结果表明Lira纯度达到98%以上（图 10）。
Nesi采用的梯度洗脱方式如下：5 min 5%B，35 min 30%B, 40 min 95%B, 紫外检测器210 nm，流速25 mL/min，温度为25℃，结果如图11所示：Nesi 在30 min被洗脱，之后将样品收集旋转蒸发去除大部分溶剂后冻干，纯度采用HPLC方法加测，结果表明Nesi纯度达到98%以上（图 12）。
Teri采用的梯度洗脱方式如下：5 min 5%B，35 min 30%B, 47.8 min 42.8%B，50.5 min 42.8%B，57.7 min 50%B，67.7 min 95%B, 40 min 95%B, 紫外检测器210 nm，流速25 mL/min，温度为25℃，结果如图13所示：Teri 在43 min左右被洗脱，之后将样品收集旋转蒸发去除大部分溶剂后冻干，纯度采用HPLC方法检测，分析柱：Eclipse plus C18 4.6×100 mm 3.5 μm, 210 nm 检测， flow=1.5 ml/min, 洗脱梯度是0 min 10%B 9 min95%B12 min 100%，12.1 min 10%B，15 min 10%。结果表明Teri纯度达到~78%（图 14）。
利拉鲁肽前体采用此方法制备，从1 g 摇瓶发酵菌泥中可以获得3-4 mg 纯度为98%的利拉鲁肽前体，通过此方法制备 1 g菌泥可以获得1.26 mg 纯度为98%的Nesi，通过此方法制备 1 g菌泥可以获得1.55 mg 纯度为78%的Teri，通过进一步发酵优化提高融合蛋白的表达水平有望进一步提高目标多肽的得率。
实施例 11
质谱检测多肽分子量
制备的多肽（实施例10的产物）分子量采用LC-MS进行分析。具体如下：样品先经过HPLC 柱子分离：Agilent ZORBAX Edipse Plus C18,4.6*100mm, 3.5μm，流动相A：0.1%三氟乙酸，流动相B: 0.1%三氟乙酸乙腈溶液，采用梯度洗脱方式：0 min 10%B，9 min 95%B，12 min 100%B，12.1 min 10%B,15 min 10%B，柱温40℃，紫外检测器210 nm，流速1.5 mL/min，经过HPLC分离后的组分采用安捷伦6200系列飞行时间液质联用仪进行结构鉴定，采用电喷雾离子源（Dual AJS ESI），正离子模式检测，喷雾压力35 psig，离子源温度300℃，干燥气（N2）流速10 L/min，扫描范围100~2000 m/z，碎裂电压70 V，并通过Analyst软件采集和处理质谱数据。Lira的理论分子量为3383.7 Da，质谱解析的分子量是3382.7（图15），Nesi的理论分子量为3464.8，质谱解析分子量是3463.7（图16），Teri的理论分子量是4117.7，质谱解析的分子量是4118.7（图17）。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
<120> 多肽的制备方法
<130> PN144395KLY
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 411
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(411)
<223> Sumo标签+利拉鲁肽前体基因
<400> 1
catatgggcg gcagtctgca agatagcgaa gtgaatcaag aagcgaagcc agaagtgaaa 60
ccggaagtta aaccggagac ccacatcaat ctgaaggtga gcgacggcag cagcgagatc 120
ttcttcaaga tcaagaagac gaccccgctg cgtcgtctga tggaagcctt cgccaaacgc 180
caaggcaaag aaatggacag tctgcgcttt ctgtacgatg gtatccgcat ccaagccgat 240
caagccccgg aagatctgga catggaggac aacgacatca tcgaggcgca tcgcgaacag 300
atcggcggcc atgccgaagg caccttcacc agcgatgtta gcagctatct ggaaggccaa 360
gccgccaaag aattcatcgc gtggctggtt cgcggccgcg gttagctcga g 411
<210> 2
<211> 414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(414)
<223> Sumo标签+Nesiritide基因
<400> 2
catatgggcg gcagtctgca agatagcgaa gtgaatcaag aagcgaagcc agaagtgaaa 60
ccggaagtta aaccggagac ccacatcaat ctgaaggtga gcgacggcag cagcgagatc 120
ttcttcaaga tcaagaagac gaccccgctg cgtcgtctga tggaagcctt cgccaaacgc 180
caaggcaaag aaatggacag tctgcgcttt ctgtacgatg gtatccgcat ccaagccgat 240
caagccccgg aagatctgga catggaggac aacgacatca tcgaggcgca tcgcgaacag 300
atcggcggct ctccgaaaat ggttcagggt tctggttgct tcggtcgtaa aatggaccgt 360
atctcttctt cttctggtct gggttgcaaa gttctgcgtc gtcactagct cgag 414
<210> 3
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(420)
<223> Sumo标签+Teriparatide基因
<400> 3
catatgggcg gcagtctgca agatagcgaa gtgaatcaag aagcgaagcc agaagtgaaa 60
ccggaagtta aaccggagac ccacatcaat ctgaaggtga gcgacggcag cagcgagatc 120
ttcttcaaga tcaagaagac gaccccgctg cgtcgtctga tggaagcctt cgccaaacgc 180
caaggcaaag aaatggacag tctgcgcttt ctgtacgatg gtatccgcat ccaagccgat 240
caagccccgg aagatctgga catggaggac aacgacatca tcgaggcgca tcgcgaacag 300
atcggcggct ctgtttctga aatccagctg atgcacaacc tgggtaaaca cctgaactct 360
atggaacgtg ttgaatggct gcgtaaaaaa ctgcaggacg ttcacaactt ctaactcgag 420
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(52)
<223> 引物Ulp1-F
<400> 4
gggcatatgg atcttaaaaa aaagaaagaa caattggcca agaagaaact tg 52
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(42)
<223> 引物是Ulp1-R
<400> 5
gggctcgagg tattttaaag cgtcggttaa aatcaaatgg gc 42
<210> 6
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(699)
<223> Ulp1 蛋白酶基因
<400> 6
gatcttaaaa aaaagaaaga acaattggcc aagaagaaac ttgttcctga attaaatgaa 60
aaagacgatg accaagtaca aaaagctttg gcatctagag aaaatactca gttaatgaat 120
agagataata tagagataac agtacgtgat tttaagacct tggcaccacg aagatggcta 180
aatgacacta tcattgagtt ttttatgaaa tacattgaaa aatctacccc taatacagtg 240
gcgtttaatt catttttcta taccaattta tcagaaaggg gttatcaagg cgtccggagg 300
tggatgaaga gaaagaagac acaaattgat aaacttgata aaatctttac accaataaat 360
ttgaaccaat cccactgggc gttgggcata attgatttaa aaaagaaaac tataggttac 420
gtagattcat tatcgaatgg tccaaatgct atgagtttcg ctatactgac tgacttgcaa 480
aaatatgtta tggaggaaag taagcataca ataggagaag actttgattt gattcattta 540
gattgtccgc agcaaccaaa tggctacgac tgtggaatat atgtttgtat gaatactctc 600
tatggaagtg cagatgcgcc attggatttt gattataaag atgcgattag gatgagaaga 660
tttattgccc atttgatttt aaccgacgct ttaaaatag 699

Claims (11)

1.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建Sumo标签融合表达多肽基因的工程菌株，并诱导所述工程菌株可溶表达所述多肽；
从所述工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白；
对含有所述多肽前体的粗蛋白采用Ulp1蛋白酶进行酶切，切除所述Sumo标签；
采用乙腈结合加热沉淀的方法或采用六氟异丙醇沉淀的方法纯化所述Ulp1蛋白酶的酶切产物，得到所述多肽。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述多肽为利拉鲁肽前体、奈西利肽或特立帕肽。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述Ulp1蛋白酶为通过构建Ulp1蛋白酶表达菌株并诱导表达获得，其中，所述Ulp1蛋白酶与伴侣蛋白共表达。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述伴侣蛋白为GroEL/S伴侣蛋白。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述乙腈结合加热沉淀的方法包括：将所述Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入乙腈，混匀后在60~80℃热处理0.5~3h，之后离心分离上清和沉淀。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述乙腈为质量百分含量为20~70%的乙腈水溶液。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，从所述工程菌株中纯化得到含有多肽前体的粗蛋白包括：将所述工程菌株的、超声破碎、离心、过滤膜后获得粗酶液，然后采用亲和层析或阴离子柱进行纯化，得到所述粗蛋白。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述六氟异丙醇沉淀的方法包括：将所述Ulp1蛋白酶的酶切产物调整pH至5.6，然后加入六氟异丙醇，混匀后在室温沉淀1 h，之后离心分离上清和沉淀。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述六氟异丙醇为质量百分含量为20~70%的六氟异丙醇水溶液。
10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述六氟异丙醇为质量百分含量为50%的六氟异丙醇水溶液。
11.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述制备方法进一步包括采用HPLC 纯化目标多肽的步骤。
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