CN111117987A - 一种高比活酸性甘露聚糖酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质工程改造技术领域，具体提供了一种高比活甘露聚糖酶突变体。与野生型相比，本发明提供的甘露聚糖酶突变体的比活力普遍提高了4.4%‑38.97%。本发明所述甘露聚糖酶突变体比活力的提高，有利于降低甘露聚糖酶的生产成本，加快该酶在饲料领域中的广泛应用，市场前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及比活得到提高的酸性甘露聚糖酶突变体。
背景技术
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。β-甘露聚糖酶(β-mannanase EC3.2.1.78)是一种水解甘露聚糖的内切水解酶，以内切方式降解甘露糖主链β-l,4糖苷键，释放出短的β-l,4甘露寡糖。近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人们对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。β-甘露聚糖酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。但天然菌株所产的甘露聚糖酶产量低，不能满足工业化生产的需要。酶分子的比活性是衡量酶的性质的重要指标，具有高比活性的甘露聚糖酶在实际应用中具有更广阔的前景。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种甘露聚糖酶突变体。所述突变体蛋白的比活力得到显著提高，将大大降低甘露聚糖酶的生产成本，有利于该酶在饲料领域的广泛应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种甘露聚糖酶突变体，具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或（Ⅲ）所示的氨基酸序列中的任意一个：
(Ⅰ) 与甘露聚糖酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列；
(Ⅱ) 具有所述甘露聚糖酶的至少一个免疫表位，且所述甘露聚糖酶的氨基酸序列SEQID NO:1经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
（Ⅲ）由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中，所述甘露聚糖酶突变体是氨基酸序列SEQ ID NO:1的酶蛋白的第296位氨基酸被取代。
在本发明的一些实施例中，所述甘露聚糖酶突变体是氨基酸序列SEQ ID NO:1的酶蛋白的的第297位氨基酸被取代。
在本发明的一些实施例中，所述甘露聚糖酶突变体是氨基酸序列SEQ ID NO:1的酶蛋白的的第339位氨基酸被取代。
在本发明的一些实施例中，所述甘露聚糖酶突变体是氨基酸序列SEQ ID NO:1的酶蛋白的的第296位，第297位，第339位氨基酸中的任意两个氨基酸同时被取代。
在本发明的一些实施例中，所述甘露聚糖酶突变体是氨基酸序列SEQ ID NO:1的酶蛋白的的第296位，第297位和第339位氨基酸同时被取代。
在优选实施例中，所述甘露聚糖酶突变体的第296位氨基酸由Val突变为Ile。
在优选实施例中，所述甘露聚糖酶突变体的第297位氨基酸由Thr突变为Tyr。
在优选实施例中，所述甘露聚糖酶突变体的第339位氨基酸由Asn突变为Tyr或Phe。
在本发明的一些实施例中，甘露聚糖酶突变体具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:17或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
本发明还提供了编码上述的甘露聚糖酶突变体的DNA分子。
在本发明的一些实施例中，编码上述的甘露聚糖酶突变体的DNA分子具有如SEQID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
本发明还提拱了具有上述DNA分子的载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
所述宿主细胞优选毕赤酵母（Pichia pastoris）。
所述宿主细胞优选里氏木霉（Trichoderma reesei）。
所述宿主细胞优选黑曲霉（Aspergillus niger）。
将上述的重组表达载体转入所述宿主细胞中，重组表达的甘露聚糖酶突变体的比活力得到显著提升
与野生型甘露聚糖酶M20相比，本发明提供的甘露聚糖酶突变体的比活力普遍提高了4.4%-38.97%。其中，含V296I/T297Y/N339F三点突变的甘露聚糖酶突变体M20-8的比活力最高，达888.6 U/mg，比野生型甘露聚糖酶提高了40%，取得了意料不到的技术效果。本发明所述甘露聚糖酶突变体比活力的提高，有利于降低甘露聚糖酶的生产成本，加快该酶在饲料领域中的广泛应用，市场前景广阔。
具体实施方式
本发明现在将通过参考的方式、仅仅使用下面给出的定义和实施例进行详细描述。除非在此处另外定义，所有此处使用的技术和科学术语都和本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的术语意义相同。Singleton等所著的由纽约John Wiley and Sons于1994年出版的 DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY第二版，以及由Hale和Marham所著，由纽约Harper Perennial于1991年出版的THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY，向技术人员提供用于本发明中的许多术语的综合词典。尽管与此处的描述相似或等价的任何材料和方法可以在本发明的实际应用和试验中使用，本发明还是描述了优选的方法和材料。数字范围包括了界定范围的数字。除非另外指出，分别地，核酸按照5′到3′的方向从左到右写出；氨基酸序列按照从氨基到羧基的方向从左到右写出。特别地，从业者可以参照Sambrook等，1989和Ausubel FM等，1993来理解本领域的定义和术语。应该理解，本发明不局限于所描述的具体方法学、方案和试剂，因为这些是可以改变的。
此处提供的标题并不是对本发明多个方面和实施方案的限制，通过参考作为整体的说明书可以知晓本发明各个方面和实施方案。因此，接下来定义的术语是通过参考作为整体的说明书而被更完整地定义出来。
正如此处所用的，术语“表达(expression)”，指的是基于基因的核酸序列产生出多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
如此处所用的，术语“基因(gene)”，指的是参与多肽链产生的DNA片段，它可以包含或者也可以不包含编码区域之前或者之后的区域。
如此处使用的，术语“酶(enzyme)”指的是催化化学反应的蛋白质或多肽。
如此处使用的，术语“活性(activity)”指的是与特定蛋白相关的生物活性，比如与蛋白酶相关的酶活性。生物活性指的是本领域技术人员一般将其归属于该蛋白质的任何活性。
如此处使用的，术语“甘露聚糖酶(Mannase)”指的是能够水解含β－l，4一甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等）的水解内切酶。
如此处使用的，术语“点突变(point mutations)”指的是DNA中单核苷酸的改变，尤其是在这个改变将会导致蛋白质的改变的情况下。
如此处使用的，术语“突变体(mutant)”指的是生物体或蛋白不同于野生型的类型。这种改变可通过本领域技术人员所熟知的方法加以实现，例如，通过点突变，其中得到的蛋白质就可以被称为突变体。
如此处使用的，术语“修饰的（modified）”，指的是一个序列，诸如包含多肽的氨基酸序列，其包括对自然发生序列的删除、插入、替换或截断。
如此处使用的，术语“取代的（substituted）”，指的将是对自然发生残基的替换。
如此处使用的，术语“比活力 (Specific Activity)”，指的是单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。
本发明具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
生化试剂：G418购自 Invitrogen公司；IPTG、X-Gal、SDS及角豆胶购自Sigma公司；TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺为国药试剂。
培养基配方：
大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0)；
LB-AMP培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；
酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物、2%蛋白胨2%葡萄糖；
酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨、2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 生物素，0.5%甲醇。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1 野生型酸性甘露聚糖酶基因的扩增
以黑曲霉（Aspergillus niger）基因组为模板进行PCR扩增，PCR引物M20-F1、M20-R1如下所示：
M20-F1：GCTGAATTCGGCCTCCAATTCACCATTGATGGCG（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）
M20-R1：CTGGCGGCCGCTTAGGCGCTATCAATAGCAG（下划线为限制性内切酶NotI识别位点）
胶回收PCR产物，连接pEASY-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中，挑取正确的转化子进行测序。测序结果显示，扩增得到的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。通过NCBI BLAST比对发现，SEQ ID NO：1与来源于黑曲霉的酸性甘露聚糖酶序列相似性高达100%，从而确定通过PCR获得的基因为酸性甘露聚糖酶基因，命名为M20。
实施例2 重组表达野生型酸性甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株的构建
将实施例1中所述酸性甘露聚糖酶M20基因，通过EcoRI和Not I位点与表达载体pPIC9K相连接，构建得到表达载体pPIC9K-M20。
将表达载体pPIC9K-M20用Sal I进行线性化，表达质粒线性化片段通过电穿孔法转化宿主细胞毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-M20，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
将筛选得到的重组表达酸性甘露聚糖酶M20的阳性转化子命名为毕赤酵母M20（Pichia pastoris M20），转接于BMGY培养基中，30℃、250 rpm振荡培养1 d；再转入BMMY培养基中，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；离心去除菌体，得到含酸性甘露聚糖酶的发酵上清液，分别进行SDS-PAGE电泳检测分析和酶活检测。结果显示，所述发酵上清液中酸性甘露聚糖酶的分子量大小约为39.3kDa，与其理论分子量大小一致。
1、甘露聚糖酶活力检测
（1）甘露聚糖酶酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为3mg/ml的甘露聚糖溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。
（2）酶活测定方法
（2.1）标准曲线的绘制：
吸取乙酸—乙酸钠缓冲溶液4.0ml，加入DNS试剂5.0ml，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至25.0ml，制成标准空白样。
分别吸取甘露糖溶液（5.5）1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00和7.00ml，分别用乙酸—乙酸钠缓冲溶液定容至100ml，配制成浓度为0.10—0.70mg/ml D-甘露糖标准溶液。
分别吸取上述浓度系列的甘露糖标准溶液各2.00ml（做二个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml乙酸—乙酸钠缓冲溶液和5mlDNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25ml。以标准空白样为对照调零，在540nm处测定吸光度OD值。
以甘露糖浓度为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
（2.2）酶活力测定：
吸取10.0ml甘露聚糖溶液，37℃平衡10min。
吸取10.0ml经过适当稀释的酶液，37℃平衡10min。
吸取2.00ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入5mlDNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2.0ml甘露聚糖溶液，37℃保温30min，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A B。
吸取2.0ml经过适当稀释的酶液（已经过37℃平衡），加入到刻度试管中，再加入2.0ml甘露聚糖溶液（已经过37℃平衡），电磁振荡3s，37℃精确保温30min。加入5.0mlDNS试剂，电磁振荡3s，酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25ml，电磁振荡3s。以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光度A E。
酶活计算公式：
XD=
式中：XD为稀释酶液中甘露聚糖酶的活力，U/ml；A E为酶反应液的吸光度；A B为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2 g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1 mmol=1000 μmol。
（3）酶活测定结果
按照上述方法检测毕赤酵母M20的发酵上清液中酸性甘露聚糖酶酶活。结果显示：毕赤酵母M20发酵上清液的酶活为211 U/ml。
2、蛋白含量测定
（1）蛋白含量测定方法：
考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量是比色法与色素法结合的复合方法。考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。
按照酶液和考马斯亮蓝溶液体积比1：5的比例进行混合，静置10mim，考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量
（2）蛋白含量测定结果
按照上述方法检测毕赤酵母M20的发酵上清液中酸性甘露聚糖酶蛋白含量。结果显示：毕赤酵母M20发酵上清液的蛋白含量为0.33mg/mL。
3、比活力
（1）比活力定义：
“比活力 (Specific Activity) ”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。
比活力计算公式：比活力（U/mg）=酶活（U/mL）/ 蛋白含量（mg/mL）；
（2）比活力计算：
按照上述公式计算毕赤酵母M20发酵上清液中酸性甘露聚糖酶的比活力为639.4 U/mg。
实施例3 高比活酸性甘露聚糖酶突变体的筛选
为了进一步提高酸性甘露聚糖酶M20的比活力，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选。
以M20基因为模板，利用实施例1中所述引物M20-F1、M20-R1，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃ 220 rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有酸性甘露聚糖酶的大肠杆菌细胞裂解液。
取两块新的96孔板，每个孔中各加入30 ul裂解液；然后将其中一块96孔板的每个孔中各加入30 ul底物，于37℃反应30 min后，DNS法测定生成的还原糖，另一块96孔板的每个孔中各加入150ul考马斯亮蓝溶液，静置10min，考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量，分别计算不同突变子的酶活水平及蛋白含量。
最终，申请人从两万多个转化子中筛选出显著提高酸性甘露聚糖酶M20比活力的突变位点：V296I，T297Y，N339Y，N339F。
将含V296I点突变的酸性甘露聚糖酶突变体，命名为M20-1，其氨基酸序列为SEQID NO：3，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4；
将含T297Y点突变的酸性甘露聚糖酶突变体，命名为M20-2，其氨基酸序列为SEQ IDNO：5，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
将含N339F点突变的酸性甘露聚糖酶突变体，命名为M20-3，其氨基酸序列为SEQID NO：7，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：8；
将含N339Y点突变的酸性甘露聚糖酶突变体，命名为M20-4，其氨基酸序列为SEQ IDNO：9，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：10；
将含V296I和T297Y两点突变的酸性甘露聚糖酶突变体命名为M20-5，其氨基酸序列为SEQ ID NO：11，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：12。
将含T297Y和N339F两点突变的酸性甘露聚糖酶突变体命名为M20-6，其氨基酸序列为SEQ ID NO：13，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：14。
将含T297Y和N339Y两点突变的酸性甘露聚糖酶突变体命名为M20-7，其氨基酸序列为SEQ ID NO：15，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：16。
将含V296I、T297Y和N339F三点突变的酸性甘露聚糖酶突变体命名为M20-8，其氨基酸序列为SEQ ID NO：17，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：18。
将含V296I、T297Y和N339Y三点突变的酸性甘露聚糖酶突变体命名为M20-9，其氨基酸序列为SEQ ID NO：19，参照该序列得到一个编码核苷酸序列为SEQ ID NO：20。
上述酸性甘露聚糖酶突变体的核苷酸序列由上海捷瑞生物公司合成。
实施例4 重组表达甘露聚糖酶突变体的毕赤酵母工程菌株的构建
参照实施例2中所述方法分别构建重组表达上述甘露聚糖酶突变体M20-1、M20-2、M20-3、M20-4、M20-5、M20-6、M20-7、M20-8、M20-9的毕赤酵母工程菌株，分别命名为毕赤酵母M20.1（Pichia pastoris M20.1），毕赤酵母M20.2（Pichia pastoris M20.2）毕赤酵母M20.3（Pichia pastoris M20.3）毕赤酵母M20.4（Pichia pastoris M20.4）毕赤酵母M20.5（Pichia pastoris M20.5）毕赤酵母M20.6（Pichia pastoris M20.6）毕赤酵母M20.7（Pichia pastoris M20.7），毕赤酵母M20.8（Pichia pastoris M20.8）和毕赤酵母M20.9（Pichia pastoris M20.9）。
将上述毕赤酵母工程菌株分别转接于BMGY培养基中，30℃、250 rpm振荡培养1 d；再转入BMMY培养基中，30℃、250 rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；离心去除菌体，得到含所述甘露聚糖酶突变体的发酵上清液，分别对其进行酶活检测和蛋白含量检测，计算比活力。结果如表1所示。
表1 甘露聚糖酶突变体比活力比较
| 突变体 | 突变位点及组合 | 酶活(U/mL) | 蛋白含量（mg/mL） | 比活力（U/mg） |
| M20 | - | 211 | 0.33 | 639.3 |
| M20-1 | V296I | 207 | 0.31 | 667.7 |
| M20-2 | T297Y | 235 | 0.32 | 734.3 |
| M20-3 | N339F | 221 | 0.3 | 736.6 |
| M20-4 | N339Y | 230 | 0.33 | 696.9 |
| M20-5 | V296I/T297Y | 271 | 0.34 | 797.0 |
| M20-6 | T297Y/N339F | 267 | 0.34 | 785.3 |
| M20-7 | T297Y/N339Y | 269 | 0.35 | 768.6 |
| M20-8 | V296I/T297Y/N339F | 311 | 0.35 | 888.6 |
| M20-9 | V296I/T297Y/N339Y | 301 | 0.36 | 836.1 |
从表1的结果可以看出，与野生型甘露聚糖酶M20相比，本发明提供的甘露聚糖酶突变体的比活力普遍提高了4.4%-38.97%。其中，含V296I/T297Y/N339F三点突变的甘露聚糖酶突变体M20-8的比活力最高，达888.6 U/mg，比野生型甘露聚糖酶提高了40%，取得了意料不到的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种高比活酸性甘露聚糖酶突变体
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 362
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 1
Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser Ser Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gln Phe Thr Ile Asp Gly Glu
20 25 30
Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp Ile Gly Phe Leu Thr
35 40 45
Asp Asn Ala Asp Val Asp Leu Val Met Gly His Leu Lys Ser Ser Gly
50 55 60
Leu Lys Ile Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp Val Thr Ser Gln Pro
65 70 75 80
Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gln Leu His Gln Asp Gly Lys Ser Thr
85 90 95
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100 105 110
Ser Ala Glu Gln His Asp Ile Lys Leu Ile Ile Asn Phe Val Asn Tyr
115 120 125
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130 135 140
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210 215 220
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225 230 235 240
Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr
245 250 255
Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn
260 265 270
Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro
275 280 285
Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Val Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu
290 295 300
Gly Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp
305 310 315 320
Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp
325 330 335
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340 345 350
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355 360
<210> 2
<211> 1089
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 2
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ctcatcatca acttcgtcaa ctactggacc gattacggtg gtatgtctgc gtacgtgagc 420
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cagacatata tcaagacggt cgtggagcgg tacagtaact cctcggcggt gtttgcgtgg 540
gagttggcga atgagccgag atgtccgagt tgcgatactt ctgtgttgta taactggatt 600
gagaagacga gtaagtttat taaggggttg gatgcggatc gtatggtttg tattggtgat 660
gagggcttcg gtctcaacat cgactcggac ggcagctacc cttatcaatt ctccgagggc 720
ttgaacttta cgatgaacct cggtatcgat actattgact ttggtaccct ccacttgtac 780
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<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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20 25 30
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35 40 45
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Asn Phe Thr Met Asn Leu Gly Ile Asp Thr Ile Asp Phe Gly Thr
245 250 255
Leu His Leu Tyr Pro Asp Ser Trp Gly Thr Ser Asp Asp Trp Gly Asn
260 265 270
Gly Trp Ile Thr Ala His Gly Ala Ala Cys Lys Ala Ala Gly Lys Pro
275 280 285
Cys Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Ile Thr Ser Asn His Cys Ser Val Glu
290 295 300
Gly Ser Trp Gln Lys Thr Ala Leu Ser Thr Thr Gly Val Gly Ala Asp
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Leu Phe Trp Gln Tyr Gly Asp Asp Leu Ser Thr Gly Lys Ser Pro Asp
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 6
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<400> 8
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tcctccggca cagtctggta ccaactgcac caggacggca aatcgacaat caacacgggt 300
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<400> 19
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agcgcctaa 1089
Claims (10)
1.一种甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述的甘露聚糖酶突变体具有(Ⅰ)或(Ⅱ)所示的氨基酸序列中的任意一个：
(Ⅰ) 与甘露聚糖酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列；
(Ⅱ) 具有所述甘露聚糖酶的至少一个免疫表位，且所述甘露聚糖酶的氨基酸序列SEQID NO:1经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述的取代为取代1个，2个或3个氨基酸。
2.如权利要求1所述的甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述的取代为第296位，第297位，第339位中的任意一个或两个或三个氨基酸被取代。
3.如权利要求2所述的甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述的取代为第296位氨基酸由Val突变为Ile。
4.如权利要求2所述的甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述的取代为第297位氨基酸由Thr突变为Tyr。
5.如权利要求2所述的甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述的取代为第339位氨基酸由Asn突变为Tyr或Phe。
6.如权利要求1或2所述的甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述甘露聚糖酶突变体具有如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
7.一种DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子编码权利要求1-6中任一项所述的甘露聚糖酶突变体。
8.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求7所述的DNA分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞携带有权利要求8所述的重组表达载体。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris），里氏木霉（Trichoderma reesei）或黑曲霉（Aspergillus niger）中的任意一种。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| CN201811292118.0A CN111117987B (zh) | 2018-11-01 | 2018-11-01 | 一种高比活酸性甘露聚糖酶突变体 |
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