CN111500560A

CN111500560A - 一种噬热β-葡萄糖苷酶的制备及应用

Info

Publication number: CN111500560A
Application number: CN202010342426.0A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 夏伟; 徐星豪; 黄燕
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-04-27
Filing date: 2020-04-27
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-04-27
Also published as: WO2021217902A1; CN111500560B; US20220056496A1

Abstract

本发明公开了一种噬热β‑葡萄糖苷酶的制备及应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明通过构建重组菌，异源表达了来源于嗜热真菌Talaromyces piceae的β‑葡萄糖苷酶TpBgl3A，所述重组菌在3.6L发酵罐中产酶可达2324U/mL。生产得到的β‑葡萄糖苷酶TpBgl3A能在较低加酶量下利用葡萄糖为底物高转化率制备低聚龙胆糖，显著降低生产成本；在以葡萄糖和纤维二糖为底物的反应体系中，低聚龙胆糖转化率达到26.2％，具有工业化生产低聚龙胆糖的潜力。

Description

一种噬热β-葡萄糖苷酶的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种噬热β-葡萄糖苷酶的制备及应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。

背景技术

低聚龙胆糖是葡萄糖以β-1,6糖苷键结合而形成的新型功能性低聚糖，包括龙胆二糖，少量的三糖和四糖。低聚龙胆糖不被人体的酶所降解，低热量，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用；其还具有高保湿性和吸湿性，有利于保持食品中的水分，可防止淀粉类食品的老化；同时低聚龙胆糖pH和热稳定性高，适用于高温和特殊pH条件下使用的食品；其水活性低，可以有效的防止食品被微生物污染；还具有柔和的提神苦味，可以添加在食品中增加口味的丰富性。目前，低聚龙胆糖被广泛的运用于巧克力、冰淇凌、咖啡、调味品、烘烤食品和饮料中。

龙胆低聚糖最早从龙胆属植物根茎中提取、酸法水解淀粉得来，这两种方法产率极低且产物成分复杂不易分离提取，化学合成得率高但又易造成污染，所以酶法生产在目前已成趋势，目前研究主要集中在利用β-葡萄糖苷酶以葡萄糖为底物通过转糖基作用聚合形成产物，β-葡萄糖苷酶分布于糖苷水解酶(Glycoside hydrolysase,GH)1、3、5、9、30和116等6个家族中，广泛存在于植物、动物和微生物中，其中微生物来源更为广泛，目前报道的这些菌株产β-葡萄糖苷酶用于生产低聚龙胆糖主要存在三个问题，一是低聚龙胆糖产率低，二是加酶量偏高，三是高密度发酵中的产酶量不足。

因此，本发明的目的不仅在于提高低聚龙胆糖的转化率和降低生产所需的加酶量，还要构建一种能够在高密度发酵中高效表达重组酶的基因工程菌。

发明内容

β-葡萄糖苷酶可水解释放β-D-糖苷类化合物非还原端葡萄糖基，是纤维素降解酶系的重要成员，可防止纤维素降解过程中纤维二糖的积累，从而有效解除纤维二糖对上游内切纤维素酶和外切纤维素酶的强烈产物抑制。

本发明提供一种β-葡萄糖苷酶TpBgl3A成熟蛋白的编码基因的序列，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述β-葡萄糖苷酶TpBgl3A成熟蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了一种载体，所述载体携带编码β-葡萄糖苷酶TpBgl3A的基因，或表达β-葡萄糖苷酶TpBgl3A。

在本发明的一种实施方式中，所述载体的出发载体为pPIC9K。

本发明提供了一种重组菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A，所述重组菌是以毕赤酵母KM71为宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-葡萄糖苷酶TpBgl3A。

本发明提供了一种提高β-葡萄糖苷酶产量的方法，所述方法是将所述重组菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A进行高密度发酵得到。

在本发明的一种实施方式中，将重组菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A，以8％～12％接种量接种于发酵罐中，控制温度28～30℃、初始转速180～220rpm、初始通气量5～8L/min、溶氧28～32％、pH 4.5～5.5；待溶氧上升至80～100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养；当重组菌菌体细胞浓度在OD₆₀₀为100～200时，用甲醇流加仪流加甲醇诱导产酶，控制温度15～25℃。

在本发明的一种实施方式中，所述甘油的浓度为80％(v/v)，甘油流加速率为15～25mL/h。

在本发明的一种实施方式中，初始诱导菌体的OD₆₀₀为100～200，甲醇浓度为0.5％～2.0％(v/v)，诱导温度为20℃～35℃。

在本发明的一种实施方式中，所述高密度发酵条件为：当重组菌菌体细胞浓度在OD₆₀₀为130～170时，添加浓度为0.8％～1.5％的甲醇诱导产酶，控制温度22℃～28℃。

本发明提供了一种提高低聚龙胆糖产量的方法，所述方法是以700～900g/L葡萄糖为底物，以所述β-葡萄糖苷酶为催化剂进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为200～600U/g葡萄糖，在pH4.5～5.5、温度50～70℃下进行酶反应，反应时间为65～75h。

在本发明的一种实施方式中，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为250～400U/g葡萄糖，在pH4.8～5.2、温度55～65℃下进行酶反应，反应时间为70～75h。

本发明保护所述编码β-葡萄糖苷酶TpBgl3A的基因在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明保护所述重组菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明保护所述载体在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明保护所述提高β-葡萄糖苷酶产量的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明还保护所述提高低聚龙胆糖产量的方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。

本发明的有益效果：本发明将来源于Talaromyces piceae的β-葡萄糖苷酶异源表达到毕赤酵母中，以pPIC9K为表达载体，以毕赤酵母KM71为表达宿主，得到一株高产β-葡萄糖苷酶的基因工程菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A，将基因工程菌KM71/pPIC9K-TpBgl3A在3.6L发酵罐中产酶可达2324U/mL。生产得到的β-葡萄糖苷酶TpBgl3A较现有生产中的同类酶，加酶量低且底物转化率和低聚龙胆糖产量高，在加酶量为300U/g条件下，低聚龙胆糖产量最高能达到125.0g/L，转化率为15.62％，具有良好的工业价值。

附图说明

图1是初始诱导菌体浓度与重组工程菌KM71-pPIC9K-TpBgl3A发酵酶活关系图。

图2是甲醇诱导浓度与重组工程菌KM71-pPIC9K-TpBgl3A发酵酶活关系图。

图3是诱导培养温度与重组工程菌KM71-pPIC9K-TpBgl3A发酵酶活关系图。

图4是重组菌3.6L发酵罐发酵上清SDS-PAGE电泳图；图中的24、48、72、84、96、108、120、132、144分别表示发酵时间为24h、48h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h。

图5是β-葡萄糖苷酶最适温度。

图6是β-葡萄糖苷酶最适pH值。

图7是β-葡萄糖苷酶加酶量与以葡萄糖为底物制备低聚龙胆糖转化率关系图。

图8是底物浓度与以葡萄糖和纤维二糖为底物制备低聚龙胆糖转化率关系图。

具体实施方式

实施例中所需培养基：

MD固体培养基：YNB 13.4g/L，生物素4.0×10^-4g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，固体培养基添加20g/L琼脂

BMGY培养基：YNB 13.4g/L，甘油10g/L，生物素4×10^-4g/L，0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L

发酵种子培养基：酵母粉5.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，葡萄糖10.0g/L，甘油30g/L。

BSM培养基：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄ 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·7H₂O14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油30.0g/L，微量元素盐溶液4.32mL/L。

生长阶段补料培养基：80％甘油，4.92mL/L微量元素液。

诱导阶段补料培养基：100％甲醇，12.5mL/L微量元素液；高密度发酵用100％氨水和50％磷酸来调节pH。

β-葡萄糖苷酶酶活力分析：

(1)酶活单位定义

每毫升酶液每分钟水解pNPG产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力为一个酶活单位。

(2)酶活力测定步骤

反应体系为1mL，pH 5.0的醋酸缓冲液960μL，加入适度稀释的粗酶液20μL，再加入20μL 100mmol/L的pNPG，在60℃恒温水浴中反应10min，10min后立即加入200μL的1mol/L的Na₂CO₃溶液终止反应，冰浴5min，于405nm处测光吸收值。以加热失活的酶液按照同样的方法处理作空白。

回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。

实施例1：毕赤酵母KM71/pPIC9K-TpBgl3A基因工程菌的构建

根据数据库中来源于Talaromyces piceae的β-葡萄糖苷酶氨基酸序列(NCBI登录号ATQ35964)，化学合成β-葡萄糖苷酶TpBgl3A成熟蛋白(去除信号肽序列)的编码序列(将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。

然后将TpBgl3A的编码序列插入酵母表达载体pPIC9K的α-factor信号肽(含起始密码子atg)下游进行融合表达，具体方法为：分别将TpBgl3A的编码序列和载体pPIC9K用EcoRI和Not I酶切回收后，用T4连接酶酶连，得到连接产物，将连接产物转入E.coli.JM109中，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有0.05mg/mL卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子。

热激转化法：

(1)将E.coli.JM109感受态细胞提前放在冰上5min中，待感受态完全融化后，向其中加入10μL完整质粒或者PCR产物，轻柔吹吸均匀后，置于冰上放置45min；

(2)将感受态放置到42℃水浴锅中热激90s，热激结束后，放置在冰上5min；

(3)冰浴结束后，向感受态中加入0.8mL LB液体培养基，混匀后放到37℃摇床中震荡培养60min左右；

(4)培养结束的感受态3000rpm离心5min，弃部分上清液，留200μL左右的发酵液将菌体重新吹吸重悬，涂布到含氨苄抗生素的LB固体平板上，37℃培养箱静置培养10h左右，等待平板长出单菌落。

挑取单克隆菌落接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pPIC9K-TpBgl3A。

将重组质粒pPIC9K-TpBgl3A电转整合到毕赤酵母KM71。

毕赤酵母KM71感受态制备与转化步骤如下：

(1)从毕赤酵母KM71甘油管中吸取30μL菌液接种于10mL液体YPD培养基，在30℃摇床中200rpm培养24h，然后从中吸取100μL接种于100mL液体YPD培养基30℃恒温振荡培养16h；

(2)在无菌环境中，将菌液分装至三管事先预冷的50mL离心管中，4℃条件下5000rpm离心5min后弃上清收集菌体；

(3)在无菌环境中，用4mL ddH₂O重悬菌体，之后将其合并为一管，并相继加入2mL的TE缓冲液、2mL的LiAc缓冲液和0.5mL的DTT缓冲液，轻轻吹吸混匀，将离心管置于30℃水浴摇床中50rpm培养45～50min，以上试剂都要预冷处理；

(4)在无菌环境中，向离心管加入事先预冷的13.5mL ddH₂O，4℃条件下5000rpm离心5min后弃上清收集菌体；

(5)在无菌环境中，用25mL ddH₂O重悬菌体，4℃条件下5000rpm离心5min后弃上清收集菌体，之后换用25mL，1M山梨醇重复完成重悬、收集菌体操作两次；

(6)向离心管中加入1mL预冷的山梨醇并轻轻重悬菌体，按照每管80μL分装至1.5mL的EP管中并暂时存放在-80℃低温冰箱中。

(7)取10μL线性化质粒加至毕赤酵母KM71感受态中并轻敲管壁混匀，之后将感受态沿壁加入事先预冷的电极杯中，轻敲电击杯底部以排除气泡；

(8)将电击杯放入电压为1500V的电转仪进行电击；

(9)立即取出电击杯并迅速加入事先预冷的1mL，1M山梨醇轻轻吹吸混匀，随后将菌液转进EP管中，于30℃摇床孵育1～2h；

(10)从EP管中吸取100μL菌液均匀涂布于MD固体培养基，30℃培养48h。

转化子筛选：待上述MD平板长出单克隆，然后用灭菌的牙签挑取96个转化子按照编号同时转移至带有编号的装有4mL BMGY培养基的10mL规格培养管和新的MD平板上。MD平板倒置于30℃恒温培养箱培养；培养管30℃220rpm振荡培养2d后4,500rpm离心5min，弃上清，用2mL BMGY培养基重悬菌体，30℃220rpm诱导培养2d后离心取上清为粗酶液。

对上清液进行β-葡萄糖苷酶的活性检测，筛选出酶活最高的重组转化子。从相应的MD平板上挑取对应编号的转化子菌斑，接种于YPD培养基中30℃220rpm活化培养2d，保存为重组菌株毕赤酵母/KM71-pPIC9K-TpBgl3A。

实施例2：重组毕赤酵母工程菌毕赤酵母/KM71-pPIC9K-TpBgl3A发酵产酶

1、工程菌在3.6L发酵罐发酵

(1)分批发酵阶段：将种子液(重组菌株于YPD液体培养基中30℃培养36h获得)以8％-12％接种量接种于发酵罐中，控制温度28-30℃、初始转速180-220rpm、初始通气量7L/min、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5；

(2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100％，以恒速流加甘油的方式进行补料培养，控制温度28-30℃、溶氧28-32％、pH4.5-5.5；甘油的浓度为80％(v/v)，甘油流加速率为17.5-18.5mL/h；

(3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度在OD₆₀₀＝100-200范围内，用甲醇流加仪流加甲醇诱导产酶，甲醇浓度控制在0.5-1.5％，控制温度20-30℃、溶氧28-32％、pH 4.5-5.5，诱导96-144h，结束发酵。将发酵液离心取上清液，得到粗酶液。

2、发酵条件优化

为了提高β-葡萄糖苷酶的发酵水平，将上述步骤(3)中的初始诱导菌体OD₆₀₀＝100、150、200，甲醇浓度为0.5％、1.0％、1.5％，诱导温度为20、25、30℃，探究不同发酵条件对重组酶表达的影响。

具体优化过程如下：

(1)初始诱导菌体浓度：以17.5-18.5mL/h的速率流加甘油促使菌体浓度达到初始诱导菌体浓度为不同设定值(分别为OD₆₀₀＝100、150、200)后，开始添加甲醇诱导培养，甲醇诱导浓度为1.0％，将诱导培养温度设为25℃，诱导144h完成发酵过程。结果显示，最优初始诱导菌体浓度为OD₆₀₀＝150，工程菌产β-葡萄糖苷酶最高酶活力达2054U/mL(图1)。

表1工程菌在不同初始诱导菌体浓度时产酶量(U/mL)

(2)甲醇诱导浓度：在初始菌体浓度为OD₆₀₀＝150，诱导培养温度为25℃的条件下，分别采用0.5％、1.0％、1.5％3个不同浓度梯度的甲醇进行诱导，诱导144h完成发酵过程。结果显示，最优甲醇诱导浓度为1.0％，重组菌产β-葡萄糖苷酶最高酶活力达2010U/mL(图2)。

表2工程菌在不同浓度的甲醇诱导下的产酶量(U/mL)

(3)诱导培养温度：在初始菌体浓度为OD₆₀₀＝150，甲醇诱导浓度1.0％，分别在20、25、30℃3个培养温度下诱导144h完成发酵过程。结果显示，最优诱导培养温度为25℃，重组菌产β-葡萄糖苷酶最高酶活力达2324U/mL(图3)。

表3工程菌在不同诱导培养温度下的产酶量(U/mL)

经发酵条件优化，在初始诱导菌体浓度为OD₆₀₀＝150，甲醇诱导浓度1.0％，诱导温度为25℃的最佳发酵条件下，测得β-葡萄糖苷酶最高酶活为2324U/mL，重组β-葡萄糖苷酶发酵液SDS-PAGE电泳图见图4。

3、β-葡萄糖苷酶的酶学性质

(1)β-葡萄糖苷酶的最适温度

将上述发酵得到的β-葡萄糖苷酶酶液进行酶学定性，以pNPG为底物，在不同的温度下测酶活，结果表明：β-葡萄糖苷酶在50℃、65℃时的相对酶活分别为57.04％、50.08％，最适温度为60℃(图5)。

(2)β-葡萄糖苷酶的最适pH

在最适温度60℃条件下设置不同pH梯度测β-葡萄糖苷酶的酶活，结果表明：β-葡萄糖苷酶在pH为4.5、5.5、6.0时的相对酶活分别为75.49％、84.51％、70.22％，最适pH为5.0(图6)。

实施例3：β-葡萄糖苷酶在以葡萄糖为底物制备低聚龙胆糖中的应用

以葡萄糖为底物制备低聚龙胆糖的反应体系：以800g/L葡萄糖为底物，在pH 5.0、60℃下反应72h，设置不同β-葡萄糖苷酶加酶量(200-600U/g葡萄糖)对酶反应的影响，实验结果如图7所示，低聚龙胆糖累积含量在一定范围内随加酶量升高而增加，但当加酶量超过300U/g葡萄糖时，增加加酶量反而降低低聚龙胆糖的产量。所以选择加酶量300U/g葡萄糖时最合适，此时低聚龙胆糖的产量能达到125.0g/L，转化率为15.62％。

转化率计算公式：

表4不同加酶量下的以葡萄糖为底物制备低聚龙胆糖的产量及转化率

对比例1

具体实施方式同实施例4，区别在于，将β-葡萄糖苷酶替换为来源于绿色木霉Trichoderma viride的β-葡萄糖苷酶，设置酶的添加量为300U/g葡萄糖，测定低聚龙胆糖的产量和转化率分别为60g/L、7.5％。

在此基础上，在绿色木霉Trichoderma viride的β-葡萄糖苷酶的酶转化最优条件：pH 5.0，60℃，加酶量为900U/g葡萄糖，底物葡萄糖浓度为800g/L时，低聚龙胆糖产量能达到最大值130g/L，转化率为16.25％，高密度发酵水平为1402U/mL。

实施例4：β-葡萄糖苷酶在以葡萄糖和纤维二糖为底物制备低聚龙胆糖中的应用

以葡萄糖和纤维二糖为底物制备低聚龙胆糖的反应体系：维持葡萄糖与纤维二糖摩尔浓度比为1:2(质量浓度比为1:4)，50-150g/L葡萄糖和200-600g/L纤维二糖为底物，在加酶量400U/g纤维二糖，pH 5.0、60℃条件下反应48h。结果显示，最优底物浓度为75g/L葡萄糖和300g/L纤维二糖，低聚龙胆糖转化率最高为26.2％(图8)。

表5不同底物浓度下以葡萄糖和纤维二糖为底物制备低聚龙胆糖的产量及转化率

对比例2

具体实施方式同实施例4，区别在于，将β-葡萄糖苷酶替换为来源于绿色木霉Trichoderma viride的β-葡萄糖苷酶，在其酶转化最优条件：pH 5.0，60℃，底物浓度为20％葡萄糖、40％纤维二糖时，β-葡萄糖苷酶加酶量为400U/g纤维二糖，低聚龙胆糖的转化率为19.4％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种噬热真菌β-葡萄糖苷酶的制备及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaacttctg attgggatga agcttactct aaggctttgg attctttggc taagttgtct 60

caaaacgaaa agattggtat tgttactggt acttcttggc aaaacggttc ttgtgttggt 120

aacacttacc aaccatcttc tattgattac ccatctttgt gtttgcaaga tggtccattg 180

ggtattagat acgctaaccc agttactgct tttccagctg gtattaacgc tggtgctact 240

tgggatagat ctttgattaa ggatagaggt gctgctttgg gtgaagaagc taagtctttg 300

ggtgttcatg tttctttggg tccagttgct ggtccattgg gtaaggttcc acaaggtggt 360

agattgtggg aaggtttttc tgttgatcca tacttgtctg gtgttgctat gactgaaact 420

attaacggtg ttcaaggtgc tggtgctcaa gcttgtgcta agcattacat tggtaacgaa 480

caagaaacta acagaaacta cattgattct actattgatg atagagcttt tcatgaattg 540

tacttgtggc catttgctga tgctgttaga gctaacgttg cttctgttat gtgttcttac 600

aacaaggtta acggtactta cacttgtgaa aacccagctg ttttgaacca tactttgaag 660

actgaattgg gttttaaggg ttacattatg tctgattggg gtgctcaaca tactacttct 720

ggttctgcta acgctggttt ggatatgact atgccaggtt ctgatttgtc taacccacca 780

ggtaacgttt tgtggggtca aaagttggct gatgctattt ctaacggtga agttgaacaa 840

tctagattgg atgatatggt tactagaatt ttggctgctt ggtacttggt tggtcaagat 900

caaggttacc catctgttca atttaactct tggaacggtg gtcaaacttc tgctaacgtt 960

actggtgatc atgctactgt tgttagaaac gttgctagag attctattgt tttgttgaag 1020

aacgataaca acactttgcc attgtctaag ccaaactctt tggctattat tggttctgat 1080

gctgctgtta acccagatgg tccaaacgct tgttctgata gaggttgtga tactggtact 1140

ttggctatgg gttggggttc tggtacttgt gaatttccat acttggttgg tccattggaa 1200

gctattaaga accaagctaa cgctgatggt actactatta cttcttctac tactgattct 1260

acttctgatg gtgcttctgc tgctcaaaac gctgatgttg ctattgtttt tattaactct 1320

gattctggtg aaggttacat taacgttgaa ggttcttctg gtgatagatt gaacttggat 1380

ccatggcatt ctggtaacga attggttcaa gctgttgctc aagttaacca aaagactatt 1440

gttgttattc attctgttgg tccattggtt ttggaatcta ttttggctga accaaacgtt 1500

gttgctattg tttgggctgg tttgccaggt caagaatctg gtaacgcttt ggttgatatt 1560

ttgtacggtt ctactgctcc atctggtaag ttgccataca ctattgctaa gcaagaatct 1620

gattacggta cttctgttgt taacggtgat gataactttt ctgaaggtat ttttgttgat 1680

tacagacatt ttgatcatgc tgatattgaa ccaagatacg aatttggtta cggtttgtct 1740

tacactactt ttaactactc tggtttggct gttgatgtta ctgtttctgc tggtgctact 1800

tctggtgaaa ctgtttctgg tggtccatct gatttgttta ctgaagttgg tactgtttct 1860

gcttctgttc aaaacactgg tcaagttact ggtgctgaag ttgctcaatt gtacattggt 1920

ttgccatctt ctgctccatc tgctccacca aagcaattga gaggttttca aaagattttg 1980

ttggaagctg atgaatctga tactgcttct ttttctttga ctagaagaga tttgtcttac 2040

tgggatactc aagaacaaaa gtgggttgtt ccatctggtg aattttctgt ttacgttggt 2100

tcttcttcta gagatattag attgactgat acttttactg tttaa 2145

<210> 2

<211> 714

<212> PRT

<213> Talaromyces piceae

<400> 2

Gln Thr Ser Asp Trp Asp Glu Ala Tyr Ser Lys Ala Leu Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ala Lys Leu Ser Gln Asn Glu Lys Ile Gly Ile Val Thr Gly Thr Ser

20 25 30

Trp Gln Asn Gly Ser Cys Val Gly Asn Thr Tyr Gln Pro Ser Ser Ile

35 40 45

Asp Tyr Pro Ser Leu Cys Leu Gln Asp Gly Pro Leu Gly Ile Arg Tyr

50 55 60

Ala Asn Pro Val Thr Ala Phe Pro Ala Gly Ile Asn Ala Gly Ala Thr

65 70 75 80

Trp Asp Arg Ser Leu Ile Lys Asp Arg Gly Ala Ala Leu Gly Glu Glu

85 90 95

Ala Lys Ser Leu Gly Val His Val Ser Leu Gly Pro Val Ala Gly Pro

100 105 110

Leu Gly Lys Val Pro Gln Gly Gly Arg Leu Trp Glu Gly Phe Ser Val

115 120 125

Asp Pro Tyr Leu Ser Gly Val Ala Met Thr Glu Thr Ile Asn Gly Val

130 135 140

Gln Gly Ala Gly Ala Gln Ala Cys Ala Lys His Tyr Ile Gly Asn Glu

145 150 155 160

Gln Glu Thr Asn Arg Asn Tyr Ile Asp Ser Thr Ile Asp Asp Arg Ala

165 170 175

Phe His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Asn

180 185 190

Val Ala Ser Val Met Cys Ser Tyr Asn Lys Val Asn Gly Thr Tyr Thr

195 200 205

Cys Glu Asn Pro Ala Val Leu Asn His Thr Leu Lys Thr Glu Leu Gly

210 215 220

Phe Lys Gly Tyr Ile Met Ser Asp Trp Gly Ala Gln His Thr Thr Ser

225 230 235 240

Gly Ser Ala Asn Ala Gly Leu Asp Met Thr Met Pro Gly Ser Asp Leu

245 250 255

Ser Asn Pro Pro Gly Asn Val Leu Trp Gly Gln Lys Leu Ala Asp Ala

260 265 270

Ile Ser Asn Gly Glu Val Glu Gln Ser Arg Leu Asp Asp Met Val Thr

275 280 285

Arg Ile Leu Ala Ala Trp Tyr Leu Val Gly Gln Asp Gln Gly Tyr Pro

290 295 300

Ser Val Gln Phe Asn Ser Trp Asn Gly Gly Gln Thr Ser Ala Asn Val

305 310 315 320

Thr Gly Asp His Ala Thr Val Val Arg Asn Val Ala Arg Asp Ser Ile

325 330 335

Val Leu Leu Lys Asn Asp Asn Asn Thr Leu Pro Leu Ser Lys Pro Asn

340 345 350

Ser Leu Ala Ile Ile Gly Ser Asp Ala Ala Val Asn Pro Asp Gly Pro

355 360 365

Asn Ala Cys Ser Asp Arg Gly Cys Asp Thr Gly Thr Leu Ala Met Gly

370 375 380

Trp Gly Ser Gly Thr Cys Glu Phe Pro Tyr Leu Val Gly Pro Leu Glu

385 390 395 400

Ala Ile Lys Asn Gln Ala Asn Ala Asp Gly Thr Thr Ile Thr Ser Ser

405 410 415

Thr Thr Asp Ser Thr Ser Asp Gly Ala Ser Ala Ala Gln Asn Ala Asp

420 425 430

Val Ala Ile Val Phe Ile Asn Ser Asp Ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn

435 440 445

Val Glu Gly Ser Ser Gly Asp Arg Leu Asn Leu Asp Pro Trp His Ser

450 455 460

Gly Asn Glu Leu Val Gln Ala Val Ala Gln Val Asn Gln Lys Thr Ile

465 470 475 480

Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Leu Val Leu Glu Ser Ile Leu Ala

485 490 495

Glu Pro Asn Val Val Ala Ile Val Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu

500 505 510

Ser Gly Asn Ala Leu Val Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Thr Ala Pro Ser

515 520 525

Gly Lys Leu Pro Tyr Thr Ile Ala Lys Gln Glu Ser Asp Tyr Gly Thr

530 535 540

Ser Val Val Asn Gly Asp Asp Asn Phe Ser Glu Gly Ile Phe Val Asp

545 550 555 560

Tyr Arg His Phe Asp His Ala Asp Ile Glu Pro Arg Tyr Glu Phe Gly

565 570 575

Tyr Gly Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Asn Tyr Ser Gly Leu Ala Val Asp

580 585 590

Val Thr Val Ser Ala Gly Ala Thr Ser Gly Glu Thr Val Ser Gly Gly

595 600 605

Pro Ser Asp Leu Phe Thr Glu Val Gly Thr Val Ser Ala Ser Val Gln

610 615 620

Asn Thr Gly Gln Val Thr Gly Ala Glu Val Ala Gln Leu Tyr Ile Gly

625 630 635 640

Leu Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ala Pro Pro Lys Gln Leu Arg Gly Phe

645 650 655

Gln Lys Ile Leu Leu Glu Ala Asp Glu Ser Asp Thr Ala Ser Phe Ser

660 665 670

Leu Thr Arg Arg Asp Leu Ser Tyr Trp Asp Thr Gln Glu Gln Lys Trp

675 680 685

Val Val Pro Ser Gly Glu Phe Ser Val Tyr Val Gly Ser Ser Ser Arg

690 695 700

Asp Ile Arg Leu Thr Asp Thr Phe Thr Val

705 710

Claims

1.一种编码β-葡萄糖苷酶的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.携带权利要求1所述基因的载体。

3.一种重组菌，其特征在于，携带权利要求1所述基因，或表达氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的β-葡萄糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以毕赤酵母KM71为宿主。

5.一种提高β-葡萄糖苷酶产量的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求3或4所述重组菌发酵产酶。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述重组菌接种于发酵体系中发酵，当重组菌菌体细胞浓度在OD₆₀₀为100～200时，用甲醇诱导重组菌产酶，并控制温度在15～25℃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲醇的浓度为0.5％～2.0％。

8.一种生产低聚龙胆糖的方法，其特征在于，以权利要求3或4所述重组菌表达的β-葡萄糖苷酶催化葡萄糖生成低聚龙胆糖。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的加酶量为200～600U/g葡萄糖，所述葡萄糖的浓度为500～1000g/L。

10.权利要求1所述基因，或权利要求2所述载体，或权利要求3或4所述重组菌，或权利要求5～7任一所述方法，或权利要求8或9所述方法在食品和化妆品领域制备低聚龙胆糖中的应用。