CN105647960A - 重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法 - Google Patents

重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法，该诱导表达以及纯化方法包括：1)重组表达质粒的构建：设计带有EcoR？I和Not？I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段；2)筛选高抗性重组基因工程菌株；3)重组luansin多肽的发酵生产；4)重组luansin多肽的分离纯化：得到纯度为93％的重组lunasin多肽。本发明首次提出使用毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽，通过基因工程的方法使luansin多肽的规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低，产量高，分立纯化步骤简单。

Description

重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种在毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽的方法，具体为重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及生理活性鉴定方法。
背景技术
Lunasin是一种含有43个氨基酸的新型多肽，首次从大豆种子中分离鉴定。研究表明lunasin具有很多特别的生理活性，包括抗癌和抗炎等。除此以外，专利201510224932.9公开了lunasin能够通过PPAR通路抑制小鼠前体脂肪细胞(3T3-L1)分化而具备潜在的减肥活性。然而，在天然作物中，Lunasin的含量较低，从中分离纯化Lunasin步骤繁琐，且得率较低，这使得大多关于Lunasin活性的研究都以昂贵的合成Lunasin为原料而限制其进一步研究及应用。
目前，国内尚无关于如何利用基因工程方法，将Lunasin基因片段克隆转载到毕赤酵母中，经过诱导表达和纯化步骤生产出高活性真核表达Lunasin的报到。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及生理活性鉴定方法，其利用基因工程方法，将Lunasin基因片段克隆转载到毕赤酵母中，经过诱导表达和纯化步骤生产出高活性真核表达Lunasin。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，包括以下步骤：
1)重组表达质粒的构建
设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段。将目的基因片段用限制性内切酶EcoRI酶和NotI酶进行双酶切，然后将用相同限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶连接，通过热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin；
2)筛选高抗性重组基因工程菌株
将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经SacI线性化酶切，将经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例12μL：80μL混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin；
3)重组luansin多肽的发酵生产
将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株GS115/pPIC9K-lunasin接种于BMGY培养基中，在30℃下培养直至OD600为2.0-4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于BMMY培养基中培养直至OD600为1.0-2.0，0.5％甲醇诱导表达；经甲醇诱导重组lunasin多肽的发酵液高速离心除去细胞后，上清液使用Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，鉴定出分子量5KDa左右的重组lunasin多肽特征条带，以筛选得到高表达lunasin多肽的基因工程菌株；
4)重组luansin多肽的分离纯化
将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经高速离心除去菌体后，上清中加入CaCl2溶液，充分混匀后室温静置5min，高速离心得到沉淀，该沉淀经真空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物；
将粗产物以浓度为10mg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰时间分部分收集洗脱液，真空干燥后，经Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，收集lunasin多肽富集洗脱液，合并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干燥后得到纯度为93％的重组lunasin多肽。
优选地，上述技术方案中，步骤1)中设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列为：
GAATTCTCCAAATGGCAGCACCAGCAAGACAGCTGCCGCAAGCAGCTCCAGGGGGTGAACCTCACGCCTTGCGAGAAGCACATCATGGAGAAGATCCAAGGCCGCGGCGATGACGATGATGATGATGACGACGACGCGGCCCTACTACTACTGCTGCTGCGCCGG。
优选地，上述技术方案中，步骤1)中特异性扩增引物为：
上游引物：5’-GGAATTCTCCAAATGGCAGCAC-3’，
下游引物：5’-TTGGCCGCGTCGTCGTCATCATC-3’。
优选地，上述技术方案中，步骤2)中感受态毕赤酵母GS115制备方法包括以下步骤：
从YPD平板上挑取一个新鲜的毕赤酵母GS115单克隆至10mlYPD液体培养基，30℃，250rpm培养过夜；测定过夜培养物的OD600值为3.0-5.0之间；将10mlYPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2-0.4；在28-30℃摇床中继续培养8-12h，使其OD600值达到1.0-1.5；于室温1500g离心5min收集酵母细胞，弃上清；用10ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5min离心收集细胞，弃上清；用1ml山梨醇溶液重悬酵母细胞，以每管50μl分装。
优选地，上述技术方案中，步骤2)中经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例12μL：80μL混合后进行电击转化。
优选地，上述技术方案中，步骤3)中：
BMGY培养基配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1.0％甘油，10.0％(v/v)pH6.0磷酸缓冲液；
BMMY培养基配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，10.0％(v/v)pH6.0磷酸缓冲液。
优选地，上述技术方案中，步骤3)中诱导表达时间为60h，每隔24h补充甲醇至终浓度为0.5％。
优选地，上述技术方案中，步骤3)中Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳条件为：40V40min，85V240min，电泳环境保持在4℃。
优选地，上述技术方案中，步骤4)中上样量为5mL，平衡液为含有EDTA的pH6.8PBS,流速4mL/min，洗脱液为1MNaCl浓度梯度30％-50％，每8mL收集一管。
优选地，上述技术方案中，步骤4)中CaCl2溶液初始浓度为1M，终浓度为10-20mM。
优选地，上述技术方案中，步骤4)中收集洗脱液过10KDa超滤膜，收集滤出液，再过1KDa超滤膜，收集浓缩液。
优选地，上述技术方案中，步骤4)中HPLC检测条件为：分离柱为C18(4.6mm*250mm,5um)，检测器为UV检测器，检测波长为215nm，流速为1mL/min，A相0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈，线性梯度：B相15％～35％，20min。
一种根据上述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达及纯化方法获得的纯化的重组lunasin多肽的活性鉴定方法，包括以下步骤：
将3T3-L1前体脂肪细胞以10000个细胞/mL密度接种于12孔板，生长融合后，再培养48h，加诱导液Ⅰ，所述诱导液Ⅰ包含10％FBS，1％双抗，10μg/ml胰岛素，0.5mMIBMX和0.1μMDEX的DMEM培养基培养；培养48h后更换为诱导液Ⅱ，所述诱导液Ⅱ包含5μg/ml胰岛素的DMEM培养基培养；培养48h后更换为含有50μg/ml重组Lunasin多肽的DMEM培养基，并以5μg/ml罗格列酮作为阳性对照组，不加lunasin作为空白对照组，继续培养48h后，10％甲醛缓冲液固定4h，油红染色1h，显微镜下观察脂滴堆积状况，并使用1mL异丙醇提取，在492nm下测定吸光度。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
Lunasin是一种含有43个氨基酸的新型多肽，其氨基酸序列为SKWQHQQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD。首次从大豆种子中分离鉴定。本发明首次提出使用毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽，通过基因工程的方法使luansin多肽的规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低，产量高，分立纯化步骤简单。
附图说明
图1为本发明的构建重组表达质粒pPIC9K-lunasinPCR图。
图2A为本发明的MM培养基表型筛选结果。
图2B为本发明的MD培养基表型筛选结果。
图3为本发明的阳性克隆菌PCR鉴定结果。
图4为本发明的诱导表达产物Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳图。
图5A为本发明的重组lunasin多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的空白对照组图。
图5B为本发明的重组lunasin多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的罗格列酮组图。
图5C为本发明的重组lunasin多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的重组lunasin组-50图。
图5D为本发明的重组lunasin多肽对小鼠前体脂肪细胞分化抑制作用图的重组lunasin组-100图。
图6为本发明的重组lunasin多肽HPLC色谱图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。若本发明未特别指明，实施例均按照常规实验条件以及常规实验手册规定的配方及方法进行。本发明未特别指明的物质均为来源于普通市面。
实施例1
(1)重组表达质粒的构建
选择分泌性毕赤酵母表达质粒pPIC9K(市售)作为目的基因表达载体，设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列为GAATTCTCCAAATGGCAGCACCAGCAAGACAGCTGCCGCAAGCAGCTCCAGGGGGTGAACCTCACGCCTTGCGAGAAGCACATCATGGAGAAGATCCAAGGCCGCGGCGATGACGATGATGATGATGACGACGACGCGGCCCTACTACTACTGCTGCTGCGCCGG。
设计特异性扩增引物为：上游引物：5’-GGAATTCTCCAAATGGCAGCAC-3’；下游引物：5’-TTGGCCGCGTCGTCGTCATCATC-3’。进行PCR扩增获得目的基因片段。PCR条件为：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环，72℃10min。
使用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，将用相同限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR产物用T4DNA连接酶连接，热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin。
上述酶切体系为：10*buffer2uL,EcoRI0.5uL,NotI0.5uL,载体10uL/目的基因6uL，ddH2O补足20uL,37℃反应2h。
上述连接体系为：2*buffer5uL，载体1uL，目的基因3.5ul，T4连接酶0.5uL，4℃反应过夜。
(2)筛选高抗性重组基因工程菌株
将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经SacI线性化酶切(酶切体系为：10*buffer2uL，重组质粒10uL，Sac酶0.5uL，ddH2O补足20uL，37℃反应4h)后，将电击转化入感受态毕赤酵母GS115细胞获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，30℃倒置恒温培养2-3d，在MD培养及生长良好而在MM培养基上不生长的菌落，挑取进行PCR鉴定，经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin。
上述电击条件为：电压1.5kv，电容25uF，电阻200Ω，电击时间4-10msec；经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例12μL：80μL混合后进行电击转化。
上述感受态毕赤酵母GS115制备方法为：从YPD平板上挑取一个新鲜的毕赤酵母GS115单克隆至10mlYPD液体培养基，30℃，250rpm培养过夜；测定过夜培养物的OD600值为3.0-5.0之间；将10mlYPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2-0.4；在28-30℃摇床中继续培养8-12h，使其OD600值达到1.0-1.5；于室温1500g离心5min收集酵母细胞，弃上清；用10ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5min离心收集细胞，弃上清；用1ml山梨醇溶液重悬酵母细胞，以每管50μl分装。
(3)重组lunasin多肽的发酵生产
第一步富集菌体
将获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株GS115/pPIC9K-lunasin接种于50mLBMGY培养基中。
其中，BMGY养基包含：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB(无氨基酵母氮源)，4×10-5％生物素，1.0％甘油，10.0％(v/v)pH6.0磷酸缓冲液。在30℃下培养至OD600值为2.0-4.0之间(12h-36h)，离心(3500rmp,15min)弃上清，收集细胞。
第二步诱导表达
将收集得到菌体重悬于150mlBMMY培养基中。
其中，BMMY培养基包括：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，10.0％(v/v)pH6.0磷酸缓冲液。使OD600值为1.0-2.0之间，分别在25℃、28℃、30℃、32℃条件下诱导表达，每24h补充甲醇至终浓度为0.5％，于12h、24h、36h、48h、60h、72h分别取2ml发酵液，高速离心(12000rmp，20min)取上清，一部分使用BCA法进行总蛋白含量测定，另一部分等量上样进行Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，电泳条件为40V40min,85V240min，电泳环境保持在4℃。鉴定并比较重组lunasin多肽表达量，筛选表达量最高菌株及诱导条件。
(4)重组luansin多肽的分离纯化
取500ml经30℃，60h诱导表达的发酵液，高速离心收集上清后，加入1MCaCl2溶液，使其终浓度为10-20mM，充分混匀后室温静置5min，高速离心得到沉淀经真空冷冻干燥得到重组lunasin多肽粗产物。
将该粗产物以浓度为10mg/mL溶解，过DEAE阴离子交换柱，上样量为5mL，平衡液为含有EDTA(乙二胺四乙酸)的pH6.8PBS(磷酸缓冲液),流速4mL/min,洗脱液为1MNaCl浓度梯度30％-50％，每8mL收集一管。经Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，收集lunasin多肽富集洗脱液，合并后过过10KDa超滤膜，收集滤出液，再过1KDa超滤膜，收集浓缩液。浓缩液经真空冷冻干燥后得到纯化的重组lunasin多肽。如图6所示，纯化的重组lunasin多肽经HPLC检测纯度为93％以上。
HPLC检测条件为：分离柱为C18(4.6mm*250mm,5um)，检测器为UV检测器，检测波长为215nm，流速为1mL/min，A相0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈，线性梯度：B相15％～35％，20min。
实施例2重组lunasin多肽的生理活性鉴定
3T3-L1前体脂肪细胞以10000个细胞/mL密度接种于12孔板，生长融合后，再培养48h，加诱导液Ⅰ，所述诱导液Ⅰ为包含10％FBS，1％双抗，10μg/ml胰岛素，0.5mMIBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)和0.1μMDEX(地塞米松)的DMEM培养基培养；培养48h后更换为诱导液Ⅱ，所述诱导液Ⅱ为包含5μg/ml胰岛素的DMEM培养基培养；培养48h后更换为含有50μg/ml(重组lunasin组-50)或100μg/ml(重组lunasin组-100)重组Lunasin多肽的DMEM培养基，并以5μg/ml罗格列酮作为阳性对照组，不加lunasin作为空白对照组，继续培养48h后，10％甲醛缓冲液固定4h，油红染色1h，400倍显微镜下观察脂滴堆积状况，并使用1mL异丙醇提取，在492nm下测定吸光度。
本发明首次提出使用毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽，通过基因工程的方法使luansin多肽的规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低，产量高，分立纯化步骤简单。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)重组表达质粒的构建
设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoRI酶和NotI酶进行双酶切，然后将用相同限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶连接，通过热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin；
2)筛选高抗性重组基因工程菌株
将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经SacI线性化酶切，将经酶切线性化的重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，经过PCR鉴定及G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin；
3)重组luansin多肽的发酵生产
将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株GS115/pPIC9K-lunasin接种于BMGY培养基中，在30℃下培养直至OD600为2.0-4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于BMMY培养基中培养直至OD600为1.0-2.0，0.5％甲醇诱导表达；经甲醇诱导重组lunasin多肽的发酵液高速离心除去细胞后，上清液使用Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，以筛选得到高表达lunasin多肽的基因工程菌株；
4)重组luansin多肽的分离纯化
将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经高速离心除去菌体后，上清中加入CaCl2溶液，充分混匀后室温静置5min，高速离心得到沉淀，该沉淀经真空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物；
将粗产物以浓度为10mg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰时间分部分收集洗脱液，真空干燥后，经Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，收集lunasin多肽富集洗脱液，合并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干燥后得到纯度为93％的重组lunasin多肽。
2.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，步骤1)中设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列为：
GAATTCTCCAAATGGCAGCACCAGCAAGACAGCTGCCGCAAGCAGCTCCAGGGGGTGAACCTCACGCCTTGCGAGAAGCACATCATGGAGAAGATCCAAGGCCGCGGCGATGACGATGATGATGATGACGACGACGCGGCCCTACTACTACTGCTGCTGCGCCGG。
3.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，步骤1)中特异性扩增引物为：
上游引物：5’-GGAATTCTCCAAATGGCAGCAC-3’，
下游引物：5’-TTGGCCGCGTCGTCGTCATCATC-3’。
4.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，步骤2)中感受态毕赤酵母GS115制备方法包括以下步骤：
从YPD平板上挑取一个新鲜的毕赤酵母GS115单克隆至10mlYPD液体培养基，30℃，250rpm培养过夜；测定过夜培养物的OD600值为3.0-5.0之间；将10mlYPD过夜培养物稀释至OD600值为0.2-0.4；在28-30℃摇床中继续培养8-12h，使其OD600值达到1.0-1.5；于室温1500g离心5min收集酵母细胞，弃上清；用10ml洗液洗酵母细胞，随后于室温1500g离心5min离心收集细胞，弃上清；用1ml山梨醇溶液重悬酵母细胞，以每管50μl分装。
5.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，步骤3)中：
BMGY培养基配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1.0％甘油，10.0％(v/v)pH6.0磷酸缓冲液；
BMMY培养基配方为：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇，10.0％(v/v)pH6.0磷酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，步骤3)中诱导表达时间为60h，每隔24h补充甲醇至终浓度为0.5％。
7.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，步骤3)中Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳条件为：40V40min，85V240min，电泳环境保持在4℃。
8.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，步骤4)中上样量为5mL，平衡液为含有EDTA的pH6.8PBS,流速4mL/min，洗脱液为1MNaCl浓度梯度30％-50％，每8mL收集一管。
9.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法，其特征在于，步骤4)中收集洗脱液过10KDa超滤膜，收集滤出液，再过1KDa超滤膜，收集浓缩液。
10.一种根据上述任一权利要求所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达及纯化方法获得的纯化的重组lunasin多肽的活性鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将3T3-L1前体脂肪细胞以10000个细胞/mL密度接种于12孔板，生长融合后，再培养48h，加诱导液Ⅰ，所述诱导液Ⅰ包含10％FBS，1％双抗，10μg/ml胰岛素，0.5mMIBMX和0.1μMDEX的DMEM培养基培养；培养48h后更换为诱导液Ⅱ，所述诱导液Ⅱ包含5μg/ml胰岛素的DMEM培养基培养；培养48h后更换为含有50μg/ml重组Lunasin多肽的DMEM培养基，并以5μg/ml罗格列酮作为阳性对照组，不加lunasin作为空白对照组，继续培养48h后，10％甲醛缓冲液固定4h，油红染色1h，显微镜下观察脂滴堆积状况，并使用1mL异丙醇提取，在492nm下测定吸光度。
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