CN110699339B

CN110699339B - 一种热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体及其编码基因和应用

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Publication number: CN110699339B
Application number: CN201910868753.7A
Authority: CN
Inventors: 李中媛; 张同存; 刘仲琦; 李爽; 赵军旗
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2019-09-16
Filing date: 2019-09-16
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2039-09-16
Also published as: CN110699339A

Abstract

本发明涉及一种热稳定性和比活力提高的低温β‑木糖苷酶突变体，所述突变体为低温β‑木糖苷酶突变体G110S，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；或者，所述突变体为低温β‑木糖苷酶突变体Q201R，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2；或者，所述突变体为低温β‑木糖苷酶突变体loop2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3。本发明中稳定性提高和比活力上升的低温β‑木糖苷酶突变体更适合工业应用，在食品、饲料、造纸等领域具有更广泛的应用前景，从而扩大了低温β‑木糖苷酶在食品、医药、造纸、饲料等领域提供了应用潜力。

Description

一种热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其是一种热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

木聚糖分布广泛，是植物细胞壁中半纤维素的主要成分。木聚糖是一类异质多糖，主链是由β-1,4-糖苷键连接木糖单元而形成，其结构复杂，降解过程需要多种糖苷水解酶共同完成；其中，β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶对木聚糖的完全降解是必不可少的。

β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是外切糖苷酶，其具有将木聚糖低聚糖非还原端水解成木糖的能力，它主要催化烷基和芳基糖苷以及用外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。β-木糖苷酶是半纤维素酶复合物的组分酶之一，是半纤维素复合物的组成酶之一。β-木糖苷酶在半纤维素酶解时起到重要的作用，当半纤维素酶解时，β- 木糖苷酶可与木聚糖酶协同作用，将木聚糖彻底分解。β-木糖苷酶广泛应用于生物医药、食品、造纸以及饲料等各个领域：减少食品中活性成分、风味物质和营养成分的损失，降低胆固醇水平、增加钙的生物利用度，提高动物对饲料营养成分的吸收和利用等方面发挥着巨大的作用。

为了进一步推动β-木糖苷酶在工业领域的应用，需对其现有性质需要进一步的提升，诸如在更加极端的环境下保持良好的活性、拥有更高的酶活力等。其中，由于低温木糖苷酶的热稳定性较差以及比活力较低，其野生型菌株在40℃处理1h剩余活力仅有1.79％，比活为 4.85U/mg，由于工业中应用反应温度多在50℃左右，这不利于该野生型低温β-木糖苷酶的应用。因此提升低温β-木糖苷酶的热稳定性和比活力具有广泛的应用价值。

通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、一种比酶活和热稳定性提高的碱性果胶酶突变体(CN105316310B)，相对于现有的突变体PGL-S1而言，本发明的突变体PGL-(GS)3-S1的比酶活提高了6倍，在60℃的半衰期提高了1.3倍。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。

2、一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体(CN108753746A)，本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的一个氨基酸位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比更高的热稳定性。本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体在50℃的半衰期比野生型增加41h，是野生型的2倍，即本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的稳定性较野生型提高了2倍。

3、一种热稳定性提高的脂肪酶突变体及其制备方法和应用(CN109468301A)，所述脂肪酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.13所示。本发明通过多序列比对和二硫键预测结果，对米根霉脂肪酶ROL进行热稳定性改造，大幅度的提高了米根霉脂肪酶ROL的热稳定性，同时，借助计算机模拟技术，对热稳定性提高的原理进行了分子层面的解释。本发明提供的脂肪酶突变体的热稳定性显著提升，再结合其本身具备的高Sn 1,3选择性，使其更具工业化应用价值。

4、一种热稳定性提高的脂肪酶突变体(CN108841805A)，公开了由米曲霉(Aspergillus oryaze)脂肪酶作为亲本，经定点突变技术而获得的热稳定性提高的脂肪酶突变体。在这个突变体的氨基酸序列中，涉及到的氨基酸突变为：Gly57Glu/Leu156Cys。以该突变体在不同温度条件下保温10min后失去50％酶活力的温度(T)及50℃的半衰期(t)表示，该突变体的热稳定性得到了提高，具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

5、植酸酶突变体YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V及其编码基因和应用(CN106011102A)，涉及植酸酶突变体YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V及其编码基因和应用。通过将植酸酶的第396位亮氨酸突变为缬氨酸而获得。相比于野生型，本发明的两个植酸酶突变体YkAPPA-L396V和YeAPPA-L396V的胃蛋白酶抗性和明显提高，有利于饲料酶开发和应用。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种热稳定性和比活力提高的低温β- 木糖苷酶突变体及其编码基因和应用，该稳定性提高和比活力上升的低温β-木糖苷酶突变体更适合工业应用，在食品、饲料、造纸等领域具有更广泛的应用前景，从而扩大了低温β-木糖苷酶在食品、医药、造纸、饲料等领域提供了应用潜力。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体，所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体G110S，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；

SEQ ID NO.1

MPPLITSIYTADPSAHVFNDKIYIYPSHDRETDIAFNDNGDQYDMADYHVFSTSDFKEV TDHGVVLKTEDVPWASKQLWAPDAAHKNGKYYLYFPARDKEGIFRIGVAVSDKPEGPFT ADPEPIKGSYSIDPASFVDDDGQAYLYFGGLWGGQLQCYQKGDDTYDPEWQGPKEVSGE GVAAQGPRAAKLTDDMHQFESPAQELLILDPETKEPILGDDHARRFFEAAWMHKHNGKY YFSYSTGDTHFLCYAVGDSPMGPFTYGGKILEPVLGWTTHHSIVEYKGKTYLFFHDCELSK GVDHLRSVKAKEIFYDDQGRIITTKAD；

或者，所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体Q201R，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

SEQ ID NO.2

MPPLITSIYTADPSAHVFNDKIYIYPSHDRETDIAFNDNGDQYDMADYHVFSTSDFKEV TDHGVVLKTEDVPWASKQLWAPDAAHKNGKYYLYFPARDKEGIFRIGVAVGDKPEGPFT ADPEPIKGSYSIDPASFVDDDGQAYLYFGGLWGGQLQCYQKGDDTYDPEWQGPKEVSGE GVAAQGPRAAKLTDDMHQFESPARELLILDPETKEPILGDDHARRFFEAAWMHKHNGKY YFSYSTGDTHFLCYAVGDSPMGPFTYGGKILEPVLGWTTHHSIVEYKGKTYLFFHDCELSK GVDHLRSVKAKEIFYDDQGRIITTKAD；

或者，所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体loop2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3：

SEQ ID NO.3

MPPLITSIYTADPSAHVFNDKIYIYPSHDRETDIAFNDNGDQYDMADYHVFSLDSLDPP SEVTDHGVVLKTEDVPWASKQLWAPDAAHKNGKYYLYFPARDKEGIFRIGVAVGDKPEG PFTADPEPIKGSYSIDPASFVDDDGQAYLYFGGLWGGQLQCYQKGDDTYDPEWQGPKEVS GEGVAAQGPRAAKLTDDMHQFESPAQELLILDPETKEPILGDDHARRFFEAAWMHKHNG KYYFSYSTGDTHFLCYAVGDSPMGPFTYGGKILEPVLGWTTHHSIVEYKGKTYLFFHDCEL SKGVDHLRSVKAKEIFYDDQGRIITTKAD。

一种编码如上所述的热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体的基因。

而且，编码低温β-木糖苷酶突变体G110S的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

SEQ IQ NO.4

ATGCCGCCCCTCATTACCTCCATCTACACAGCTGATCCCTCAGCCCACGTCTTCAA TGACAAGATCTACATCTACCCGTCTCACGACCGCGAGACGGACATTGCCTTCAACGAC AATGGCGACCAGTATGACATGGCCGACTACCATGTCTTCTCCACGTCGGACTTCAAGG AGGTGACCGACCACGGCGTCGTGCTCAAGACAGAGGACGTGCCGTGGGCGAGCAAGC AGCTCTGGGCCCCCGACGCGGCGCACAAGAACGGAAAATACTACCTCTACTTCCCGGC ACGAGACAAGGAAGGCATCTTTCGGATTGGCGTGGCCGTGAGTGACAAGCCCGAGGG CCCCTTCACCGCCGACCCAGAGCCCATCAAGGGCAGCTACTCCATCGACCCGGCCAGT TTCGTCGACGATGACGGCCAGGCCTACCTCTACTTTGGCGGTCTCTGGGGTGGCCAGCT CCAATGCTACCAAAAGGGCGACGACACGTACGACCCGGAGTGGCAAGGACCCAAGGA AGTCTCTGGCGAGGGCGTCGCAGCGCAGGGCCCTCGCGCCGCCAAGTTGACAGACGAC ATGCACCAATTCGAGTCGCCAGCCCAAGAGCTCCTCATTCTGGACCCAGAGACCAAGG AACCCATTCTCGGCGACGACCACGCGCGCCGCTTCTTTGAAGCCGCGTGGATGCACAA GCACAATGGCAAGTACTACTTCTCCTACTCGACGGGCGACACCCACTTCCTCTGCTACG CCGTGGGCGACTCACCCATGGGTCCGTTCACGTATGGCGGCAAGATCCTGGAGCCCGT GCTGGGCTGGACGACGCACCACTCGATTGTCGAGTACAAGGGCAAGACATATCTCTTC TTCCACGACTGTGAGCTGAGCAAGGGTGTGGACCACCTCAGGAGCGTCAAGGCCAAGG AGATCTTTTACGACGATCAGGGTAGGATCATCACGACAAAGGCAGAT

编码低温β-木糖苷酶突变体Q201R的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；

SEQ IQ NO.5

ATGCCGCCCCTCATTACCTCCATCTACACAGCTGATCCCTCAGCCCACGTCTTCAA TGACAAGATCTACATCTACCCGTCTCACGACCGCGAGACGGACATTGCCTTCAACGAC AATGGCGACCAGTATGACATGGCCGACTACCATGTCTTCTCCACGTCGGACTTCAAGG AGGTGACCGACCACGGCGTCGTGCTCAAGACAGAGGACGTGCCGTGGGCGAGCAAGC AGCTCTGGGCCCCCGACGCGGCGCACAAGAACGGAAAATACTACCTCTACTTCCCGGC ACGAGACAAGGAAGGCATCTTTCGGATTGGCGTGGCCGTGGGTGACAAGCCCGAGGG CCCCTTCACCGCCGACCCAGAGCCCATCAAGGGCAGCTACTCCATCGACCCGGCCAGT TTCGTCGACGATGACGGCCAGGCCTACCTCTACTTTGGCGGTCTCTGGGGTGGCCAGCT CCAATGCTACCAAAAGGGCGACGACACGTACGACCCGGAGTGGCAAGGACCCAAGGA AGTCTCTGGCGAGGGCGTCGCAGCGCAGGGCCCTCGCGCCGCCAAGTTGACAGACGAC ATGCACCAATTCGAGTCGCCAGCCCGAGAGCTCCTCATTCTGGACCCAGAGACCAAGG AACCCATTCTCGGCGACGACCACGCGCGCCGCTTCTTTGAAGCCGCGTGGATGCACAA GCACAATGGCAAGTACTACTTCTCCTACTCGACGGGCGACACCCACTTCCTCTGCTACG CCGTGGGCGACTCACCCATGGGTCCGTTCACGTATGGCGGCAAGATCCTGGAGCCCGT GCTGGGCTGGACGACGCACCACTCGATTGTCGAGTACAAGGGCAAGACATATCTCTTC TTCCACGACTGTGAGCTGAGCAAGGGTGTGGACCACCTCAGGAGCGTCAAGGCCAAGG AGATCTTTTACGACGATCAGGGTAGGATCATCACGACAAAGGCAGAT

编码低温β-木糖苷酶突变体loop2的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6；

SEQ IQ NO.6

ATGCCGCCCCTCATTACCTCCATCTACACAGCTGATCCCTCAGCCCACGTCTTCAA TGACAAGATCTACATCTACCCGTCTCACGACCGCGAGACGGACATTGCCTTCAACGAC AATGGCGACCAGTATGACATGGCCGACTACCATGTCTTCTCCCTCGACTCCCTCGACCC CCCTTCCGAGGTGACCGACCACGGCGTCGTGCTCAAGACAGAGGACGTGCCGTGGGCG AGCAAGCAGCTCTGGGCCCCCGACGCGGCGCACAAGAACGGAAAATACTACCTCTACT TCCCGGCACGAGACAAGGAAGGCATCTTTCGGATTGGCGTGGCCGTGGGTGACAAGCC CGAGGGCCCCTTCACCGCCGACCCAGAGCCCATCAAGGGCAGCTACTCCATCGACCCG GCCAGTTTCGTCGACGATGACGGCCAGGCCTACCTCTACTTTGGCGGTCTCTGGGGTGG CCAGCTCCAATGCTACCAAAAGGGCGACGACACGTACGACCCGGAGTGGCAAGGACC CAAGGAAGTCTCTGGCGAGGGCGTCGCAGCGCAGGGCCCTCGCGCCGCCAAGTTGACA GACGACATGCACCAATTCGAGTCGCCAGCCCAAGAGCTCCTCATTCTGGACCCAGAGA CCAAGGAACCCATTCTCGGCGACGACCACGCGCGCCGCTTCTTTGAAGCCGCGTGGAT GCACAAGCACAATGGCAAGTACTACTTCTCCTACTCGACGGGCGACACCCACTTCCTCT GCTACGCCGTGGGCGACTCACCCATGGGTCCGTTCACGTATGGCGGCAAGATCCTGGA GCCCGTGCTGGGCTGGACGACGCACCACTCGATTGTCGAGTACAAGGGCAAGACATAT CTCTTCTTCCACGACTGTGAGCTGAGCAAGGGTGTGGACCACCTCAGGAGCGTCAAGG CCAAGGAGATCTTTTACGACGATCAGGGTAGGATCATCACGACAAAGGCAGAT

一种携带如上所述的编码突变体的基因的重组载体、重组细胞或重组工程菌。

一种提高低温β-木糖苷酶的热稳定性和比活力的方法，所述方法中将低温β-木糖苷酶的氨基酸序列进行如下位点的突变：G110S/Q201R/loop2。

而且，步骤如下：

①采用over-lap PCR的方法扩增高热稳定性和比活力的低温β-木糖苷酶突变体基因序列；

②将高热稳定性和比活力的低温β-木糖苷酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC9上；

③将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，诱导表达，获得突变株。

而且，所述突变体为G110S、Q201R或loop2。

如上所述的热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体在工业领域方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体，低温β-木糖苷酶突变体突变体G110S在45℃处理10min后剩余活力由野生型的基本消失提高至37％；同时，比活力由 4.85U/mg提高到7.02U/mg，动力学参数Km、Vmax、Kcat分别为12.8mmol/L、1.24mmol/L、 19.26s^-1；突变体Q201R在45℃处理10min后剩余活力提高至41％，比活力提高至6.29U/mg，动力学参数Km、Vmax、Kcat分别为20.2mmol/L、1.46mmol/L、15.61s^-1；突变体loop2在 45℃处理10min后剩余活力提高至41％，比活力提升至6.83U/mg，动力学参数Km、Vmax、 Kcat分别为17.28mmol/L、1.49μmol/min/mg、24.98s^-1，且依然保持了其低温特性；因此，该稳定性提高和比活力上升的低温β-木糖苷酶突变体更适合工业应用，在食品、饲料、造纸等领域具有更广泛的应用前景，从而扩大了低温β-木糖苷酶在食品、医药、造纸、饲料等领域提供了应用潜力。

2、本发明方法对野生型低温β-木糖苷酶的氨基酸序列进行G110S/Q201R/loop2位点突变，可显著提高低温β-木糖苷酶的热稳定性和比活力，克服了现有低温β-木糖苷酶热稳定性差以及比活力低的问题，采用定点突变的方式，获得热稳定性好、比活力高且依然保持低温特性的低温β-木糖苷酶突变体。

附图说明

图1为本发明中低温β-木糖苷酶野生酶AX543和突变体loop2/G110S/Q201R以及空载质粒的蛋白电泳图(注：M为蛋白maker，1为空载体pPIC9蛋白，2为野生型AX543蛋白，3 为loop2突变体蛋白，4为G110S突变体蛋白，5为Q201R突变体蛋白。)；

图2为本发明中低温β-木糖苷酶突变体G110S和野生酶AX543最适温度折线图；

图3为本发明中在45℃条件下低温β-木糖苷酶突变体G110S和野生酶AX543的剩余酶活折线图；

图4为本发明中低温β-木糖苷酶突变体Q201R和野生酶AX543最适温度折线图；

图5为本发明中在45℃条件下低温β-木糖苷酶突变体Q201R和野生酶AX543的剩余酶活折线图；

图6为本发明中低温β-木糖苷酶突变体loop2和野生酶AX543最适温度折线图；

图7为本发明中在45℃条件下低温β-木糖苷酶突变体loop2和野生酶AX543的剩余酶活折线图；

图8为本发明中在最适反应条件下低温β-木糖苷酶突变体G110S/Q201R/loop2和野生酶 AX543的比活力柱形图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

SEQ ID NO.1

SEQ ID NO.2

SEQ ID NO.3

较优地，编码低温β-木糖苷酶突变体G110S的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

SEQ IQ NO.4

SEQ IQ NO.5

SEQ IQ NO.6

一种提高低温β-木糖苷酶的热稳定性和比活力的方法，所述方法中将低温β-木糖苷酶的氨基酸序列进行如下位点的突变：G110S、Q201R和loop2。

较优地，步骤如下：

较优地，所述突变体为G110S、Q201R和loop2。

如上所述的热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体能够应用在工业领域方面中。

本发明中相关的具体实施例：

1、试验材料和试剂

菌株和载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9。

酶类和其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，T₄连接酶购自Promega公司，聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。

2、培养基：

(1)YPD液体培养基：1％(w/v)酵母浸出物，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)无水葡萄糖；

(2)MD固体培养基：1.34％(w/v)YNB,2％(w/v)葡萄糖，4x10^-5％(w/v)生物素， 2％(w/v)琼脂；

(3)BMGY培养基：1％(w/v)酵母浸出物，2％(w/v)蛋白胨，100mM磷酸，1.34％ (w/v)YNB，4x10^-5％(w/v)生物素，1％(w/v)甘油；

(4)BMMY培养基：1％(w/v)酵母浸出物，2％(w/v)蛋白胨，100mM磷酸，1.34％YNB，4x10^-5％(w/v)生物素，0.5％(v/v)甲醇；

实施例1突变酶和野生酶表达基因的克隆

本发明以低温木糖苷酶AX543为母本，采用Overlap-PCR的方法，利用表1的引物对低温木糖苷酶AX543进行突变后表达，其基因序列如SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.5/SEQ IDNO.6 所示。

表1.β-木糖苷酶突变体G110S、Q201R和loop2的PCR特异性引物

实施例2突变酶和野生酶在毕赤酵母中的表达和纯化

对β-木糖苷酶突变体G110S、Q201R、loop2的PCR产物和表达载体pPIC9分别进行双酶切(EcoRⅠ+XholⅠ)，切好的基因片段与载体进行连接获得含有高热稳定性和比活力的低温β-木糖苷酶突变体G110S、Q201R和loop2的重组质粒，将正确重组质粒线性化后电击转化至毕赤酵母GS115感受态细胞，获得重组酵母菌株GS115/G110S、GS115/Q201R、 GS115/loop2。

挑取MD平板上的单克隆菌落，用沾有菌体的牙签分别依次点于另一已编号的MD平板上和含1mL BMGY培养基的96孔板中，MD平板30℃倒置培养的同时，将含有1mL BMGY 培养基的96孔板在30℃，220r/min培养48h；培养48h后的菌液4℃、4500r/min离心5min，收集菌体，去除上清，再向96孔板中加入500μL BMMY培养基(含0.5％v/v甲醇)进行诱导培养48h，每隔24h补加一次甲醇；诱导表达结束后，4℃、2500r/min离心5min收集培养液上清，用于木糖苷酶活性的检测，筛选活力较高的表达菌株。

将筛选出的酶活力最高的转化子，从MD平板中挑取菌落接种至50mL YPD培养基中， 30℃培养48h，然后按1％的接种量，将活化后的菌体接种至100mL BMGY培养基中富集48h，培养后的菌液以4℃、4500r/min离心5min收集，向菌体中重新加入50mL BMMY培养基(含0.5％v/v甲醇)诱导表达，进行诱导培养48h，每隔24h补加一次甲醇；诱导表达结束后，4℃、2500r/min离心5min收集培养液上清并纯化，纯化后的酶液用于木糖苷酶活性的检测，结果如图1所示，通过SDS-PAGE蛋白电泳分析发现，纯化后的重组酶的大小约为42kDa，与理论值相符，说明蛋白表达成功。

实施例3突变酶和野生酶的活性分析

1个酶活性单位(U)定义为在一定反应条件下，每分钟分解底物pNPX生成1μmol对硝基酚(pNP)所需的酶量。

β-木糖苷酶活性的测定：在250μL底物pNPX中加入150μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，于20℃预热2min后加入100μL酶液(2U/ml)，20℃反应10min，加入1.5mL，1mol/L 的Na₂CO₃溶液终止反应，OD₄₀₅测定其吸光度。

β-木糖苷酶最适温度：以2mM pNPX为底物，在250μL底物中加入150μL 0.2mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)，将底物与缓冲液的混合液于0℃-50℃水浴中预热2min，然后加入100μL酶液(2U/ml)，在0℃-50℃反应10min，加入1.5mL 1M的Na₂CO₃终止反应，将反应液冷却至室温测定OD₄₀₅的吸光值；

结合β-木糖苷酶的活性测定以及最适温度的测定，结果如图2、图4和图6所示，结果表明突变体G110S、Q201R、loop2与野生型AX543相比，最适温度均为20℃，符合不改变最适温度提高比活力和热稳定性的目的。

实施例4突变酶和野生酶的热稳定性分析

将酶液分别置于45℃条件下预处理10min，分别在不同时间点取样(0min、1min、2min、 5min、10min)，在最适反应条件下测定不同时间点样品的剩余酶活，未经过任何处理的酶作为对照。结果如图3、图5和图7所示，结果表明：在45℃条件下处理10min后，野生型AX543基本丧失酶活，突变体G110S的剩余酶活为37％，突变体loop2的剩余酶活为41％，突变体Q201R的剩余酶活为41％，可得出突变体G110S、loop2和Q201R的热稳定性均得到了提高。

实施例5突变体酶和野生型酶的比活力分析

结果如图8所示，通过比较分析发现：突变体G110S比活力由4.85U/mg提高到7.02U/mg，动力学参数Km、Vmax、Kcat分别为12.8mmol/L、1.24mmol/L、19.26s^-1；突变体Q201R比活力提高至6.29U/mg，动力学参数Km、Vmax、Kcat分别为20.2mmol/L、1.46mmol/L、15.61s^-1；突变体loop2比活力提升至6.83U/mg，动力学参数Km、Vmax、Kcat分别为17.28mmol/L、 1.49μmol/min/mg、24.98s^-1。由以上结果可知，三个突变体的比活力均有明显的提升，这可以为低温木糖苷酶在工业领域的应用提供更广阔的应用前景。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体及其编码基因和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 324

<212> PRT

<213> G110S的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Pro Pro Leu Ile Thr Ser Ile Tyr Thr Ala Asp Pro Ser Ala His

1 5 10 15

Val Phe Asn Asp Lys Ile Tyr Ile Tyr Pro Ser His Asp Arg Glu Thr

20 25 30

Asp Ile Ala Phe Asn Asp Asn Gly Asp Gln Tyr Asp Met Ala Asp Tyr

35 40 45

His Val Phe Ser Thr Ser Asp Phe Lys Glu Val Thr Asp His Gly Val

50 55 60

Val Leu Lys Thr Glu Asp Val Pro Trp Ala Ser Lys Gln Leu Trp Ala

65 70 75 80

Pro Asp Ala Ala His Lys Asn Gly Lys Tyr Tyr Leu Tyr Phe Pro Ala

85 90 95

Arg Asp Lys Glu Gly Ile Phe Arg Ile Gly Val Ala Val Ser Asp Lys

100 105 110

Pro Glu Gly Pro Phe Thr Ala Asp Pro Glu Pro Ile Lys Gly Ser Tyr

115 120 125

Ser Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Asp Asp Asp Gly Gln Ala Tyr Leu

130 135 140

Tyr Phe Gly Gly Leu Trp Gly Gly Gln Leu Gln Cys Tyr Gln Lys Gly

145 150 155 160

Asp Asp Thr Tyr Asp Pro Glu Trp Gln Gly Pro Lys Glu Val Ser Gly

165 170 175

Glu Gly Val Ala Ala Gln Gly Pro Arg Ala Ala Lys Leu Thr Asp Asp

180 185 190

Met His Gln Phe Glu Ser Pro Ala Gln Glu Leu Leu Ile Leu Asp Pro

195 200 205

Glu Thr Lys Glu Pro Ile Leu Gly Asp Asp His Ala Arg Arg Phe Phe

210 215 220

Glu Ala Ala Trp Met His Lys His Asn Gly Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr

225 230 235 240

Ser Thr Gly Asp Thr His Phe Leu Cys Tyr Ala Val Gly Asp Ser Pro

245 250 255

Met Gly Pro Phe Thr Tyr Gly Gly Lys Ile Leu Glu Pro Val Leu Gly

260 265 270

Trp Thr Thr His His Ser Ile Val Glu Tyr Lys Gly Lys Thr Tyr Leu

275 280 285

Phe Phe His Asp Cys Glu Leu Ser Lys Gly Val Asp His Leu Arg Ser

290 295 300

Val Lys Ala Lys Glu Ile Phe Tyr Asp Asp Gln Gly Arg Ile Ile Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ala Asp

<210> 2

<211> 324

<212> PRT

<213> Q201R的氨基酸序列(Unknown)

<400> 2

Met Pro Pro Leu Ile Thr Ser Ile Tyr Thr Ala Asp Pro Ser Ala His

1 5 10 15

Val Phe Asn Asp Lys Ile Tyr Ile Tyr Pro Ser His Asp Arg Glu Thr

20 25 30

Asp Ile Ala Phe Asn Asp Asn Gly Asp Gln Tyr Asp Met Ala Asp Tyr

35 40 45

His Val Phe Ser Thr Ser Asp Phe Lys Glu Val Thr Asp His Gly Val

50 55 60

Val Leu Lys Thr Glu Asp Val Pro Trp Ala Ser Lys Gln Leu Trp Ala

65 70 75 80

Pro Asp Ala Ala His Lys Asn Gly Lys Tyr Tyr Leu Tyr Phe Pro Ala

85 90 95

Arg Asp Lys Glu Gly Ile Phe Arg Ile Gly Val Ala Val Gly Asp Lys

100 105 110

Pro Glu Gly Pro Phe Thr Ala Asp Pro Glu Pro Ile Lys Gly Ser Tyr

115 120 125

Ser Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Asp Asp Asp Gly Gln Ala Tyr Leu

130 135 140

Tyr Phe Gly Gly Leu Trp Gly Gly Gln Leu Gln Cys Tyr Gln Lys Gly

145 150 155 160

Asp Asp Thr Tyr Asp Pro Glu Trp Gln Gly Pro Lys Glu Val Ser Gly

165 170 175

Glu Gly Val Ala Ala Gln Gly Pro Arg Ala Ala Lys Leu Thr Asp Asp

180 185 190

Met His Gln Phe Glu Ser Pro Ala Arg Glu Leu Leu Ile Leu Asp Pro

195 200 205

Glu Thr Lys Glu Pro Ile Leu Gly Asp Asp His Ala Arg Arg Phe Phe

210 215 220

Glu Ala Ala Trp Met His Lys His Asn Gly Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr

225 230 235 240

Ser Thr Gly Asp Thr His Phe Leu Cys Tyr Ala Val Gly Asp Ser Pro

245 250 255

Met Gly Pro Phe Thr Tyr Gly Gly Lys Ile Leu Glu Pro Val Leu Gly

260 265 270

Trp Thr Thr His His Ser Ile Val Glu Tyr Lys Gly Lys Thr Tyr Leu

275 280 285

Phe Phe His Asp Cys Glu Leu Ser Lys Gly Val Asp His Leu Arg Ser

290 295 300

Val Lys Ala Lys Glu Ile Phe Tyr Asp Asp Gln Gly Arg Ile Ile Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ala Asp

<210> 3

<211> 327

<212> PRT

<213> loop2的氨基酸序列(Unknown)

<400> 3

Met Pro Pro Leu Ile Thr Ser Ile Tyr Thr Ala Asp Pro Ser Ala His

1 5 10 15

Val Phe Asn Asp Lys Ile Tyr Ile Tyr Pro Ser His Asp Arg Glu Thr

20 25 30

Asp Ile Ala Phe Asn Asp Asn Gly Asp Gln Tyr Asp Met Ala Asp Tyr

35 40 45

His Val Phe Ser Leu Asp Ser Leu Asp Pro Pro Ser Glu Val Thr Asp

50 55 60

His Gly Val Val Leu Lys Thr Glu Asp Val Pro Trp Ala Ser Lys Gln

65 70 75 80

Leu Trp Ala Pro Asp Ala Ala His Lys Asn Gly Lys Tyr Tyr Leu Tyr

85 90 95

Phe Pro Ala Arg Asp Lys Glu Gly Ile Phe Arg Ile Gly Val Ala Val

100 105 110

Gly Asp Lys Pro Glu Gly Pro Phe Thr Ala Asp Pro Glu Pro Ile Lys

115 120 125

Gly Ser Tyr Ser Ile Asp Pro Ala Ser Phe Val Asp Asp Asp Gly Gln

130 135 140

Ala Tyr Leu Tyr Phe Gly Gly Leu Trp Gly Gly Gln Leu Gln Cys Tyr

145 150 155 160

Gln Lys Gly Asp Asp Thr Tyr Asp Pro Glu Trp Gln Gly Pro Lys Glu

165 170 175

Val Ser Gly Glu Gly Val Ala Ala Gln Gly Pro Arg Ala Ala Lys Leu

180 185 190

Thr Asp Asp Met His Gln Phe Glu Ser Pro Ala Gln Glu Leu Leu Ile

195 200 205

Leu Asp Pro Glu Thr Lys Glu Pro Ile Leu Gly Asp Asp His Ala Arg

210 215 220

Arg Phe Phe Glu Ala Ala Trp Met His Lys His Asn Gly Lys Tyr Tyr

225 230 235 240

Phe Ser Tyr Ser Thr Gly Asp Thr His Phe Leu Cys Tyr Ala Val Gly

245 250 255

Asp Ser Pro Met Gly Pro Phe Thr Tyr Gly Gly Lys Ile Leu Glu Pro

260 265 270

Val Leu Gly Trp Thr Thr His His Ser Ile Val Glu Tyr Lys Gly Lys

275 280 285

Thr Tyr Leu Phe Phe His Asp Cys Glu Leu Ser Lys Gly Val Asp His

290 295 300

Leu Arg Ser Val Lys Ala Lys Glu Ile Phe Tyr Asp Asp Gln Gly Arg

305 310 315 320

Ile Ile Thr Thr Lys Ala Asp

325

<210> 4

<211> 972

<212> DNA/RNA

<213> 编码低温β-木糖苷酶突变体G110S的基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 4

atgccgcccc tcattacctc catctacaca gctgatccct cagcccacgt cttcaatgac 60

aagatctaca tctacccgtc tcacgaccgc gagacggaca ttgccttcaa cgacaatggc 120

gaccagtatg acatggccga ctaccatgtc ttctccacgt cggacttcaa ggaggtgacc 180

gaccacggcg tcgtgctcaa gacagaggac gtgccgtggg cgagcaagca gctctgggcc 240

cccgacgcgg cgcacaagaa cggaaaatac tacctctact tcccggcacg agacaaggaa 300

ggcatctttc ggattggcgt ggccgtgagt gacaagcccg agggcccctt caccgccgac 360

ccagagccca tcaagggcag ctactccatc gacccggcca gtttcgtcga cgatgacggc 420

caggcctacc tctactttgg cggtctctgg ggtggccagc tccaatgcta ccaaaagggc 480

gacgacacgt acgacccgga gtggcaagga cccaaggaag tctctggcga gggcgtcgca 540

gcgcagggcc ctcgcgccgc caagttgaca gacgacatgc accaattcga gtcgccagcc 600

caagagctcc tcattctgga cccagagacc aaggaaccca ttctcggcga cgaccacgcg 660

cgccgcttct ttgaagccgc gtggatgcac aagcacaatg gcaagtacta cttctcctac 720

tcgacgggcg acacccactt cctctgctac gccgtgggcg actcacccat gggtccgttc 780

acgtatggcg gcaagatcct ggagcccgtg ctgggctgga cgacgcacca ctcgattgtc 840

gagtacaagg gcaagacata tctcttcttc cacgactgtg agctgagcaa gggtgtggac 900

cacctcagga gcgtcaaggc caaggagatc ttttacgacg atcagggtag gatcatcacg 960

acaaaggcag at 972

<210> 5

<211> 972

<212> DNA/RNA

<213> 编码低温β-木糖苷酶突变体Q201R的基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 5

atgccgcccc tcattacctc catctacaca gctgatccct cagcccacgt cttcaatgac 60

aagatctaca tctacccgtc tcacgaccgc gagacggaca ttgccttcaa cgacaatggc 120

gaccagtatg acatggccga ctaccatgtc ttctccacgt cggacttcaa ggaggtgacc 180

gaccacggcg tcgtgctcaa gacagaggac gtgccgtggg cgagcaagca gctctgggcc 240

cccgacgcgg cgcacaagaa cggaaaatac tacctctact tcccggcacg agacaaggaa 300

ggcatctttc ggattggcgt ggccgtgggt gacaagcccg agggcccctt caccgccgac 360

ccagagccca tcaagggcag ctactccatc gacccggcca gtttcgtcga cgatgacggc 420

caggcctacc tctactttgg cggtctctgg ggtggccagc tccaatgcta ccaaaagggc 480

gacgacacgt acgacccgga gtggcaagga cccaaggaag tctctggcga gggcgtcgca 540

gcgcagggcc ctcgcgccgc caagttgaca gacgacatgc accaattcga gtcgccagcc 600

cgagagctcc tcattctgga cccagagacc aaggaaccca ttctcggcga cgaccacgcg 660

cgccgcttct ttgaagccgc gtggatgcac aagcacaatg gcaagtacta cttctcctac 720

tcgacgggcg acacccactt cctctgctac gccgtgggcg actcacccat gggtccgttc 780

acgtatggcg gcaagatcct ggagcccgtg ctgggctgga cgacgcacca ctcgattgtc 840

gagtacaagg gcaagacata tctcttcttc cacgactgtg agctgagcaa gggtgtggac 900

cacctcagga gcgtcaaggc caaggagatc ttttacgacg atcagggtag gatcatcacg 960

acaaaggcag at 972

<210> 6

<211> 981

<212> DNA/RNA

<213> 编码低温β-木糖苷酶突变体loop2的基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 6

atgccgcccc tcattacctc catctacaca gctgatccct cagcccacgt cttcaatgac 60

aagatctaca tctacccgtc tcacgaccgc gagacggaca ttgccttcaa cgacaatggc 120

gaccagtatg acatggccga ctaccatgtc ttctccctcg actccctcga ccccccttcc 180

gaggtgaccg accacggcgt cgtgctcaag acagaggacg tgccgtgggc gagcaagcag 240

ctctgggccc ccgacgcggc gcacaagaac ggaaaatact acctctactt cccggcacga 300

gacaaggaag gcatctttcg gattggcgtg gccgtgggtg acaagcccga gggccccttc 360

accgccgacc cagagcccat caagggcagc tactccatcg acccggccag tttcgtcgac 420

gatgacggcc aggcctacct ctactttggc ggtctctggg gtggccagct ccaatgctac 480

caaaagggcg acgacacgta cgacccggag tggcaaggac ccaaggaagt ctctggcgag 540

ggcgtcgcag cgcagggccc tcgcgccgcc aagttgacag acgacatgca ccaattcgag 600

tcgccagccc aagagctcct cattctggac ccagagacca aggaacccat tctcggcgac 660

gaccacgcgc gccgcttctt tgaagccgcg tggatgcaca agcacaatgg caagtactac 720

ttctcctact cgacgggcga cacccacttc ctctgctacg ccgtgggcga ctcacccatg 780

ggtccgttca cgtatggcgg caagatcctg gagcccgtgc tgggctggac gacgcaccac 840

tcgattgtcg agtacaaggg caagacatat ctcttcttcc acgactgtga gctgagcaag 900

ggtgtggacc acctcaggag cgtcaaggcc aaggagatct tttacgacga tcagggtagg 960

atcatcacga caaaggcaga t 981

<210> 7

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> G110S-F(Unknown)

<400> 7

gtggccgtga gtgacaagcc cg 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> G110S-R(Unknown)

<400> 8

cgggcttgtc actcacggcc ac 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> Q201R-F(Unknown)

<400> 9

gccagcccga gagctcctca ttc 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> Q201R-R(Unknown)

<400> 10

atgaggagct ctcgggctgg cgac 24

<210> 11

<211> 46

<212> DNA/RNA

<213> Loop2-F(Unknown)

<400> 11

ctcgactccc tcgacccccc ttccgaggtg gaccgaccac ggcgtc 46

<210> 12

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> Loop2-R(Unknown)

<400> 12

ggggggtcga gggagtcgag ggagaagaca tggtagtcgg ccatgtc 47

Claims

1.一种热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体，其特征在于：所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体G110S，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；

或者，所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体loop2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

2.一种编码如权利要求1所述的热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的编码如权利要求1所述的热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体的基因，其特征在于：编码低温β-木糖苷酶突变体G110S的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；

编码低温β-木糖苷酶突变体loop2的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

4.一种携带如权利要求2或3所述的编码突变体的基因的重组载体或重组工程菌。

5.一种提高低温β-木糖苷酶的热稳定性和比活力的方法，其特征在于：所述方法中将低温β-木糖苷酶的氨基酸序列进行如下位点的突变：G110S、Q201R和loop2；

所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体G110S，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；

所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体Q201R，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

所述突变体为低温β-木糖苷酶突变体loop2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

6.根据权利要求5所述的提高低温β-木糖苷酶的热稳定性和比活力的方法，其特征在于：步骤如下：

采用over-lap PCR的方法扩增高热稳定性和比活力的低温β-木糖苷酶突变体基因序列；

将高热稳定性和比活力的低温β-木糖苷酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC9上；

将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，诱导表达，获得突变株。

7.如权利要求1所述的热稳定性和比活力提高的低温β-木糖苷酶突变体在工业领域方面中的应用。