CN109355272B

CN109355272B - 一种催化效率提高的木聚糖酶突变体

Info

Publication number: CN109355272B
Application number: CN201811621705.XA
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 张婷; 胡博淳; 苏永君; 文正; 徐雄峰; 刘艳; 胡蝶; 李剑芳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109355272A

Abstract

本发明公开了一种催化效率提高的木聚糖酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达技术领域。本发明通过定点突变和饱和突变生物技术改造木聚糖酶的分子结构，得到一株催化活性提高的木聚糖酶突变体AEx11A^T98D/V124Q。突变酶的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍，而且该酶在耐高温和高热稳定性方面仍然和原酶类似。本发明解决了木聚糖酶催化活性低的限制性问题，有较大应用潜力，也为木聚糖酶的研究奠定了理论基础。

Description

一种催化效率提高的木聚糖酶突变体

技术领域

本发明涉及一种催化效率提高的木聚糖酶突变体，属于基因工程和蛋白质表达技术领域。

背景技术

木聚糖(xylan)是半纤维素的重要组成成分，是一种重要的可再生生物资源。内切β-1,4-木聚糖酶简称为木聚糖酶(xylanases,EC 3.2.1.8)，能够水解木聚糖分子主链内部的β-1,4-糖苷键，广泛应用于食品、造纸和饲料等领域。

不同来源的木聚糖酶酶学性质各有不同，研究发现天然存在的木聚糖酶极少可以兼具高活性和高耐热性。因此，越来越多的研究者对木聚糖酶进行分子改造以期获得酶学性质优良的工业化木聚糖酶。目前对于木聚糖酶的分子改造研究主要集中在对酶的耐热性改造方面。然而，大多数改造后的木聚糖酶在耐热性提高的同时伴随着活性的下降，这在一定程度上限制了耐热木聚糖酶在工业中的应用。因此，一些研究者开始以耐热性较高的天然木聚糖酶为出发菌株，通过基因突变来提高其酶活性，以期获得耐热性和活性俱佳的突变木聚糖酶。如罗建杰等利用PCR方法将木聚糖酶XYN-W的C端57个氨基酸序列去除，比活性提高了43.9％；王谦等对木聚糖酶ATX活性位点附近的单一氨基酸实施定点突变(L49P)来增强木聚糖酶的活性，K_cat/K_m值较原酶提高了51.7％。虽然很多研究者通过基因突变技术对木聚糖酶进行了分子改造并取得了一定的成果，但仍未能达到工业化应用的水平，改善木聚糖酶催化特性的分子改造研究还有待进行。

发明内容

本发明通过构建突变文库结合定点突变，筛选获得了催化活性提高的木聚糖酶。

本发明的目的是提供一种催化效率提高的AEx11A突变体，所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或表达所述突变体的细胞。

本发明的第四个目的是提供一种提高木聚糖酶催化活性的方法，所述方法是在突变体如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第98位的苏氨酸突变成天冬氨酸(T98D)，和/或将第124位的缬氨酸突变成谷氨酰胺(V124Q)。

在本发明的一种实施方式中，编码SEQ ID NO.2所示的木聚糖酶的基因序列如SEQIDNO.4所示。

本发明的第五个目的提供一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，表达了SEQ ID NO.1所示的木聚糖酶突变体

在本发明的一种实施方式中，表达载体是以下任意一种：pET-22b(+)、pET-28a(+)、pET-32a(+)、pET-41a(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pET-28a(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌宿主菌是以下任意一种：E.coliBL21、E.coliJM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌宿主菌是E.coli BL21。

本发明的第六个目的是提供一种组合物，含有SEQ ID NO,1所示的木聚糖酶突变体，或表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述组合物是菌剂，含有表达SEQ ID NO,1所示木聚糖酶突变体的细胞和细胞保护剂。

本发明还要求保护所述木聚糖酶突变体或所述基因工程菌在生产食品、饲料或造纸方面的应用。

本发明的有益效果：本发明在具有一定催化活性的木聚糖酶基础上，通过定点突变生物技术改造木聚糖酶的分子结构，得到一株催化活性提高的木聚糖酶突变体AEx11A^T98D/V124Q。突变酶的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍，而且该酶的最适温度为75℃，在该温度下的半衰期为188分钟，均与原酶类似。这说明该突变酶不但酶活和动力学参数提高了，而且保持了其在耐高温和高热稳定性方面的性质。本发明解决了木聚糖酶催化活性低的限制性问题，有较大应用潜力，也为木聚糖酶的研究奠定了理论基础。

附图说明

图1为不同温度下酶的相对活性。

图2为酶的温度稳定性示意图。

具体实施方式

木聚糖酶的活性测定方法：向两个25mL具塞试管A和B中各加入2.4mL 0.5％桦木木聚糖溶液(pH 5.5、50mmol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液配制)，先50℃预热10min，向A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.4mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，向B管中再补加0.1mL灭活的酶液，A、B管沸水浴显色7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。在上述反应条件下，1个木聚糖酶活性单位(U)定义为每分钟产生1μmol还原糖(以D-木糖计)所需的酶量。

实施例1突变文库的构建

通过搜索蛋白质PDB数据库，获得与木聚糖酶AEx11A的蛋白质序列一致性为76％的木聚糖酶晶体结构(PDB:2VGD)，以2VGD为模板，利用SWISS-MODEL对木聚糖酶AEx11A进行三维结构模拟，对模拟后的AEx11A进行分子对接。通过对AEx11A的三维结构进行保守性分析和氨基酸位置及理化性质分析，选择同时将第98位的苏氨酸突变成了天冬氨酸，并在上述基础上对第124位的缬氨酸进行饱和突变，筛选出最优转化子。基于以上设计的突变位点，设计并合成特异性定点突变引物为T98D-F、T7-R(如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示)和饱和定点突变引物V124X-F(如SEQ ID NO.7所示)、T7-R(如SEQ ID NO.6所示)。

以携带AEx11A基因的重组质粒pET-28a(+)-AEx11A为模板，T98D-F、T7-R为上下游引物，进行突变PCR，即得到编码的第98位氨基酸由苏氨酸突变成了天冬氨酸的重组质粒pET-28a(+)-AEx11A^T98D；以pET-28a(+)-AEx11A^T98D为模板，V124X-F、T7-R为上下游引物，进行定点饱和突变PCR，构建饱和突变文库pET-28a-AEx11A^T98D/V124X(X代表任意氨基酸)。

实施例2：突变文库的筛选

将实施例1构建的饱和突变文库pET-28a-AEx11A^T98D/V124X转化E.coli BL21感受态细胞，具体方法如下：

1)接种LB平板活化的E.coli BL21于2mL LB培养基中，37℃，220r/min过夜培养；2％接种上述培养液于5mL LB培养基中，37℃，220r/min培养4h；

2)取上述菌液1.4mL放入1.5mLEP管中，冰浴10min，4000r/min离心2min，收集菌体；

3)加入1mL预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬上述细胞，冰浴10min，4000r/min，离心2min，收集菌体；

4)加入100μL预冷的0.1M CaCl₂溶液悬浮上述细胞，4℃保存30min即可转化；

5)取100μL感受态细胞于冰上完全解冻后，轻轻将细胞均匀悬浮，加入5μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；

6)42℃水浴热激90s，冰浴15-20min；

7)加入400μL LB培养基，37℃，220r/min振荡培养1h；

8)室温下4000r/min离心5min，去掉450μL上清液，将剩余菌液吹打混匀后，涂布于Kan板上；

9)挑取上述平板中挑选97个转化子，接种于1mL LB抗性培养基中，37℃、220r/min培养12h，以2％接种量转接至1mL相同的培养基，培养至OD₆₀₀约为0.6～0.8时，加入0.5mmol/L IPTG、28℃诱导表达5h，4℃，8000r/min，离心5min收集菌体，加入200μL 1mg/mL溶菌酶溶液后，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液即为粗酶液；

10)将酶液适当稀释后取5μL加入95μL 0.5％(w/v)桦木木聚糖溶液(pH 5.5、50mmol/L的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液)中，借助PCR仪进行催化和显色反应(75℃10min，加50μL DNS试剂，95℃5min，冷却至10℃)，加入96孔板中，用酶标仪测定OD₅₄₀值；

11)酶活性大于原酶30％的突变木聚糖酶所对应的突变子定义为正突变子，对其进行DNA测序。根据测序结果，对酶活性提高的重组菌命名为E.coli BL21-AEx11A^T98D/V124Q。

实施例3重组木聚糖酶的纯化及酶学性质的测定

E.coli/AEx11A和E.coli/AEx11A^T98D/V124Q经0.4mmol/L IPTG、20℃诱导表达8h和超声波破碎细胞，上清采用Ni-NAT柱纯化目的酶蛋白。SDS-PAGE检测纯化的AEx11A和AEx11A^T98D/V124Q均约在相对分子质量26.2kDa处呈现单一条带。对纯化后AEx11A和AEx11A^T98D/V124Q的酶学性质分析，如表1，AEx11A^T98D/V124Q突变酶的比活性是AEx11A的3.04，催化效率是AEx11A的2.74倍。由于底物亲和力及催化效率的提高，增加了突变体AEx11A^T98D ^/V124Q的比酶活。这表明该发明通过突变的创新方式提高了木聚糖酶的酶学性质。

分别在不同温度下测定酶的相对活力，以75℃下的酶活为100％，结果如图1所示，突变体在70～80℃均保持了90％以上的相对酶活。在75℃下比较突变前后的酶的半衰期，结果如图2所示，在该温度下的半衰期为188分钟，温度稳定性与原酶类似。

表1AEx11A突变体反应动力学参数

对比例1：

具体实施方式同实施例2-3，区别在于，将单突变体pET-28a(+)-AEx11A^T98D转化至E.coliBL21感受态细胞，酶学性质如表1，分析显示：AEx11A^T98D的比酶活和催化效率分别是原酶AEx11A的2.37倍和2.02倍，但效果不如AEx11A^T98D/V124Q。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化效率提高的木聚糖酶突变体

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Ala Gln Thr Cys Leu Thr Ser Pro Gln Thr Gly Phe His Asn Gly

1 5 10 15

Phe Phe Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Ser Pro Gly Thr Val Asn Phe Cys

20 25 30

Leu Leu Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Ser Asn Trp Ser Asn Val Gly Asn

35 40 45

Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ser Arg Ala Ile Thr

50 55 60

Tyr Ser Gly Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Val Tyr

65 70 75 80

Gly Trp Thr Thr Asp Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr

85 90 95

Gly Asp Tyr Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Gln Val Thr

100 105 110

Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Ile Tyr Thr Ser Gln Arg Thr Asn Ala

115 120 125

Pro Ser Ile Ile Gly Thr Ala Thr Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg

130 135 140

Thr Ser Lys Arg Val Gly Gly Thr Val Thr Thr Gly Asn His Phe Asn

145 150 155 160

Ala Trp Ala Lys Tyr Gly Leu Thr Leu Gly Thr His Asn Tyr Gln Ile

165 170 175

Val Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ile Thr Val

180 185 190

Tyr

<210> 2

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

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1 5 10 15

Phe Phe Tyr Ser Phe Trp Lys Asp Ser Pro Gly Thr Val Asn Phe Cys

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Leu Leu Glu Gly Gly Arg Tyr Thr Ser Asn Trp Ser Asn Val Gly Asn

35 40 45

Phe Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ser Arg Ala Ile Thr

50 55 60

Tyr Ser Gly Ser Phe Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Val Tyr

65 70 75 80

Gly Trp Thr Thr Asp Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr

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Gly Thr Tyr Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Gln Val Thr

100 105 110

Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asn Ile Tyr Thr Ser Val Arg Thr Asn Ala

115 120 125

Pro Ser Ile Ile Gly Thr Ala Thr Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg

130 135 140

Thr Ser Lys Arg Val Gly Gly Thr Val Thr Thr Gly Asn His Phe Asn

145 150 155 160

Ala Trp Ala Lys Tyr Gly Leu Thr Leu Gly Thr His Asn Tyr Gln Ile

165 170 175

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180 185 190

Tyr

<210> 3

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacgctcaaa cttgtcttac ctctccacaa actggttttc acaacggttt cttctactct 60

ttctggaagg acagtccagg tactgttaat ttttgtctgt tggagggtgg tcgttacact 120

tctaactggt ccaacgtcgg caacttcgtc ggcgggaaag gatggaaccc cggaagctcc 180

agagcaatca cctactccgg aagcttcaac cccagcggaa acggctacct agctgtgtac 240

ggctggacca ctgaccccct gattgaatac tacatcgtcg agtcgtacgg cgactacaac 300

cccggcagcg gcggcaccta caagggccag gttacctccg acggaggcac atataatatc 360

tatacctctc aacgaaccaa tgcaccatct atcatcggga cggcgacctt tacgcagttt 420

tggtctgtga ggacttcgaa gcgtgtgggt ggcacggtca ctacggggaa tcatttcaat 480

gcgtgggcta agtatgggtt gaccttgggg acgcataatt atcagattgt ggctacggag 540

gggtatcaga gtagtgggtc ttctgctatc actgtttat 579

<210> 4

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<212> DNA

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<210> 5

<211> 27

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

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<210> 7

<211> 27

<212> DNA

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<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

tctatacctc tnnkcgaacc aatgcac 27

Claims

1.一种木聚糖酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述木聚糖酶突变体的基因。

3.含有编码权利要求2所述基因的载体。

4.含有编码权利要求1所述木聚糖酶突变体基因的细胞，其特征在于，包括真菌细胞或细菌细胞。

5.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，含有编码权利要求2所述基因的载体。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主包括以下任意一种：E. coli BL21、E. coli JM109、E. coli DH5α或E. coli TOP10。

7.根据权利要求5或6所述的基因工程菌，其特征在于，以pET系列质粒为表达载体。

8.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1所示的木聚糖酶突变体，或权利要求4所述的细胞。

9.一种提高木聚糖酶催化活性的方法，其特征在于，在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基础上，将第98位的苏氨酸突变为天冬氨酸，第124位的缬氨酸突变成谷氨酰胺。

10.权利要求1所述的木聚糖酶突变体或权利要求4所述的细胞在生产食品、饲料或造纸方面的应用。