CN101492661A - 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备 - Google Patents

一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备 Download PDF

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Abstract

一种β－葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由黑曲霉WX－07总RNA逆转录合成β－葡萄糖苷酶基因(bgl)SEQ ID NO：1，bgl的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母(P.pastoris)为表达宿主，实现bgl基因在胞外的可溶性表达；bgl的cDNA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，构建的bgl/pPIC9K转化P.pastoris KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精制，达到较好效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。

Description

一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及用于龙胆低聚糖的制备
技术领域
本发明涉及一种编码黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07 BGL酶的DNA序列及其表达，构建高效表达β-葡萄糖苷酶的酵母基因工程菌，以及β-葡萄糖苷酶制剂和β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制备低聚龙胆糖的方法。属于酶基因工程和酶工程领域。
背景技术
龙胆低聚糖是一类由葡萄糖以β-1，6糖苷键结合的新型功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。作为功能性食品配料，龙胆低聚糖除了具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能外，与其他功能性低聚糖相比，它还能更好地促进人体小肠中双歧菌和乳酸菌的繁殖；并且耐热、耐酸，可应用于其他一些低聚糖不适宜使用的保健食品中。虽然龙胆低聚糖具有广阔的应用前景，但目前只有日本的Nihon Shokuhin Kako公司进行工业化生产，主要在日本销售。龙胆低聚糖的制取方法很多。早期采取从植物中提取，因为受到原料的限制，产量不高。目前酶法制取成为最有效地降低成本，大规模生产的途径。工业上采用高浓度的葡萄糖为原料，经β-葡萄糖苷酶转糖苷和缩合，再经分离精制得到不同规格的龙胆低聚糖成品。
β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21)属于水解酶类，但也具有转糖苷活性，可使低聚糖的非还原末端糖苷键断裂，释放出葡萄糖，并将游离的葡萄糖基以β-1，6糖苷键形式转移到其他糖底物上获得龙胆低聚糖。BGL广泛存在于自然界许多植物和微生物中，但酶活普遍较低，且不易纯化，所以运用基因工程手段构建高效表达BGL的工程菌成为当今研究β-葡萄糖苷酶的热点。
到目前为止，已有上百个微生物β-葡萄糖苷酶基因得到克隆，其中一些获得异源表达。早期主要选用大肠杆菌为宿主，近年来随着真核表达体系的建立与完善，研究表明β-葡萄糖苷酶基因在酵母中表达比在大肠杆菌中表达的表达量和酶活性普遍要高些，所以酵母表达系统被广泛应用。由于β-葡萄糖苷酶的水解活性在纤维素的完全降解中起到至关重要的作用，目前对于β-葡萄糖苷酶的研究大多集中于其水解活性，转苷活性的报道很少。Heather F.Seidle等人曾研究过黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶转苷活性与pH的关系，虽提到龙胆二糖是转苷产物，但是在其研究过程中以纤维二糖为底物龙胆糖产物量仅有约5.4g/L。国内学者主要致力于克隆表达β-葡萄糖苷酶基因以及研究其水解酶学性质，没有涉及转苷活性。至于利用重组β-葡萄糖苷酶的转苷活性酶法生产龙胆低聚糖未见报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供包含β-葡萄糖苷酶基因的酵母基因工程菌。本发明的另一个目的是提供本发明基因工程菌生产β-葡萄糖苷酶制剂，本发明的再一个目的是提供以β-葡萄糖苷酶转化葡萄糖制取龙胆低聚糖的生产工艺。
本发明的技术方案：
一种β-葡萄糖苷酶，缩写为BGL酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述的β-葡萄糖苷酶的基因，缩写为bgl基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达方法，由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成bgl的cDNA SEQ ID NO：1，bgl基因以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，实现bgl基因的可溶性表达；黑曲霉WX-07已在【中国酿造2007年第5期】公开。
(1)黑曲霉WX-07总RNA的提取：
黑曲霉WX-07菌株在PD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，用PBS缓冲液清洗菌体一次，加入1mL TRI REAGENT(购于Sigma公司)，用移液枪反复吹吸以裂解细胞；12,000×g、4℃离心10min以移除不溶物；将上清转移到一个干净的离心管，将样品在室温下放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s，在室温下放置10min，12,000×g、4℃离心15min，取上层无色水相于一干净的离心管，加入500μL异丙醇，混匀，在室温下放置10min，12,000×g，4℃离心10min，弃上清，加入1mL由DEPC-H2O(购于宝生物工程有限公司)配制的质量浓度75％乙醇，漩涡混匀，然后12,000×g、4℃离心5min，弃上清，让RNA自然干燥10min，加40μLDEPC-H2O溶解RNA沉淀，为模板RNA，-20℃保存；
(2)β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：
以黑曲霉WX-07总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下PrimeScript RTase、5×PrimeScript Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、OligodT Primer、Random 6mers、Rnase free H2O均来自于试剂盒“PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit”，购于宝生物工程有限公司)，
①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液：
50μM的Oligo dT Primer或Random 6mers    1μL，
10mM的dNTP Mixture                      1μL，
总RNA                                   1μg，
和Rnase free H2O                        添加至总体系10μL；
②65℃保温5min后冰上急冷；
③在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：
步骤①配制的RNA/Primer混合液            10μL，
5×PrimeScript Buffer          4μL，
40U/μL的RNase Inhibitor       0.5μL，
200U/μL的PrimeScript RTase    1μL，
Rnase free H2O                 4.5μL；
④在50℃下保温1小时；
若步骤①中使用Random Primer时，需先在30℃保温10min，然后再在50℃下保温1小时；
⑤70℃保温15min后冰上冷却，得到的反应液立刻用于cDNA第二链的合成；以cDNA第一条链为模板，以P1，P2为上下游引物扩增出bgl基因：
引物P1：5’-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3’
引物P2：5’-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’
PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，模板DNA2μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；
PCR反应条件为：在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；
(3)bgl/pPIC 9K质粒的构建：
用于构建重组质粒的表达载体是pPIC 9K，带有a-Factor信号肽，将pPIC9K质粒和扩增的bgl基因进行NotI和EcoRI酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的bgl/pPIC 9K质粒；
(4)毕赤酵母KM71转化和筛选重组菌：
将质粒bgl/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；
在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，电击，转化物中加入1mL 1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的bgl基因的重组菌，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL；
pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；
(5)重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC 9K的PCR鉴定：
选取含1mg/mL G418的YPD/G418上单菌落，以引物P1、P2作引物，用前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到bgl全基因；重组毕赤酵母KM71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM71/bgl/pPIC 9K用于后续实验；
(6)重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC 9K的培养：
将鉴定正确的单菌落KM 71/bgl/pPIC 9K接种至5mL YPD培养基，200r/min，30℃培养16h；以10％的接种量接入装50mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，30℃培养24h，离心收集全部菌体；转入50mL BMMY培养基的250mL三角瓶中，30℃，培养120h，在该培养阶段中每24h补加0.5％的甲醇，并取样200μL，用于SDS-PAGE检测；阴性对照重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K培养方法同上；
(7)重组β-葡萄糖苷酶的转苷检测：
步骤(6)所取表达产物样品进行SDS-PAGE检测，表达产物在12kDa应有条带；收集步骤(6)的重组毕赤酵母发酵培养的上清液经PEG浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成BGL粗酶液；
检验转苷活性如下：用pH4.5的醋酸缓冲液配制50％的葡萄糖溶液10mL，加入400μL BGL粗酶液，50℃反应24h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成。
所述β-葡萄糖苷酶的应用，用于龙胆低聚糖的制备：
(a)β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化：
底物葡萄糖质量浓度为80％，pH4.5，β-葡萄糖苷酶的加酶量为每克葡萄糖60U，添加1mmol/L的K+，转化温度为60℃，转化时间为48h；
(b)龙胆低聚糖的分离精制：
将步骤(b)的酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，然后在30℃下用带有保温夹套的树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02进行分离提纯。
本发明的有益效果：本发明由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成bgl基因SEQ ID NO：1，bgl的cDNA以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母为表达宿主，实现bgl基因在胞外的可溶性表达；bgl的cDNA全长2523个核苷酸，编码841个氨基酸，真核表达质粒bgl/pPIC9K构建成功后，转化P.pastoris KM71可表达BGL酶。BGL酶具有转糖苷活性，能将葡萄糖转糖苷生成龙胆低聚糖。优化酶法制备龙胆低聚糖的工艺，并利用阳离子树脂进行分离精致，达到较好的效果。制得的龙胆低聚糖产品作为功能性食品配料，具有低热量，低龋齿，整肠等生理功能。本发明为龙胆低聚糖的制备提供了具有商业化价值的新途径。
附图说明
图1重组BGL酶SDS-PAGE图谱。图中泳道1：重组毕赤酵母KM71/pPIC9K发酵液SDS-PAGE图谱；图中泳道M：蛋白质分子量标准；图中泳道2：重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC9K发酵液SDS-PAGE图谱。
图2重组BGL酶转化葡萄糖制取龙胆低聚糖的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1：本实施例说明黑曲霉WX-07总RNA的提取。
黑曲霉WX-07菌株在PD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，用PBS缓冲液清洗菌体一次，加入1mL TRI REAGENT(购于Sigma公司)，用移液枪反复吹吸以裂解细胞；12,000×g、4℃离心10min以移除不溶物；将上清转移到一个干净的离心管，将样品在室温下放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s，在室温下放置10min，12,000×g、4℃离心15min，取上层无色水相于一干净的离心管，加入500μL异丙醇，混匀，在室温下放置10min，12,000×g，4℃离心10min，弃上清，加入1mL由DEPC-H2O(购于宝生物工程有限公司)配制的质量浓度75％乙醇，漩涡混匀，然后12,000×g、4℃离心5min，弃上清，让RNA自然干燥10min，加40μLDEPC-H2O溶解RNA沉淀，为模板RNA，-20℃保存；
实施例2：本实施例说明β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆。
以黑曲霉WX-07总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链(以下PrimeScript RTase、5×PrimeScript Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、OligodT Primer、Random 6mers、Rnase free H2O均来自于试剂盒“PrimeScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit”，购于宝生物工程有限公司)，
①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液：
50μM的Oligo dT Primer或Random 6mers    1μL，
10mM的dNTP Mixture                      1μL，
总RNA                                   1μg，
和Rnase free H2O                        添加至总体系10μL；
②65℃保温5min后冰上急冷；
③在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：
步骤①配制的RNA/Primer混合液            10μL，
5×PrimeScript Buffer                   4μL，
40U/μL的RNase Inhibitor                0.5μL，
200U/μL的PrimeScript RTase             1μL，
Rnase free H2O                          4.5μL；
④在50℃下保温1小时；
若步骤①中使用Random Primer时，需先在30℃保温10min，然后再在50℃下保温1小时；
⑤70℃保温15min后冰上冷却，得到的反应液立刻用于cDNA第二链的合成；以cDNA第一条链为模板，以P1，P2为上下游引物扩增出bgl基因：
引物P1：5’-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3’
引物P2：5’-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’
PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，模板DNA2μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；
PCR反应条件为：在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，分别割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；
实施例3：本实施例说明bg基因在表达载体上的构建。
用于构建表达载体的质粒是pPIC 9K，带有a-Factor信号肽，将pPIC 9K质粒和扩增的bgl基因进行NotI和EcoRI酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的bgl/pPIC 9K质粒。
实施例4：本实施例说明毕赤酵母菌KM71转化和筛选重组菌。
将表达载体bgl/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；
在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，将电转化仪调至毕赤酵母档，电激，转化物中加入1mL1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的bgl基因的菌株，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL；
pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照。
实施例5：本实施例说明重组β-葡萄糖苷酶的转苷检测。
SDS-PAGE检测表达产物在12kDa有条带。收集重组毕赤酵母发酵培养的上清液经PEG浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成粗酶液，检验转苷活性如下：用pH4.5的醋酸缓冲液配制50％的葡萄糖溶液10mL，400μL粗酶液，50℃反应24h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成；
HPLC条件：示差折光检测器，色谱柱：Hypersil NH2，250mm×4.6mm；柱温：30℃；池温(检测器)：30℃；流动相：76％乙腈；流速：1mL/min；进样量：5μL。
质谱条件：离子方式：ESI-、ESI+，离子源温度：100℃，脱溶剂气温度：250℃，质量范围：100-800m/z，选择离子：ESI+：365.5Da；ESI-：341.4Da，光电倍增器电压：650 Volts，Analyser Vacuum：2.6e-5mBar，Gas Flow：4.2lit/hr。
实施例6
重组β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化龙胆低聚糖的分离精制：
通过对龙胆低聚糖酶法生产的关键条件的考察，确定最佳条件：当底物葡萄糖浓度为80％，反应pH4.5，温度为60℃，加酶量为每克葡萄糖60U，添加1mmol/L的K+，转化周期为48h；将酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，用带有保温夹套的16mm×500mm树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02(钙型)进行分离提纯进样量5mL，温度30℃，以水为洗脱剂，洗脱速度1mL/min。
序列表
<210>SEQ ID NO：1
<211>2523
<212>DNA
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07
<400>1
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tcgaaccttg aggtgcaggt gctgagcgcc cctgcatacg agcctgcttc gggtgagacc  1980
gaggcagcgc caaccttcgg agaggttgga aatgcgtcgg attacctcta ccccagcgga  2040
ttgctgagaa ttaccaagtt catctacccc tggctcaacg gtaccgatct cgaggcatct  2100
tccggggatg ctagctacgg gcaggactcc tccgactatc ttcccgaggg agccaccgat  2160
ggctctgcgc aaccgatcct gcctgccggt ggcggtcctg gcggcaaccc tcgcctgtac    2220
gacgagctca tccgcgtgtc agtgaccatc aagaacaccg gcaaggttgc tggtgatgaa    2280
gttccccaac tgtatgtttc ccttggcggt cccaatgagc ccaagatcgt gctgcgtcaa    2340
ttcgagcgca tcacgctgca gccgtcggag gagacgaagt ggagcacgac tctgacgcgc    2400
cgtgaccttg caaactggaa tgttgagaag caggactggg agattacgtc gtatcccaag    2460
atggtgtttg tcggaagctc ctcgcggaag ctgccgctcc gggcgtctct gcctattgtt    2520
cac 2523
<210>SEQ ID NO：2
<211>841
<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)WX-07
<400>2
Asp Glu Leu Ala Tyr  Ser Pro Pro Tyr Tyr  Pro Ser Pro Trp Ala
                  5                   10                   15
Asn Gly Gln Gly Asp  Trp Ala Gln Ala Tyr  Gln Arg Ala Val Asp
                 20                   25                   30
Ile Val Ser Gln Met  Thr Leu Asp Glu Lys  Val Asn Leu Thr Thr
                 35                   40                   45
Gly Thr Gly Trp Glu  Leu Glu Leu Cys Val  Gly Gln Thr Gly Gly
                 50                   55                   60
Val Pro Arg Leu Gly  Val Pro Gly Met Cys  Leu Gln Asp Ser Pro
                 65                   70                   75
Leu Gly Val Arg Asp  Ser Asp Tyr Asn Ser  Ala Phe Pro Ala Gly
                 80                   85                   90
Met Asn Val Ala Ala  Thr Trp Asp Lys Asn  Leu Ala Tyr Leu Arg
                 95                  100                  105
Gly Lys Ala Met Gly  Gln Glu Phe Ser Asp  Lys Gly Ala Asp Ile
                110                  115                  120
Gln Leu Gly Pro Ala  Ala Gly Pro Leu Gly  Arg Ser Pro Asp Gly
                125                  130                  135
Gly Arg Asn Trp Glu  Gly Phe Ser Pro Asp  Pro Ala Leu Ser Gly
                140                  145                  150
Val Leu Phe Ala Glu  Thr Ile Lys Gly Ile  Gln Asp Ala Gly Val
                155                  160                  165
Val Ala Thr Ala Lys  His Yyr Ile Ala Yyr  Glu Gln Glu His Phe
                170                  175                  180
Arg Gln Ala Pro Glu  Ala Gln Gly Phe Gly  Phe Asn Ile Ser Glu
                185                  190                  195
Ser Gly Ser Ala Asn  Leu Asp Asp Lys Thr  Met His Glu Leu Tyr
                200                  205                  210
Leu Trp Pro Phe Ala  Asp Ala Ile Arg Ala  Gly Ala Gly Ala Val
                215                  220                  225
Met Cys Ser Tyr Asn  Gln Ile Asn Asn Ser  Tyr Gly Cys Gln Asn
                230                  235                  240
Ser Tyr Thr Leu Asn  Lys Leu Leu Lys Ala  Glu Leu Gly Phe Gln
                245                  250                  255
Gly Phe Val Met Ser  Asp Trp Ala Ala His  His Ala Gly Val Ser
                260                  265                  270
Gly Ala Leu Ala Gly  Leu Asp Met Ser Met  Pro Gly Asp Val Asp
                275                  280                  285
Tyr Asp Ser Gly Thr  Ser Tyr Trp Gly Thr  Asn Leu Thr Ile Ser
                290                  295                  300
Val Leu Asn Gly Thr  Val Pro Gln Trp Arg  Val Asp Asp Met Ala
                305                  310                  315
Val Arg Ile Met Ala  Ala Tyr Tyr Lys Val  Gly Arg Asp Arg Leu
                320                  325                  330
Trp Thr Pro Pro Asn  Phe Ser Ser Trp Thr  Arg Asp Glu Tyr Gly
                335                  340                  345
Tyr Lys Tyr Tyr Tyr  Val Ser Glu Gly Pro  Tyr Glu Lys Val Asn
                350                  355                  360
Gln Tyr Val Asn Val  Gln Arg Asn His Ser  Glu LeuIle Arg Arg
                365                  370                  375
Ile Gly Ala Asp Ser  Thr Val Leu Leu Lys  Asn Asp Gly Ala Leu
                380                  385                  390
Pro Leu Thr Gly Lys  Glu Arg Leu Val Ala  Leu Ile Gly Glu Asp
                395                  400                  405
Ala Gly Ser Asn Pro  Tyr Gly Ala Asn Gly  Cys Ser Asp Arg Gly
                410                  415                  420
Cys Asp Asn Gly Thr  Leu Ala Met Gly Trp  Gly Ser Gly Thr Ala
                425                  430                  435
Asn Phe Pro Tyr Leu  Val Thr Pro Glu Gln  Ala Ile Ser Asn Glu
                440                  445                  450
Val Leu Lys His Lys  Asn Gly Val Phe Thr  Ala Thr Asp Asn Trp
                455                  460                  465
Ala Ile Asp Gln Ile  Glu Ala Leu Ala Lys  Thr Ala Ser Val Ser
                470                  475                  480
Leu Val Phe Val Asn  Ala Asp Ser Gly Glu  Gly Tyr Ile Asn Val
                485                  490                  495
Asp Gly Asn Leu Gly  Asp Arg Arg Asn Leu  Thr Leu Trp Arg Asn
                500                  505                  510
Gly Asp Asn Val Ile  Lys Ala Ala Ala Ser  Asn Cys Asn Asn Thr
                515                  520                  525
Ile Val Val Ile His  Ser Val Gly Pro Val  Leu Val Asn Glu Trp
                530                  535                  540
Tyr Asp Asn Pro Asn  Val Thr Ala Ile Leu  Trp Gly Gly Leu Pro
                545                  550                  555
Gly Gln Glu Ser Gly  Asn Ser Leu Ala Asp  Val Leu Tyr Gly Arg
                560                  565                  570
Val Asn Pro Gly Ala  Lys Ser Pro Phe Thr  Trp Gly Lys Thr Arg
                575                  580                  585
Glu Ala Tyr Gln Asp  Tyr Leu Val Thr Glu  Pro Asn Asn Gly Asn
                590                  595                  600
Gly Ala Pro Gln Glu  Asp Phe Val Glu Gly  Val Phe Ile Asp Tyr
                605                  610                  615
Arg Gly Phe Asp Lys  Arg Asn Glu Thr Pro  Ile Tyr Glu Phe Gly
                620                  625                  630
Tyr Gly Leu Ser Tyr  Thr Thr Phe Asn Tyr  Ser Asn Leu Glu Val
                635                  640                  645
Gln Val Leu Ser Ala  Pro Ala Tyr Glu Pro  Ala Ser Gly Glu Thr
                650                  655                  660
Glu Ala Ala Pro Thr  Phe Gly Glu Val Gly  Asn Ala Ser Asp Tyr
                665                  670                  675
Leu Tyr Pro Ser Gly  Leu Leu Arg Ile Thr  Lys Phe Ile Tyr Pro
                680                  685                  690
Trp Leu Asn Gly Thr  Asp Leu Glu Ala Ser  Ser Gly Asp Ala Ser
                695                  700                  705
Tyr Gly Gln Asp Ser  Ser Asp Tyr Leu Pro  Glu Gly Ala Thr Asp
                710                  715                  720
Gly Ser Ala Gln Pro  Ile Leu Pro Ala Gly  Gly Gly Pro Gly Gly
                725                  730                  735
Asn Pro Arg Leu Tyr  Asp Glu Leu Ile Arg  Val Ser Val Thr Ile
                740                  745                  750
Lys Asn Thr Gly Lys  Val Ala Gly Asp Glu  Val Pro Gln Leu Tyr
                755                  760                  765
Val Ser Leu Gly Gly  Pro Asn Glu Pro Lys  Ile Val Leu Arg Gln
                770                  775                  780
Phe Glu Arg Ile Thr  Leu Gln Pro Ser Glu  Glu Thr Lys Trp Ser
                785                  790                  795
Thr Thr Leu Thr Arg  Arg Asp Leu Ala Asn  Trp Asn Val Glu Lys
                800                  805                  810
Gln Asp Trp Glu Ile  Thr Ser Tyr Pro Lys  Met Val Phe Val Gly
                815                  820                  825
Ser Ser Ser Arg Lys  Leu Pro Leu Arg Ala  Ser Leu Pro Ile Val
                830                  835                  840
His
841
<210>SEQ ID NO：3
<400>3
P1：5’-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3’
P2：5’-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’

Claims (4)

1、一种β-葡萄糖苷酶，缩写为BGL酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所不。
2、一种编码权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的基因，缩写为bgl基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3、一种如权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达方法，其特征是由黑曲霉WX-07总RNA逆转录合成bgl的cDNA SEQ ID NO：1，bgl基因以质粒pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，实现bgl基因的可溶性表达；
(1)黑曲霉WX-07总RNA的提取：
黑曲霉WX-07菌株在PD液体培养基中培养2天，菌丝体过滤，用PBS缓冲液清洗菌体一次，加入1mL TRI REAGENT，用移液枪反复吹吸以裂解细胞；12,000×g、4℃离心10min以移除不溶物；将上清转移到一个干净的离心管，将样品在室温下放置5min，加入0.2mL氯仿，剧烈摇晃15s，在室温下放置10min，12,000×g、4℃离心15min；取上层无色水相于一干净的离心管，加入500μL异丙醇，混匀，在室温下放置10min，12,000×g、4℃离心10min，弃上清；加入1mL由DEPC-H2O配制的质量浓度75％乙醇，漩涡混匀，然后12,000×g、4℃离心5min，弃上清；让RNA自然干燥10min，加40μL DEPC-H2O溶解RNA沉淀，为模板RNA，-20℃保存；
(2)β-葡萄糖苷酶编码基因的克隆：
以黑曲霉WX-07总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链，
①在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer混合液：
  50μM的Oligo dT Primer或Random 6mers    1μL，
  10mM的dNTP Mixture                      1μL，
  总RNA                                   1μg，
  和Rnase free H2O                        添加至总体系10μL；
②65℃保温5min后冰上急冷；
③在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液：
  步骤①配制的RNA/Primer混合液            10μL，
  5×PrimeScript Buffer                   4μL，
  40U/μL的RNase Inhibitor                0.5μL，
  200U/μL的PrimeScript RTase             1μL，
  Rnase free H2O                          4.5μL；
④在50℃下保温1小时；
若步骤①中使用Random Primer时，需先在30℃保温10min，然后再在50℃下保温1小时；
⑤70℃保温15min后冰上冷却，得到的反应液立刻用于cDNA第二链的合成；以cDNA第一条链为模板，以P1，P2为上下游引物扩增出bgl基因：
引物P1：5’-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCC-3’
引物P2：5’-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3’
PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1.5μL，模板DNA2μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；
PCR反应条件为：在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸3min，共30个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定；
(3)bgl/pPIC 9K质粒的构建：
用于构建重组质粒的表达载体是pPIC 9K，带有α-Factor信号肽，将pPIC9K质粒和扩增的bgl基因进行NotI和EcoRI酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的bgl/pPIC 9K质粒；
(4)毕赤酵母KM71转化和筛选重组菌：
将质粒bgl/pPIC 9K 17μL，10×H buffer 2μL，Bgl II 1μL，37℃酶切1.5h后回收含有目的基因的条带，溶于20μL无菌水中，得到线性化的DNA；
在80μL毕赤酵母KM71感受态细胞中加入2μL线性化的DNA，混匀，转入1mm预冷的电转杯中，电击，转化物中加入1mL 1mol/L的山梨醇，30℃温育1h，取200μL的山梨醇重悬液涂布MD平板，30℃培养72小时；挑取回复突变菌株接种于YPD/G418平板上，30℃培养48h至长出单菌落，为获得多拷贝的bgl基因的重组菌，G418浓度筛选梯度依次为0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL；
pPIC 9K空质粒同上处理，所得转化菌作为阴性对照；
(5)重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC 9K的PCR鉴定：
选取含1mg/mL G418的YPD/G418上单菌落，以引物P1、P2作引物，用前述的PCR方法，检验是否能够扩增得到bgl全基因；重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K的PCR鉴定作为对照；鉴定后获得正确的重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC 9K用于后续实验；
(6)重组毕赤酵母KM 71/bgl/pPIC 9K的培养：
将鉴定正确的单菌落KM 71/bgl/pPIC 9K接种至5mL YPD培养基，200r/min、30℃培养16h；以10％的接种量接入装50mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，30℃培养24h，离心收集全部菌体；转入50mL BMMY培养基的250mL三角瓶中，30℃、培养120h，在该培养阶段中每24h补加0.5％的甲醇，并取样200μL，用于SDS-PAGE检测；阴性对照重组毕赤酵母KM 71/pPIC9K培养方法同上；
(7)重组β-葡萄糖苷酶的转苷检测：
步骤(6)所取表达产物样品进行SDS-PAGE检测，表达产物在12kDa应有条带；收集步骤(6)的重组毕赤酵母发酵培养的上清液经PEG浓缩，硫酸铵沉淀，透析，制成BGL粗酶液；
检验转苷活性如下：用pH4.5的醋酸缓冲液配制50％的葡萄糖溶液10mL，加入400μLBGL粗酶液，50℃反应24h，然后煮沸10min，微孔过滤，HPLC以及LC-MS检测产物，有低聚龙胆糖生成。
4、一种权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的应用，其特征是用于龙胆低聚糖的制备：
(a)β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖转化条件优化：
底物葡萄糖质量浓度为80％，pH4.5，β-葡萄糖苷酶的加酶量为每克葡萄糖60U，添加1mmol/L的K+，转化温度为60℃，转化时间为48h；
(b)龙胆低聚糖的分离精制：
将步骤(a)的酶反应液煮沸灭酶，微孔过滤，然后在30℃下用带有保温夹套的树脂柱以强酸性阳离子树脂DTF-02进行分离提纯。
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