CN113528486B

CN113528486B - 一种引入二硫键提高木聚糖酶热稳定性的方法

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Publication number: CN113528486B
Application number: CN202110952906.3A
Authority: CN
Inventors: 刘松; 李阳阳; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Guangdong Zhonghui Food Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Zhonghui Food Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-19
Filing date: 2021-08-19
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-08-19
Also published as: CN113528486A

Abstract

本发明公开了一种引入二硫键提高木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第106位的缬氨酸突变为半胱氨酸和第156位的丙氨酸突变为半胱氨酸，或，第108位的丝氨酸突变为半胱氨酸和第129位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，得到的突变体酶V106C/A156C、S108C/N152C在55℃孵育5min，相对酶活分别为85.6％和92.4％，比酶活为217U/mg和239U/mg，较野生型酶分别提高了27.3％和40.2％。在pH 2.0‑9.0间很稳定，孵育1h仍能保持70％以上的酶活力，具有在饲料、食品等领域广泛使用的前景。

Description

一种引入二硫键提高木聚糖酶热稳定性的方法

技术领域

本发明涉及一种引入二硫键提高木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

β-1,4-D-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是降解半纤维素中的木聚糖，生成低聚木糖的主要酶成分，在食品，医药，能源利用等方面有重要用途。其主要作用是以内切的方式将木聚糖内部的β-1,4-糖苷键断裂，再由其他酶共同作用。近些年，能源问题日益突出，面对石油等物质的枯竭，利用可再生的植物资源，生产绿色环保的生物乙醇成为主流，而生产效率低下，生产成本过高是国内开发生物乙醇的主要矛盾。11家族的木聚糖酶虽然在催化效率和pH耐受性方面有优势，但是较差的热稳定性使其受限于高温的生产过程，因此，对于木聚糖酶热稳定性的改造是亟需解决的问题。

众所周知，不同工业生产中对木聚糖酶的性质需求不同，比如：造纸需要高温兼具耐碱的木聚糖酶以辅助漂白；食品工业中要求酶在低温下有效；饲料粒化生产需要在70-95℃下进行，同时要考虑木聚糖酶在被动物摄入体内后在消化系统发挥作用的温度；苎麻生物脱胶过程需要酶在碱性条件下对苎麻木聚糖有更强的降解偏好性。因此，研究新的能适应不同的工业需求的木聚糖酶具有重大意义。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高且能适用不同工业需求的木聚糖酶。

[技术方案]

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第106位的缬氨酸和第156位的丙氨酸突变为半胱氨酸，或，第108位的丝氨酸第129位的天冬酰胺突变为半胱氨酸得到的。

本发明还提供了编码上述木聚糖酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体以pET系列为表达载体。

在一种实施方式中，所述载体以pET-22b(+)为表达载体。

本发明还提供了表达上述基因或上述载体的宿主细胞。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌表达上述木聚糖酶突变体。

在一种实施方式中，所述重组菌以pET系列为表达载体。

在一种实施方式中，所述重组菌以pET-22b(+)为表达载体。

在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。

本发明还提供了一种提高木聚糖酶热稳定性的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第106位的缬氨酸和第156位的丙氨酸突变为半胱氨酸，或，第108位的丝氨酸第129位的天冬酰胺突变为半胱氨酸。

本发明还提供了一种用于降解木聚糖的组合物，所述组合物含有上述木聚糖酶突变体作为活性成分，以所述组合物的总重量为基准，所述木聚糖酶的含量为10-90重量％。

本发明还提供了上述木聚糖酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组菌，或上述组合物在降解木聚糖中的应用。

[有益效果]

1、本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第106位的缬氨酸突变为半胱氨酸和第156位的丙氨酸突变为半胱氨酸，或，第108位的丝氨酸突变为半胱氨酸和第129位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，得到的突变体酶V106C/A156C、S108C/N152C在55℃条件下孵育5 min，相对酶活分别为85.6%和92.4%，

2、突变体酶V106C/A156C、S108C/N152C比酶活为217 U/mg和239 U/mg，较野生型酶分别提高了27.3%和40.2%。

3、突变体酶V106C/A156C、S108C/N152C在pH 2.0-9.0间很稳定，孵育1 h仍能保持70％以上的酶活力。

附图说明

图1：重组质粒pET-22b(+)-xynA的构建示意图。

图2：xynA和突变体的热稳定性图。

具体实施方式

木聚糖酶酶活测定：采用3，5-二硝基水杨酸测定木聚糖酶酶活的方法。将500 µL稀释至适当浓度的酶液或发酵上清与500 µL浓度为10 mg/mL桦木木聚糖底物（pH 4.0）混合，在50℃条件下反应10 min后用3，5-二硝基水杨酸试剂终止反应。将终止反应后的样品于沸水内反应5 min后立即用水冷却至室温，并在545 nm条件下测定吸光度，失活的酶液作为空白组。

酶活力单位（U/mL）定义：每分钟水解木聚糖所产生的1 μmol还原糖所需的酶量。

比酶活代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比酶活(U/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白。

黑曲霉（A.niger）：公开于CN110438018B，保藏编号为CCTCC M 2018881。

实施例1 木聚糖酶突变体的制备

（1）重组质粒pET-22b(+)-xynA的构建

以黑曲霉（A.niger）的基因组为模板，通过引物F1和R1进行PCR扩增得到基因片段xynA。以pET-22b(+)载体为模板，用intron primeF和intro primerR扩增得到pET-22b(+)载体片段，将基因片段xynA和pET-22b(+)载体片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收产物，将回收的基因片段xynA插入至pET-22b(+)载体的酶切位点NcoI和XhoI之间，并用磷酸化酶和Solution I去除内含子得到表达载体pET-22b(+)-xynA（图1）。将表达载体pET-22b(+)-xynA转化至E. coliJM109，在含有50 µg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50 µg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜后，提取质粒，并进行测序验证，成功构建表达野生型木聚糖酶基因xynA（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）的重组质粒pET-22b(+)-xynA。

PCR反应体系均为：正向引物(10 μM) 1μL，反向引物(10 μM) 1 μL，模板DNA 1 μL，2 × Phanta Max Master Mix 25 μL，加入双蒸水至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性3 min；94℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸50 s，循环34 次；最后72℃延伸5 min。

（2）含有木聚糖酶突变体的重组质粒的构建

分别设计并合成突变体Y13C/N51C、T18C/F44C、P66C/G70C、L82C/F132C、V106C/A156C和S108C/N152C的突变引物序列（表1），以步骤（1）构建的pET-22b(+)-xynA为模板，对木聚糖酶xynA进行定点突变，分别测序验证木聚糖酶突变体的编码基因，获得重组质粒pET-22b(+)-Y13C/N51C、pET-22b(+)-T18C/F44C、pET-22b(+)-P66C/G70C、pET-22b(+)-L82C/F132C、pET-22b(+)-V106C/A156C和pET-22b(+)-S108C/N152C。定点突变的PCR反应体系和扩增程序与步骤（1）相同。

表1 各质粒构建引物

注：下划线为酶切位点。

实施例2：XynA和突变体的表达、纯化和酶学性质测定

将实施例1构建的重组质粒pET-22b(+)-xynA、pET-22b(+)-Y13C/N51C、pET-22b(+)-T18C/F44C、pET-22b(+)-P66C/G70C、pET-22b(+)-L82C/F132C、pET-22b(+)-V106C/A156C和pET-22b(+)-S108C/N152C分别转化至大肠杆菌E.coliBL21 trxB（DE3）并涂布LB平板，37℃培养12~16 h。分别挑取转化子接种至新的LB培养基中，37℃、220 r/min下恒温摇床振荡培养到OD₆₀₀至0.8，加入终浓度为0.5 mM的IPTG (异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，25℃、220 rpm诱导发酵24 h，收集培养液，将培养液12000 rpm离心取上清液，将上清经0.22 µm滤膜过滤后用HisTrap^TMFF纯化，脱盐柱Sephadex G25脱盐，经SDS-PAGE蛋白电泳检测为单一条带，且大小与理论值相同。

最适反应温度的测定：用pH 7.5，浓度为50 mM的NaH₂PO₄- Na₂HPO₄缓冲体系及不同温度（40-60℃）进行酶促反应以测定纯化的野生型酶xynA和突变体酶的最适温度，分别测定酶活。以最高酶活为100%，计算各温度下的相对酶活。结果显示，突变体V106C/A156C、S108C/N152C的最适反应温度分别为55℃和58℃，较野生型xynA提高了5℃和8℃。

温度稳定性的测定：将纯化的野生型酶xynA和突变体酶分别在55℃条件下孵育0-80 min后置于冰上保存，测定各条件下的酶活。以孵育0 min时的酶活为100%，计算各孵育时间下的相对酶活。经测定，突变体V106C/A156C、S108C/N152C在55℃条件下孵育5 min，相对酶活分别为85.6%和92.4%（图2），孵育70 min时的相对酶活仍大于20%，而Y13C/N51C、T18C/F44C、P66C/G70C、L82C/F132C的热稳定性没有提高。

半衰期为拟合野生型酶xynA和突变体酶在不同温度下的相对酶活的回归方程后计算得到的，结果显示，野生型酶xynA的半衰期t_1/2 ^50℃为18 min，突变体酶V106C/A156C的半衰期t_1/2 ^50℃为355 min，突变体酶S108C/N152C的半衰期t_1/2 ^50℃为390 min。

最适反应pH的测定：在40℃下，纯化的野生型酶xynA和突变体酶在不同pH值(pH2.0-9.0)的缓冲液中进行酶促反应以测定其最适pH值，所用缓冲液为Na₂HPO₄-柠檬酸(pH2.0-5.0)、Na₂HPO₄- NaH₂PO₄(pH 6.0-7.0)、Tris-HCl(pH 8.0)和甘氨酸-NaOH(pH 9.0)缓冲液。结果显示，突变体酶V106C/A156C、S108C/N152C和野生型酶xynA的最适pH值保持一致，均为4.0。

pH稳定性的测定：将酶液在不同pH(pH 2.0-9.0)的缓冲液中于40℃下处理1 h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性，所用缓冲液如上所述。结果显示，突变体酶和野生型酶xynA的在pH 2.0-9.0间很稳定，保持了70％以上的酶活力。

测定突变体酶对桦木木聚糖的降解能力：结果显示，突变体酶V106C/A156C、S108C/N152C比酶活为217 U/mg和239 U/mg，分别提高了27.3%和40.2%，突变体酶Y13C/N51C、T18C/F44C、P66C/G70C、L82C/F132C的比酶活较野生酶xynA显著降低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种引入二硫键提高木聚糖酶热稳定性的方法

<130> BAA210985A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 564

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgaccccga gctcgaccgg cgagaacaac ggcttctact actccttctg gaccgacggc 60

ggtggcgacg tgacctacac caacggagat gctggtgcct acactgttga gtggtccaac 120

gtgggcaact ttgtcggtgg aaagggctgg aaccccggaa gtgcgcagga catcacctac 180

agcggcacct tcacccctag cggcaacggc tatctctccg tctatggctg gaccactgac 240

cccctgatcg agtactacat cgtcgagtcc tacggcgact acaaccccgg cagtggaggc 300

acatacaagg gcaccgtcac ctcggacgga tccgtttacg atatctacac ggctacccgt 360

accaatgctg cttccattca gggaaccgct accttcactc agtactggtc cgtccgccag 420

aacaagagag ttggcggaac tgttaccacc tccaaccact tcaatgcttg ggctaagctg 480

ggaatgaacc tgggtactca caactaccag atcgtggcta ccgagggtta ccagagcagt 540

ggatcttcgt ccatcactgt tcag 564

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ser Thr Pro Ser Ser Thr Gly Glu Asn Asn Gly Phe Tyr Tyr Ser Phe

1 5 10 15

Trp Thr Asp Gly Gly Gly Asp Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asp Ala Gly

20 25 30

Ala Tyr Thr Val Glu Trp Ser Asn Val Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys

35 40 45

Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala Gln Asp Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Phe

50 55 60

Thr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr Thr Asp

65 70 75 80

Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro

85 90 95

Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Ser Val

100 105 110

Tyr Asp Ile Tyr Thr Ala Thr Arg Thr Asn Ala Ala Ser Ile Gln Gly

115 120 125

Thr Ala Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asn Lys Arg Val

130 135 140

Gly Gly Thr Val Thr Thr Ser Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Lys Leu

145 150 155 160

Gly Met Asn Leu Gly Thr His Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly

165 170 175

Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Thr Val Gln

180 185

Claims

1.一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体，其特征在于，是对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第106位的缬氨酸和第156位的丙氨酸突变为半胱氨酸。

2.编码权利要求1所述木聚糖酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.表达权利要求2所述基因或权利要求3所述载体的宿主细胞。

5.一种重组菌，其特征在于，表达权利要求1所述的木聚糖酶突变体。

6.如权利要求5所述的一种重组菌，其特征在于，以pET系列为表达载体。

7.如权利要求5所述的一种重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主细胞。

8.一种提高木聚糖酶热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的第106位的缬氨酸突变为半胱氨酸和第156位的丙氨酸突变为半胱氨酸。

9.一种用于降解木聚糖的组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的木聚糖酶突变体作为活性成分，以所述组合物的总重量为基准，所述木聚糖酶的含量为10-90重量％。

10.权利要求1所述的木聚糖酶突变体、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的载体、权利要求5-7中任意一项所述的重组菌以及权利要求9所述的组合物在降解木聚糖中的应用。