CN109207459B

CN109207459B - 一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变体

Info

Publication number: CN109207459B
Application number: CN201811408686.2A
Authority: CN
Inventors: 林娟; 苏冰梅; 许鑫琦; 鄢仁祥
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2038-11-23
Also published as: CN109207459A

Abstract

本发明提供一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变体，属于基因工程与酶工程领域。本发明突变体是在SEQ ID NO.2所示的β‑琼胶酶rAgaZC‑1的氨基酸基础上，将第602位天冬氨酸突变为甘氨酸（D602G），突变体D602G核苷酸序列及对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。D602G的催化效率较于rAgaZC‑1有17.6%的提高。热失活动力学和水解动力学分析表明，D602G的热稳定性明显提高，T ₅₀ ¹⁰提高1.5℃，41℃下的半衰期t _1/2延长3倍，且在43℃下可以积累更多的琼胶寡糖，提高了琼胶酶在降解琼脂糖制备琼胶寡糖上的应用潜力。

Description

一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变体

技术领域

本发明涉及一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变体，属于基因工程与酶工程领域。

背景技术

琼脂糖(Agarose)是琼胶的主要组成成分，为β-D-半乳糖(Gal)和α-3,6-内醚-L-半乳糖(ALGal)交替连接形成的链状结构。琼胶酶(Agarase)是专性降解琼脂糖产生琼胶寡糖的一类糖苷水解酶(Glucoside Hydrolase，GH)，绝大部分来源于海洋微生物，主要为革兰氏阴性菌，包括交替单胞菌属、假交替单胞菌属、产微球茎菌属、噬琼胶菌属等。

琼脂糖在溶胶—凝胶转换温度以上时，呈溶胶态。由于溶胶态的琼脂糖相对于凝胶态具有更小的比表面积和流动限制，所以其对琼胶酶具有更好的亲和性，也就是说琼胶酶对溶胶态的琼脂糖的水解活性更强。然而从自然界中筛选的琼胶酶在剧烈的工业条件中(如高温)通常不稳定，这限制了琼胶酶的应用。定点突变作为分子改造的一种有效方式，被广泛应用于提高工业酶制剂的催化效率、改善酶性质等方面。

在前期研究中，已获得的琼胶酶rAgaZC-1的最适温度为38.5℃，在35～41.5℃之间，酶活力保持在70％以上；最适pH为pH6.0，在pH6～7范围内酶活力保持在80％以上。在40℃以下酶活力基本保持稳定，但是当温度超过40℃迅速失活。而琼胶酶在琼胶寡糖制备中的应用往往需要较高温度才能使琼脂糖处于溶胶状态，这明显与原始酶rAgaZC-1的热稳定性不相符，需要通过分子改造的方法提高热稳定性。

本发明在琼胶酶rAgaZC-1的表面，同时也是保守(α/β)₈桶状折叠区中选择突变位点，通过定点突变的方法对rAgaZC-1进行分子改造，得到催化效率略有提高，稳定性明显提高的突变体D602G，对于提高琼胶酶在琼胶寡糖制备上的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变体及其应用。

为实现上述目的采用以下技术方案：

本发明提供一种来源于Vibrio sp.的琼胶酶rAgaZC-1基因及其编码的氨基酸序列。原始酶rAgaZC-1的核苷酸序列及对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的β-琼胶酶rAgaZC-1的氨基酸基础上，将第602位天冬氨酸突变为甘氨酸(D602G)。突变体D602G的核苷酸序列及对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明提供上述原始酶和突变体的重组载体及工程菌株。

本发明通过比较突变前后的琼胶酶对琼脂糖的水解动力学，分析原始酶和突变体的应用潜力。

所述的琼胶酶突变体在制备琼胶寡糖上的应用。

本发明的优点在于：

本发明以前期构建的琼胶酶rAgaZC-1表达载体pET22b-agaZC-1为模板，利用重叠延伸PCR技术进行突变体D602G的构建，实现rAgaZC-1和D602G在E.coli BL21(DE3)中的过表达并纯化。对突变前后的酶学性质、催化动力学、热失活动力学进行比较，发现两者的最适温度和最适pH相同，D602G的催化效率提高17.6％，T₅₀ ¹⁰提高1.5℃，41℃下的半衰期提高3倍。说明突变后，D602G在催化效率略有提升的基础上明显提高了其热稳定性。

将突变前后的琼胶酶进行琼脂糖的水解动力学分析，对比发现，突变体D602G在水解过程中具有较低的表观失活常数和微观失活常数，最终积累的琼胶寡糖为rAgaZC-1的1.33倍。

附图说明

图1为琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的表达质粒图谱。

图2-A为琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G纯化后的SDS-PAGE分析；

M、1和2分别代表蛋白标准品、纯化后的rAgaZC-1和D602G。

图2-B为琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的最适反应pH。

图2-C为琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的最适反应温度。

图2-D为琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的温度稳定性。

图2-E为琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的荧光发射光谱。

图3为琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的热失活速率曲线。

图4为43℃下琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的水解动力学。(A)水解曲线；(B)ln(([P]_∞-[P]_t)/[P]_∞)–时间曲线；(C)1/[P]_∞-1/[S]曲线。

具体实施方式

实施例1琼胶酶突变体D602G的构建

利用重叠延伸PCR技术来扩增突变体的基因序列。首先设计简并引物，扩增来源Vibiro sp.的琼胶酶rAgaZC-1基因的保守序列，利用TAIL-PCR方法克隆得到琼胶酶基因agaZC-1全长序列(序列如SEQ ID NO.1所示)；构建重组质粒pET-22b-agaZC-1。以构建的重组质粒pET-22b-agaZC-1为模板进行第一轮PCR扩增，以agaZC-1-F，D602G-R为引物扩增目的基因的上游片段，以agaZC-1-R，D602G-F为引物扩增目的基因的下游片段；再将纯化后的上下游片段混合并适当稀释作为第二轮PCR的模板，以agaZC-1-F，agaZC-1-R为引物扩增目的基因。各引物信息如下所示，其中带有下划线的碱基为限制性核酸内切酶的酶切位点，带有双下划线的碱基为定点突变的位点。

agaZC-1-F:ATAGGATCCACAACATACTAAAGCGCCAGAAACA

agaZC-1-R:GCACTCGAGTTTATTTAGAAAAACGTTGTTGATATAAG

PCR扩增体系：

FastPfu PCR SuperMix 10μL，引物各1μL，模板1μL，ddH₂O补至20μL。

PCR扩增条件：94℃预变性6min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min(第一轮PCR，第二轮PCR延伸2min)，30个循环；72℃保温3min；10℃保存。

用BamHI和XhoI将纯化的第二轮PCR产物和载体pET-22b进行双酶切，双酶切体系为：pET-22b/突变基因20μL，BamHI 2μL，XhoI 2μL，10×Fastdigest green buffer 5μL，ddH₂O补足至50μL，于37℃反应2h。

将产物割胶回收后用T₄ DNA ligase将目的片段和载体连接。连接体系为：双酶切后的突变基因6μL，双酶切后的pET-22b 3μL，5×T₄DNA ligase Buffer2μL，ddH₂O补足至20μL，于4℃反应过夜。

将连接产物转化入E.coli Top10，挑取阳性克隆进行序列测定，确证序列无误后提取质粒并转化入E.coli BL21(DE3)中。突变体核苷酸序列测序结果见序列表中SEQ IDNO.3所示，相应编码蛋白质氨基酸序列见序列表中SEQ ID NO.4所示。琼胶酶rAgaZC-1和突变体D602G的表达质粒图谱如图1所示。

实施例2琼胶酶的诱导表达及纯化

分别将表达rAgaZC-1和突变酶D602G的工程菌接入含100mg/LAmp的LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养，再以1％接种量转接至相同的培养基中，继续培养至OD600约0.6后添加终浓度为1mM的IPTG，28℃、180rpm继续培养8h。

将发酵液在4℃，12000rpm下离心10min，取上清液先后利用中空纤维柱(MWCO:10kDa)和硫酸铵沉淀浓缩酶液，将浓缩的酶液于pH7.6的Tris-HCl缓冲液中透析除掉硫酸铵，经0.22μm膜过滤后再利用NTA-Ni柱(BBI，China)进行目的蛋白的纯化。将收集的酶液适当浓缩后进行SDS-PAGE，结果如图2-A所示，突变前后的琼胶酶经纯化得到电泳纯的组分，且条带位置约为105kDa，与酶的理论分子量(104.73kDa)一致，说明琼胶酶已得到纯化。琼胶酶的蛋白浓度用BCA试剂盒测定。

实施例3琼胶酶的性质表征

1.琼胶酶的酶活测定

采用DNS法测定琼胶酶的活力。将100μL酶液加入900μL含0.2％琼胶的50mM Tris-HCl(pH7)溶液中，并在40℃水浴中反应15min，加入1.5mL DNS试剂终止反应。在沸水中显色5min后冷却至室温，摇匀并测定OD₅₄₀。依照葡萄糖标准曲线测定释放的还原糖含量。酶活力单位定义：在一定反应条件下，每min水解琼脂糖产生1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位U。

2.琼胶酶的催化动力学

在38.5℃下，测定纯酶在不同底物浓度(0.1～0.5g/L)时的酶活力，利用Lineweaver-Burk plot测定纯酶催化琼胶底物水解反应的K_m、V_max、k_cat。

结果如表1所示，突变前后的K_m几乎不变，但是V_max和k_cat略有提升，导致催化效率(k_cat/K_m)提高17.6％。说明Asp602位点的突变对于亲和力影响不大，但是能提高琼胶酶的转换数，导致突变体的催化效率有所提高。

表1琼胶酶rAgaZC-1及突变体D602G的催化动力学参数

Agarase	k<sub>m</sub>(mg·mL<sup>-1</sup>)	V<sub>m</sub>(U·mg<sup>-1</sup>)	k<sub>cat</sub>(min<sup>-1</sup>)	k<sub>cat</sub>/K<sub>m</sub>(mL·mg<sup>-1</sup>·min<sup>-1</sup>)
					D602G	0.94	36.12	3783.11	3997.94
rAgaZC-1	0.98	31.72	3322.65	3401.48

3.pH及温度对酶活的影响

最适反应pH的测定：在40℃条件下，于不同pH值(pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的底物中测定纯酶的活力，确定其最适反应pH。

最适反应温度的测定：在pH7.0的条件下，于不同温度(30℃、35℃、38.5℃、40℃、41.5℃、45℃、50℃)下测定纯酶的活力，确定其最适反应温度。

pH对rAgaZC-1和D602G酶活力的影响如图2-B所示，可以看出两者的最适反应pH均为6，且总体变化趋势基本相似。在pH 6～7范围内均保持80％以上的酶活性；pH小于5或者大于7，酶活迅速下降，说明D602突变为甘氨酸对酶的最适反应pH影响不大。

温度对rAgaZC-1和D602G酶活力的影响如图2-C所示。可以看出二者的最适反应温度都约为38.5℃，但rAgaZC-1在35℃到45℃之间随着温度的升高，酶活降低的幅度比D602G大，说明D602位点突变导致酶对温度的敏感性下降。

4.琼胶酶的热稳定性

将纯酶置于不同温度(30～50℃)下孵育10min后，冰浴5min，常温放置5min，以未处理的酶液为对照，测定残留酶活，计算半失活温度T₅₀ ¹⁰，用来表征酶的热稳定性。两者的热稳定性如图2-D所示。rAgaZC-1和D602G在40℃以下酶活基本保持稳定；当温度超过40℃，相对酶活开始下降，但D602G下降趋势与rAgaZC-1相比相对缓和，通过计算可以得到，rAgaZC-1的T₅₀ ¹⁰为42.5℃，突变酶D602G的T₅₀ ¹⁰为44℃，比原始酶提高了1.5℃，说明D602位点的突变使酶的热稳定性提高了。

5.琼胶酶的荧光发射光谱

用Tris-HCL缓冲液(50mM，pH6.0)将纯酶浓度调节至1mg/mL。取3mL酶液分别置于45℃和60℃下孵育1h，冰浴10min，再室温静置10min，然后检测其300～500nm的荧光发射光谱，激发光波长设为280nm。rAgaZC-1和D602G的荧光发射光谱如图2-E所示，可以看出，突变酶和原始酶的峰形有所不同，原始酶的最大吸收波长为348nm，突变酶的最大吸收波长为320nm，说明突变酶在局部构象上可能发生了变化，从而导致了一些荧光基团的暴露情况发生改变。而当温度从45℃提高至60℃时，原始酶内源荧光发射峰强度出现较为明显的下降，而突变酶只有略微的下降，说明突变酶结构对温度的敏感性更低，使得在受到热处理后结构受到的破坏程度相比原始酶低。

实施例4琼胶酶的热失活动力学

将纯酶置于不同温度(41℃、43℃、44℃、45℃)下保温不同时间，在冰上放置5min，常温放置5min，测定相对酶活(RA)的变化情况，绘制热失活速率曲线，拟合ln(RA)-t方程，斜率即为热失活速率k_d，再根据Eyring和Arrhenius的理论，依照公式1～5，求得纯酶在不同温度下的半衰期t_1/2、热失活活化能E_d、热失活的焓变△H、自由能△G和活化熵变△S等参数。其中k_B为玻尔兹曼常数，取1.38×10^-23J/K；h为普朗克常数，取6.63×10^-34J/s；R为摩尔气体常数，取8.314J/(mol·K)。

ΔH＝E_d-RT (3)

TΔS＝ΔH-ΔG (5)

rAgaZC-1和D602G在各温度下的热失活速率曲线如图3所示，可见其热失活反应遵循一级动力学，根据热失活速率曲线和Eyring和Arrhenius进一步求出热反应失活速率常数k_d，半衰期t_1/2，E_d、△H、△G、△S等参数如表2所示。可以看出，rAgaZC-1和D602G的热失活速率常数k_d都随着温度升高而增大，即温度越高，酶的稳定性越差；而在相同温度下，突变酶D602G的热失活速率常数总是小于rAgaZC-1。从半衰期t_1/2的数值可以直观地看出，突变酶D602G在41℃(314K)条件下半衰期为289.66min，是rAgaZC-1的4.2倍，而在酶极其不稳定的45℃(318K)条件下，突变酶D602G的半衰期(6.29min)也比rAgaZC-1提高了1倍以上。rAgaZC-1的热失活活化能E_d为725.887KJ/mol，小于突变酶D602G的909.344KJ/mol，说明D602G需要更大的能量才能进入热失活的状态。△G代表了酶从蛋白的解折叠中间过渡态到蛋白的解折叠状态的自由能大小。在各个温度下，突变酶D602G的△G都比rAgaZC-1大，在314K下，D602G和rAgaZC-1的△G差值达到了3.777KJ/mol，说明了该突变体在解折叠过程中有更高的能量壁垒，即有更好的稳定性。

表2琼胶酶rAgaZC-1及突变体D602G的热失活动力学参数

实施例5琼胶酶对琼脂糖的水解动力学

为了确定微观速率常数，参照Tsou的方法对琼胶酶的水解动力学进行研究。将酶液添加到不同浓度的琼脂糖底物中，在43℃下孵育不同时间后用DNS法检测产物含量。当时间足够长，产物含量将趋于一个稳定值[P]_∞。[P]_∞与底物浓度[S]符合公式6，其中k、k’分别表示酶的自由态和底物结合态的微观失活速率常数，通过双倒数法确定的K_m及V_max就能得出k/k’的值。

孵育时间t与ln([P]_∞-[P]_t/[P]_∞)符合公式7，所以表观失活常数A可以通过拟合得到。

k与k’可以根据k/k’的值及公式8求出。

琼胶酶的水解动力学曲线如图4(A)所示，可以看出43℃条件下，rAgaZC-1和D602G水解琼脂糖时分别在20min和40min以内产物累积趋于稳定，可以认为酶已完全变性。但是随着底物浓度的增加，变性时间有所延长，说明底物的存在对于稳定酶的结构具有保护作用。半对数曲线如图4(B、C)所示，符合一级反应动力学。通过求解，表观失活常数A和微观失活常数k、k’如表3所示。可以看出D602G的A、k、k’都比rAgaZC-1的小，说明Asp602位点的突变也提高了底物对酶的保护作用，使其在较高温度下能够维持较高的酶活力，最终累积更多的琼胶寡糖。

表3琼胶酶rAgaZC-1及突变体D602G的微观热失活速率常数

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变体

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2790

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caacatacta aagcgccaga aacacaaaca gttgatggcg ataatatccc tgtttcactt 60

cctgactttg aatcggattc cttttttaac aatgttgccg tttctcatgc caaagtagaa 120

aaaattaatg gagtaggtgt aaccgcaggt tcaaatgctt taaaaattag ttttgatgaa 180

gtctctgaag ctaataaatt taagttttgg cctaatataa aaatagtgcc taatgaaggt 240

atttggaatt ggaactccaa aggtagtttt aaggttgatg taacaaaccc aagtgatagc 300

tcagcaaata ttatatttaa agttgtagat aatattggct caatgggagc gcaaactaac 360

cagttaaatt atgctgtcag tattcctgca ggtgaaacgg aaactgtcga aatgttattt 420

aacggtggaa agcgaaaatt aaataactat tgggatgggg atcaactaga tttacggaaa 480

ttagttgaat tgcaagtgtt tgttcaaggt ccaatggacg cacaaacggc agtacttgat 540

aattttgagt taatcgatgc aacaggtgac tttatttcgg ccaaagaaca agttattgat 600

gttggcccag tacctacagt gaaagtcatt actgattttg atagtggtga agcgagttac 660

atctctgagc gcagtgtatc aaccagtgtt aaaacagtag atacagcgga ggggcaagga 720

atagaggtgc gatattcatc agagaatgcg tatccaaacc ttacattagc accaacagat 780

aaatgggatt ggtcgaaaga acaagatttt aacctggcat ttgatattga aaatccgact 840

aacgaaccta ttcaaatgtt tgttcgtgtc gatcaggctg aagataaaaa ctggggtggg 900

acagcggatg gtgtgacaga tagtatgtcg gcctatatga ccctcgcgcc acaagaaatg 960

aatacctact atatgtcatt gtcccaattg agcggtaagt tagtctctgg tatgggaagc 1020

gagccaccaa aaaaatctta taatgctcaa aaaattagtt atgggtgggg tgaaacagag 1080

ttagatctct ctaatatcaa atcaattcag ttgtatctac aaaatccaac aaaagacact 1140

cgtattatat tagattctgt tcgtctaatt cctaatttag atgcagacgc tactcgatat 1200

gcaggtctcg ttgatgaatt tggtcagtca actcatgcag actggcccga gaaaattgat 1260

tcgattgatg aattacaagc acaaggtaaa aaggacttag aaagtcttaa aacggttcaa 1320

ccattaccag accgtagtac attcggtggt tggaaggatg gaccaaaatt agacgcgaca 1380

ggttttttcc gcacagaaaa agttgatggg caatggtcat tagtcgatcc agaagggtat 1440

ttattcttta tgacgggcct tgataacgta cgtatggatg acactgtaac catcacggga 1500

gttgattatg aaaaccctga cgaacgtagt ggccgatcta ttccatctgg acttcgtaat 1560

tcaatgttta cttggttgcc ggaagatgat gatccgctag ccagcaatta cgactatgca 1620

acctatgtgc attccggagc tcttaaaaag ggagaagttt ttagctttta tcgcgcgaat 1680

ttaatgcgta aatatgatac ttcgaaagaa gaggcaatga aaatatggaa agatgtcacg 1740

ttagagcgaa tgcaagaatg ggggttcact acattaggta actggattga cccaatgttt 1800

tatgacaatg gaaaagtggc atatgaagct catggttgga ttgctggtga tcatcaaaga 1860

attagcactg gtaatgatta ttggggacct attcatgatc catttgaccc taaattccaa 1920

gaaagtactc gtaaaatggc agagcgagtt gcaagtaaag tcagtgataa tgacccttgg 1980

ttagttggga ctttcgtcga caatgaaatc agttggggaa atgtgatgaa tgaagccaac 2040

cattatggat taatcatcaa tgcattaagt tatgatgctg aaaaaagctc agctaaacaa 2100

tcgtttacga ctcatttaaa atccaaatat aaaataatca cagctttaaa taaagcatgg 2160

ggaaccaagg ttgggtcatg gggtgagttt gaaaaatctt tcgattatag agaaaaatta 2220

aaacctggta tgaaagccga ttattctgaa cttttacaaa tgttaggtga gcaatacttc 2280

tctattgtgc gaaaggagat caaaagggtt ttacctaatc acttatactt aggcgcacgt 2340

ttttctgatt gggggctgac tccagaaata gcccgagcag cagcaaaaca tgttgatgtg 2400

atgagttata acctttatgc caacgatatt acagatgaga aaaaggcaca tttccaacat 2460

ttcttagctg aattggatat gcctagcatg attggtgaat tccactttgg ttctacagat 2520

tctggcctat atcatggagg tattgtaaat gcagccagtc aatctgaacg agccagcatg 2580

tacactcgtt atatggaatc tgtaattgat aacccatatt ttgtcggtgc tcattggttc 2640

caatatcttg actctccagc aacaggtaga gcttgggatg gtgaaaacta caacatcggt 2700

tttgtcacta ttgctgacca gccatatgaa gagttagtag aagccgctaa acaggtgaat 2760

atcaacttat atcaacaacg tttttctaaa 2790

<210> 2

<211> 930

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln His Thr Lys Ala Pro Glu Thr Gln Thr Val Asp Gly Asp Asn Ile

1 5 10 15

Pro Val Ser Leu Pro Asp Phe Glu Ser Asp Ser Phe Phe Asn Asn Val

20 25 30

Ala Val Ser His Ala Lys Val Glu Lys Ile Asn Gly Val Gly Val Thr

35 40 45

Ala Gly Ser Asn Ala Leu Lys Ile Ser Phe Asp Glu Val Ser Glu Ala

50 55 60

Asn Lys Phe Lys Phe Trp Pro Asn Ile Lys Ile Val Pro Asn Glu Gly

65 70 75 80

Ile Trp Asn Trp Asn Ser Lys Gly Ser Phe Lys Val Asp Val Thr Asn

85 90 95

Pro Ser Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Phe Lys Val Val Asp Asn Ile

100 105 110

Gly Ser Met Gly Ala Gln Thr Asn Gln Leu Asn Tyr Ala Val Ser Ile

115 120 125

Pro Ala Gly Glu Thr Glu Thr Val Glu Met Leu Phe Asn Gly Gly Lys

130 135 140

Arg Lys Leu Asn Asn Tyr Trp Asp Gly Asp Gln Leu Asp Leu Arg Lys

145 150 155 160

Leu Val Glu Leu Gln Val Phe Val Gln Gly Pro Met Asp Ala Gln Thr

165 170 175

Val Val Leu Asp Asn Phe Glu Leu Ile Asp Ala Thr Gly Asp Phe Ile

180 185 190

Ser Ala Lys Glu Gln Val Ile Asp Val Gly Pro Val Pro Thr Val Lys

195 200 205

Val Ile Thr Asp Phe Asp Ser Gly Glu Ala Ser Tyr Ile Ser Glu Arg

210 215 220

Ser Val Ser Thr Ser Val Lys Thr Val Asp Thr Ala Glu Gly Gln Gly

225 230 235 240

Ile Glu Val Arg Tyr Ser Ser Glu Asn Ala Tyr Pro Asn Leu Thr Leu

245 250 255

Ala Pro Thr Asp Lys Trp Asp Trp Ser Lys Glu Gln Asp Phe Asn Leu

260 265 270

Ala Phe Asp Ile Glu Asn Pro Thr Asn Glu Pro Ile Gln Met Phe Val

275 280 285

Arg Val Asp Gln Ala Glu Asn Lys Asn Trp Gly Gly Thr Ala Asp Gly

290 295 300

Val Thr Asp Ser Met Ser Ala Tyr Met Thr Leu Ala Pro Gln Glu Met

305 310 315 320

Asn Thr Tyr Tyr Met Ser Leu Ser Gln Leu Ser Gly Lys Leu Val Ser

325 330 335

Gly Met Arg Ser Glu Pro Pro Lys Lys Ser Tyr Asn Ala Gln Lys Ile

340 345 350

Ser Tyr Gly Trp Gly Glu Thr Glu Leu Asp Leu Ser Asn Ile Lys Ser

355 360 365

Ile Gln Leu Tyr Leu Gln Asn Pro Thr Lys Asp Thr Arg Ile Ile Leu

370 375 380

Asp Ser Val Arg Leu Ile Pro Asn Leu Asp Ala Asp Ala Thr Arg Tyr

385 390 395 400

Ala Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Ser Thr His Ala Asp Trp Pro

405 410 415

Glu Lys Ile Asp Ser Ile Asp Glu Leu Gln Ala Gln Gly Lys Lys Asp

420 425 430

Leu Glu Ser Leu Lys Thr Val Gln Pro Leu Pro Asp Arg Ser Thr Phe

435 440 445

Gly Gly Trp Lys Asp Gly Pro Lys Leu Asp Ala Thr Gly Phe Phe Arg

450 455 460

Thr Glu Lys Val Asp Gly Gln Trp Ser Leu Val Asp Pro Glu Gly Tyr

465 470 475 480

Leu Phe Phe Met Thr Gly Leu Asp Asn Val Arg Met Asp Asp Thr Val

485 490 495

Thr Ile Thr Gly Val Asp Tyr Glu Asn Pro Asp Glu Arg Ser Gly Arg

500 505 510

Ser Ile Pro Ser Glu Leu Arg Asn Ser Met Phe Thr Trp Leu Pro Glu

515 520 525

Asp Asp Asp Pro Leu Ala Ser Asn Tyr Asp Tyr Ala Thr Tyr Val His

530 535 540

Ser Gly Ala Leu Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Phe Tyr Arg Ala Asn

545 550 555 560

Leu Met Arg Lys Tyr Asp Thr Ser Lys Glu Glu Ala Met Lys Ile Trp

565 570 575

Lys Asp Val Thr Leu Glu Arg Met Gln Glu Trp Gly Phe Thr Thr Leu

580 585 590

Gly Asn Trp Ile Asp Pro Met Phe Tyr Asp Asn Gly Lys Val Ala Tyr

595 600 605

Glu Ala His Gly Trp Ile Ala Gly Asp His Gln Arg Ile Ser Thr Gly

610 615 620

Asn Asp Tyr Trp Gly Pro Ile His Asp Pro Phe Asp Pro Lys Phe Gln

625 630 635 640

Glu Ser Thr Arg Lys Met Ala Glu Arg Val Ala Ser Lys Val Ser Asp

645 650 655

Asn Asp Pro Trp Leu Val Gly Thr Phe Val Asp Asn Glu Ile Ser Trp

660 665 670

Gly Asn Val Met Asn Glu Ala Asn His Tyr Gly Leu Ile Ile Asn Ala

675 680 685

Leu Ser Tyr Asp Ala Glu Lys Ser Ser Ala Lys Gln Ser Phe Thr Thr

690 695 700

His Leu Lys Ser Lys Tyr Lys Ile Ile Thr Ala Leu Asn Lys Ala Trp

705 710 715 720

Gly Thr Lys Val Gly Ser Trp Gly Glu Phe Glu Lys Ser Phe Asp Tyr

725 730 735

Arg Glu Lys Leu Lys Pro Gly Met Lys Ala Asp Tyr Ser Glu Leu Leu

740 745 750

Gln Met Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Ser Ile Val Arg Lys Glu Ile Lys

755 760 765

Arg Val Leu Pro Asn His Leu Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ser Asp Trp

770 775 780

Gly Leu Thr Pro Glu Ile Ala Arg Ala Ala Ala Lys His Val Asp Val

785 790 795 800

Met Ser Tyr Asn Leu Tyr Ala Asn Asp Ile Thr Asp Glu Lys Lys Ala

805 810 815

His Phe Gln His Phe Leu Ala Glu Leu Asp Met Pro Ser Met Ile Gly

820 825 830

Glu Phe His Phe Gly Ser Thr Asp Ser Gly Leu Tyr His Gly Gly Ile

835 840 845

Val Asn Ala Ala Ser Gln Ser Glu Arg Ala Ser Met Tyr Thr Arg Tyr

850 855 860

Met Glu Ser Val Ile Asp Asn Pro Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe

865 870 875 880

Gln Tyr Leu Asp Ser Pro Ala Thr Gly Arg Ala Trp Asp Gly Glu Asn

885 890 895

Tyr Asn Ile Gly Phe Val Thr Ile Ala Asp Gln Pro Tyr Glu Glu Leu

900 905 910

Val Glu Ala Ala Lys Gln Val Asn Ile Asn Leu Tyr Gln Gln Arg Phe

915 920 925

Ser Lys

930

<210> 3

<211> 2790

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caacatacta aagcgccaga aacacaaaca gttgatggcg ataatatccc tgtttcactt 60

cctgactttg aatcggattc cttttttaac aatgttgccg tttctcatgc caaagtagaa 120

aaaattaatg gagtaggtgt aaccgcaggt tcaaatgctt taaaaattag ttttgatgaa 180

gtctctgaag ctaataaatt taagttttgg cctaatataa aaatagtgcc taatgaaggt 240

atttggaatt ggaactccaa aggtagtttt aaggttgatg taacaaaccc aagtgatagc 300

tcagcaaata ttatatttaa agttgtagat aatattggct caatgggagc gcaaactaac 360

cagttaaatt atgctgtcag tattcctgca ggtgaaacgg aaactgtcga aatgttattt 420

aacggtggaa agcgaaaatt aaataactat tgggatgggg atcaactaga tttacggaaa 480

ttagttgaat tgcaagtgtt tgttcaaggt ccaatggacg cacaaacggc agtacttgat 540

aattttgagt taatcgatgc aacaggtgac tttatttcgg ccaaagaaca agttattgat 600

gttggcccag tacctacagt gaaagtcatt actgattttg atagtggtga agcgagttac 660

atctctgagc gcagtgtatc aaccagtgtt aaaacagtag atacagcgga ggggcaagga 720

atagaggtgc gatattcatc agagaatgcg tatccaaacc ttacattagc accaacagat 780

aaatgggatt ggtcgaaaga acaagatttt aacctggcat ttgatattga aaatccgact 840

aacgaaccta ttcaaatgtt tgttcgtgtc gatcaggctg aagataaaaa ctggggtggg 900

acagcggatg gtgtgacaga tagtatgtcg gcctatatga ccctcgcgcc acaagaaatg 960

aatacctact atatgtcatt gtcccaattg agcggtaagt tagtctctgg tatgggaagc 1020

gagccaccaa aaaaatctta taatgctcaa aaaattagtt atgggtgggg tgaaacagag 1080

ttagatctct ctaatatcaa atcaattcag ttgtatctac aaaatccaac aaaagacact 1140

cgtattatat tagattctgt tcgtctaatt cctaatttag atgcagacgc tactcgatat 1200

gcaggtctcg ttgatgaatt tggtcagtca actcatgcag actggcccga gaaaattgat 1260

tcgattgatg aattacaagc acaaggtaaa aaggacttag aaagtcttaa aacggttcaa 1320

ccattaccag accgtagtac attcggtggt tggaaggatg gaccaaaatt agacgcgaca 1380

ggttttttcc gcacagaaaa agttgatggg caatggtcat tagtcgatcc agaagggtat 1440

ttattcttta tgacgggcct tgataacgta cgtatggatg acactgtaac catcacggga 1500

gttgattatg aaaaccctga cgaacgtagt ggccgatcta ttccatctgg acttcgtaat 1560

tcaatgttta cttggttgcc ggaagatgat gatccgctag ccagcaatta cgactatgca 1620

acctatgtgc attccggagc tcttaaaaag ggagaagttt ttagctttta tcgcgcgaat 1680

ttaatgcgta aatatgatac ttcgaaagaa gaggcaatga aaatatggaa agatgtcacg 1740

ttagagcgaa tgcaagaatg ggggttcact acattaggta actggattga cccaatgttt 1800

tatggcaatg gaaaagtggc atatgaagct catggttgga ttgctggtga tcatcaaaga 1860

attagcactg gtaatgatta ttggggacct attcatgatc catttgaccc taaattccaa 1920

gaaagtactc gtaaaatggc agagcgagtt gcaagtaaag tcagtgataa tgacccttgg 1980

ttagttggga ctttcgtcga caatgaaatc agttggggaa atgtgatgaa tgaagccaac 2040

cattatggat taatcatcaa tgcattaagt tatgatgctg aaaaaagctc agctaaacaa 2100

tcgtttacga ctcatttaaa atccaaatat aaaataatca cagctttaaa taaagcatgg 2160

ggaaccaagg ttgggtcatg gggtgagttt gaaaaatctt tcgattatag agaaaaatta 2220

aaacctggta tgaaagccga ttattctgaa cttttacaaa tgttaggtga gcaatacttc 2280

tctattgtgc gaaaggagat caaaagggtt ttacctaatc acttatactt aggcgcacgt 2340

ttttctgatt gggggctgac tccagaaata gcccgagcag cagcaaaaca tgttgatgtg 2400

atgagttata acctttatgc caacgatatt acagatgaga aaaaggcaca tttccaacat 2460

ttcttagctg aattggatat gcctagcatg attggtgaat tccactttgg ttctacagat 2520

tctggcctat atcatggagg tattgtaaat gcagccagtc aatctgaacg agccagcatg 2580

tacactcgtt atatggaatc tgtaattgat aacccatatt ttgtcggtgc tcattggttc 2640

caatatcttg actctccagc aacaggtaga gcttgggatg gtgaaaacta caacatcggt 2700

tttgtcacta ttgctgacca gccatatgaa gagttagtag aagccgctaa acaggtgaat 2760

atcaacttat atcaacaacg tttttctaaa 2790

<210> 4

<211> 930

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln His Thr Lys Ala Pro Glu Thr Gln Thr Val Asp Gly Asp Asn Ile

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Pro Val Ser Leu Pro Asp Phe Glu Ser Asp Ser Phe Phe Asn Asn Val

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Ala Gly Ser Asn Ala Leu Lys Ile Ser Phe Asp Glu Val Ser Glu Ala

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Asn Lys Phe Lys Phe Trp Pro Asn Ile Lys Ile Val Pro Asn Glu Gly

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Ile Trp Asn Trp Asn Ser Lys Gly Ser Phe Lys Val Asp Val Thr Asn

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Pro Ser Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Phe Lys Val Val Asp Asn Ile

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Gly Ser Met Gly Ala Gln Thr Asn Gln Leu Asn Tyr Ala Val Ser Ile

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Pro Ala Gly Glu Thr Glu Thr Val Glu Met Leu Phe Asn Gly Gly Lys

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Arg Lys Leu Asn Asn Tyr Trp Asp Gly Asp Gln Leu Asp Leu Arg Lys

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Leu Val Glu Leu Gln Val Phe Val Gln Gly Pro Met Asp Ala Gln Thr

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Val Val Leu Asp Asn Phe Glu Leu Ile Asp Ala Thr Gly Asp Phe Ile

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Val Ile Thr Asp Phe Asp Ser Gly Glu Ala Ser Tyr Ile Ser Glu Arg

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Ser Val Ser Thr Ser Val Lys Thr Val Asp Thr Ala Glu Gly Gln Gly

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Asn Thr Tyr Tyr Met Ser Leu Ser Gln Leu Ser Gly Lys Leu Val Ser

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Ala Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Ser Thr His Ala Asp Trp Pro

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Leu Glu Ser Leu Lys Thr Val Gln Pro Leu Pro Asp Arg Ser Thr Phe

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Gly Gly Trp Lys Asp Gly Pro Lys Leu Asp Ala Thr Gly Phe Phe Arg

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Thr Glu Lys Val Asp Gly Gln Trp Ser Leu Val Asp Pro Glu Gly Tyr

465 470 475 480

Leu Phe Phe Met Thr Gly Leu Asp Asn Val Arg Met Asp Asp Thr Val

485 490 495

Thr Ile Thr Gly Val Asp Tyr Glu Asn Pro Asp Glu Arg Ser Gly Arg

500 505 510

Ser Ile Pro Ser Glu Leu Arg Asn Ser Met Phe Thr Trp Leu Pro Glu

515 520 525

Asp Asp Asp Pro Leu Ala Ser Asn Tyr Asp Tyr Ala Thr Tyr Val His

530 535 540

Ser Gly Ala Leu Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Phe Tyr Arg Ala Asn

545 550 555 560

Leu Met Arg Lys Tyr Asp Thr Ser Lys Glu Glu Ala Met Lys Ile Trp

565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

Glu Ala His Gly Trp Ile Ala Gly Asp His Gln Arg Ile Ser Thr Gly

610 615 620

Asn Asp Tyr Trp Gly Pro Ile His Asp Pro Phe Asp Pro Lys Phe Gln

625 630 635 640

Glu Ser Thr Arg Lys Met Ala Glu Arg Val Ala Ser Lys Val Ser Asp

645 650 655

Asn Asp Pro Trp Leu Val Gly Thr Phe Val Asp Asn Glu Ile Ser Trp

660 665 670

Gly Asn Val Met Asn Glu Ala Asn His Tyr Gly Leu Ile Ile Asn Ala

675 680 685

Leu Ser Tyr Asp Ala Glu Lys Ser Ser Ala Lys Gln Ser Phe Thr Thr

690 695 700

His Leu Lys Ser Lys Tyr Lys Ile Ile Thr Ala Leu Asn Lys Ala Trp

705 710 715 720

Gly Thr Lys Val Gly Ser Trp Gly Glu Phe Glu Lys Ser Phe Asp Tyr

725 730 735

Arg Glu Lys Leu Lys Pro Gly Met Lys Ala Asp Tyr Ser Glu Leu Leu

740 745 750

Gln Met Leu Gly Glu Gln Tyr Phe Ser Ile Val Arg Lys Glu Ile Lys

755 760 765

Arg Val Leu Pro Asn His Leu Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Ser Asp Trp

770 775 780

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785 790 795 800

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<400> 7

gcactcgagt ttatttagaa aaacgttgtt gatataag 38

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacccaatgt tttatggcaa tggaaaagtg gc 32

Claims

1.一种定点突变改造热稳定性提高的琼胶酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.包含权利要求1所述琼胶酶突变体的载体。

3.含有权利要求2所述载体的基因工程菌。

4.如权利要求1所述的琼胶酶突变体在制备琼胶寡糖上的应用。