CN106636038B - 一种耐热性改善的木聚糖酶及其应用 - Google Patents

一种耐热性改善的木聚糖酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐热性改善的木聚糖酶及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明对具有最高B‑factor值位点处的Gly21进行替换，构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标，从文库中筛选出最优突变转化子(E.coli/Aoxyn11AG21I)，E.coli/Aoxyn11AG21I表达一种由Ile21替换了Gly21的突变酶AoXyn11AG21I。该突变酶的表现出更好的温度特性。本发明得到的突变体比野生木聚糖酶具有更大的工业化生产潜力。

Description

一种耐热性改善的木聚糖酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种耐热性改善的木聚糖酶及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
木聚糖酶(xylanases,EC 3.2.1.8)是内切β-1,4-D-木聚糖酶的简称，从木聚糖分子主链的内部切割β-1,4-D-木糖苷键，是木聚糖降解酶系中最关键的组分。木聚糖酶主要归属糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase families,GHFs)10和11，GHF11木聚糖酶的三维结构由一个α-螺旋、两个反向平行的β-折叠片A和B及若干loops构成，呈右手半握形状。
随着低聚木糖生理功能的发现、加酶饲料的兴起及人类环保意识的增强，木聚糖酶在许多工业领域如食品、饲料、纺织和造纸等中的应用潜力日趋凸显。目前商品化的木聚糖酶多为中温酶，最适温度在45～55℃范围内，然而酶在使用过程中经常会遭遇或需要高温环境，如在纸浆漂白和饲料造粒工艺中需要60～80℃的温度，因此耐热性差已成为制约木聚糖酶发展的瓶颈。目前，获得耐热木聚糖酶的途径除了从极端环境中筛选产耐热酶的微生物外，还可采用蛋白质工程技术对酶学性质优质的中温酶实施耐热性改造。
发明内容
本发明的目的首先是提供一种耐热性改善的木聚糖酶，所述木聚糖酶是(a)或(b)或(c)：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有木聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白质；
(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有木聚糖酶活性的蛋白质。
在本发明的一种实施方式中，编码所述耐热性改善的木聚糖酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种获得所述耐热性改善的木聚糖酶的方法，利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，运用基因工程的方法构建表达突变木聚糖酶的工程菌用于高效表达重组木聚糖酶。
在本发明的一种实施方式中，将米曲霉木聚糖酶AoXyn11A中Gly21随机替换为异亮氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)AoXyn11A三维结构的同源建模：在PDB数据库中搜索与AoXyn11A一级结构同源性高的且已知晶体结构的GHF11木聚糖酶，选取分别源自Penicilliumfuniculosum(1TE1)、E.coli(2VUL)和Hypocreajecorina(1ENX)的3种木聚糖酶晶体结构作为模板，运用SALIGN多空间结构比对程序(http://salilab.org/DBAli/？page＝tools_&action＝f_salign)和MODELLER 9.11建模程序(http://salilab.org/modeller/)进行AoXyn11A三维结构的多模板同源建模及优化。
(2)拟随机突变位点的选定：运用GROMACS 4.5程序包(http://www.gromacs.org/)对AoXyn11A的三维结构进行分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟，其模拟体系选用GROMOS 96力场，溶质分子被1.5nm的SPC/E水分子层包裹。在MD模拟之前，对受约束和去约束的溶质分子体系分别进行了两次能量的优化，即先采用800步最陡下降优化，再采用1200步共轭梯度法优化。MD模拟过程包括两步：首先进行20ps、温度从0K逐渐升至500K约束溶质分子的模拟，然后是500ps的无约束恒温MD模拟。模拟结束后，使用B-FITTER软件导出AoXyn11A各个氨基酸的B-factor值，根据AoXyn11A的B-factor值的波动性，选择将最高B-factor值位点处的Gly21替换为其他氨基酸。
(3)突变转化子文库的构建和筛选：基于GenBank上AoXyn11A的基因序列及选定的拟随机突变位点，设计2条引物：
含饱和突变密码子(N＝A/C/G/T，K＝T/G)
含饱和突变密码子(M＝A/C)
以pET-28a-Aoxyn11A为模板、G21X-F和G21X-R为引物，采用一步反向PCR介导的定点突变对Gly21密码子实施饱和突变。将pET-28a-Aoxyn11A突变体用DpnⅠ消化，转化E.coliBL21，构建突变转化子文库。从文库中挑选96个转化子(E.coli/Aoxyn11AG21X，X代表任意氨基酸)，接种于500μL LB抗性培养基中，37℃、220r/min培养12h，以2％接种量转接相同的培养基，培养至OD600约为0.8时，加入0.5mmol/L IPTG、16℃诱导表达8h。离心收集菌体，用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mmol/L、pH 5.5)悬浮，反复冻融破碎细胞，上清作为粗酶液。将酶液60℃保温20min，适当稀释后取5μL加入95μL 0.5％(w/v)桦木木聚糖溶液(相同缓冲液配制)中，借助PCR仪进行催化和显色反应(50℃15min，加50μLDNS试剂，95℃5min，冷却至10℃)，加入96孔板中，用酶标仪测定OD540nm值。残余酶活性大于50％的突变木聚糖酶所对应的转化子定义为正突变子。
本发明利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，运用基因工程的方法构建表达突变木聚糖酶的工程菌，最终获得了60℃保温20min后，残余活性大于50％的木聚糖酶突变体AoXyn11AG21I，AoXyn11AG21I的最适温度为65℃，较AoXyn11A提高了10℃。本发明提供的耐热性改善的木聚糖酶，在保证其催化活性不变的同时热稳定性有所改善，有利于在工业上的应用。
附图说明
图1：AoXyn11A各位点处氨基酸残基的B-factor值；
图2：野生酶与突变酶的最适温度及热稳定性。
具体实施方式
木聚糖酶的活性测定方法：向两个25mL具塞试管A和B中各加入2.4mL 0.5％桦木木聚糖溶液(pH 5.5、50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制)，先50℃预热10min，向A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应15min；立即各加入2.4mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，向B管中再补加0.1mL灭活的酶液，A、B管沸水浴显色7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。在上述反应条件下，1个木聚糖酶活性单位(U)定义为每分钟产生1μmol还原糖(以D-木糖计)所需的酶量。
实施例1AoXyn11A三维结构的多模板同源建模
登录蛋白质结构数据库Protein databank(PDB，http://rcsb.org)，经BLAST比对，选取与AoXyn11A三维结构具有高度同源的木聚糖酶的晶体结构(PBD:1TE1,2VUL和1ENX)作为模板，运用SALIGN和MODELLER 9.9程序进行多模板同源建模和优化，获得了准确性较高的AoXyn11A三维结构模型
实施例2基于分子动力学模拟理性选择随机突变位点
运用GROMACS 4.5程序包(http://www.gromacs.org/)对AoXyn11A的三维结构进行分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟，其模拟体系选用GROMOS 96力场，溶质分子被1.5nm的SPC/E水分子层包裹。在MD模拟之前，对受约束和去约束的溶质分子体系分别进行了两次能量的优化，即先采用800步最陡下降优化，再采用1200步共轭梯度法优化。MD模拟过程包括两步：首先进行20ps、温度从0K逐渐升至500K约束溶质分子的模拟，然后是500ps的无约束恒温MD模拟。模拟结束后，使用B-FITTER软件导出AoXyn11A各个氨基酸的B-factor值，根据AoXyn11A的B-factor值的波动性(图1)，选择将最高B-factor值位点处的Gly21随机替换为其他氨基酸。
实施例3突变转化子文库的构建及筛选
(3)突变转化子文库的构建和筛选：基于GenBank上AoXyn11A的基因序列及选定的拟随机突变位点，设计2条引物：
含饱和突变密码子(N＝A/C/G/T，K＝T/G)
含饱和突变密码子(M＝A/C)
以pET-28a-Aoxyn11A(参见专利申请号：201110410553.0的专利申请)为模板、G21X-F和G21X-R为引物，采用一步反向PCR介导的定点突变对Gly21密码子实施饱和突变。将pET-28a-Aoxyn11A突变体用DpnⅠ消化，转化E.coli BL21，构建突变转化子文库。从文库中挑选96个转化子(E.coli/Aoxyn11AG21X，X代表任意氨基酸)，接种于500μL LB抗性培养基中，37℃、220r/min培养12h，以2％接种量转接相同的培养基，培养至OD600约为0.8时，加入0.5mmol/L IPTG、16℃诱导表达8h。离心收集菌体，用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液(50mmol/L、pH5.5)悬浮，反复冻融破碎细胞，上清作为粗酶液。
将酶液60℃保温20min，适当稀释后取5μL加入95μL 0.5％(w/v)桦木木聚糖溶液(相同缓冲液配制)中，借助PCR仪进行催化和显色反应(50℃15min，加50μLDNS试剂，95℃5min，冷却至10℃)，加入96孔板中，用酶标仪测定OD540nm值。残余酶活性大于50％的突变木聚糖酶所对应的转化子定义为正突变子，对其进行DNA测序并翻译成氨基酸序列。延长60℃保温时间，从正突变子中获得最优突变转化子。结果表明，60℃保温20min后，AoXyn11A活性完全丧失，而4种代表性突变酶AoXyn11AG21I、AoXyn11AG21F、AoXyn11AG21V和AoXyn11AG21L的残余活性大于50％。延长保温时间至30min，测得4种酶的残余活性分别为57.3、39.3、30.5和37.1％，从而获得了最优突变转化子E.coli/Aoxyn11AG21I。
实施例4重组木聚糖酶的纯化及酶活性测定
E.coli/Aoxyn11A和E.coli/Aoxyn11AG21I经0.5mmol/L IPTG、16℃诱导表达8h和超声波破碎细胞，上清采用Ni-NAT柱纯化目的酶蛋白。SDS-PAGE检测纯化的AoXyn11A和AoXyn11AG21I均约在相对分子质量24.1kDa处呈现单一条带。对纯化后AoXyn11A和AoXyn11AG21I的酶学性质进行比较，如图2所示：AoXyn11AG21I的最适温度为65℃，较AoXyn11A提高了10℃；AoXyn11AG21I和AoXyn11A分别在48和55℃及以下的残余酶活性大于85％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种耐热性能改善的木聚糖酶及其应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tccacaccca gtagcacggg ctataacaat ggctactact attccttctg gaccgacggc 60
aatggtgatg tgacttacac aaacggcaac ggcggttcat acagcgtgca atggtccaac 120
gtcggcaact tcgtcggcgg gaaaggatgg aaccccggaa gctctagagc aatcacctac 180
tccggaagct tcaaccccag cggaaacggc tacctagctg tgtacggctg gaccactgac 240
cccctgattg aatactacat cgtcgagtcg tacggcacat acaaccccgg cagcggcggc 300
acctacaagg gccaggttac ctccgacgga ggcacatata atatctatac ctctgttcga 360
accaatgcac catctatcat cgggacggcg acctttacgc agttttggtc tgtgaggact 420
tcgaagcgtg tgggtggcac ggtcactacg gggaatcatt tcaatgcgtg ggctaagtat 480
gggttgacct tggggacgca taattatcag attgtggcta cggaggggta tcagagtagt 540
gggtcttctg ctatcactgt ttatcatcat catcatcatc attga 585
<210> 2
<211> 194
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Ser Thr Pro Ser Ser Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ser Phe
1 5 10 15
Trp Thr Asp Gly Ile Gly Asp Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asn Gly Gly
20 25 30
Ser Tyr Ser Val Gln Trp Ser Asn Val Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys
35 40 45
Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ser Arg Ala Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Phe
50 55 60
Asn Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr Thr Asp
65 70 75 80
Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Thr Tyr Asn Pro
85 90 95
Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Gln Val Thr Ser Asp Gly Gly Thr
100 105 110
Tyr Asn Ile Tyr Thr Ser Val Arg Thr Asn Ala Pro Ser Ile Ile Gly
115 120 125
Thr Ala Thr Phe Thr Gln Phe Trp Ser Val Arg Thr Ser Lys Arg Val
130 135 140
Gly Gly Thr Val Thr Thr Gly Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Thr Leu Gly Thr His Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly
165 170 175
Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ile Thr Val Tyr His His His His
180 185 190
His His
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n is a, c, g or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> k is g or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> m is a or c
<400> 3
ttctggaccg acggcnnkgg tgatgtgact tac 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n is a, c, g or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> k is g or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> m is a or c
<400> 4
gtaagtcaca tcaccmnngc cgtcggtcca gaa 33

Claims (8)

1.一种耐热性改善的木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码木聚糖酶的基因，其特征在于，所述木聚糖酶如权利要求1所示。
3.根据权利要求2所述的一种编码木聚糖酶的基因，其特征在于，基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.携带权利要求2或3所述基因的载体或细胞。
5.一种获得权利要求1所述耐热性改善的木聚糖酶的方法，其特征在于，利用计算机技术与生物信息学方法对常温的木聚糖酶进行理性设计，将米曲霉木聚糖酶AoXyn11A中Gly21替换为异亮氨酸，运用基因工程的方法构建表达突变木聚糖酶的工程菌用于表达重组木聚糖酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：以pET-28a-Aoxyn11A为模板、设计引物，采用一步反向PCR介导的定点突变对Gly21密码子实施突变，将携带编码突变体的基因的pET-28a-Aoxyn11A转化E.coli BL21，构建突变转化子，以LB培养基为发酵培养基，以IPTG诱导编码突变体的基因的表达，收集菌体，破碎细胞，上清即为粗酶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将突变转化子于LB培养基中37℃、220r/min培养12h，以2％接种量转接相同的培养基，培养至OD600约为0.8时，加入0.5mmol/LIPTG、16℃诱导表达8h；离心收集菌体，用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液悬浮，反复冻融破碎细胞，上清作为粗酶液。
8.权利要求1所述木聚糖酶的应用，包括在食品、饲料、纺织和造纸领域的应用。
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