CN107828768B - 一种l-天冬酰胺酶突变体及其构建方法 - Google Patents

一种l-天冬酰胺酶突变体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程、酶工程领域。本发明的突变体是在SEQ ID N0.2所示的核苷酸的基础上，将其编码的第298位赖氨酸突变成亮氨酸。本发明得到的突变体在枯草芽孢杆菌中表达，通过镍柱亲和层析纯化目的蛋白，得到的突变体最适温度从95℃降低到85℃，最适pH从8降低到7，Km值从6.5降低到4.9，比酶活突变前后无变化。本发明表明298位赖氨酸残基对酶底物亲和性有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

Description

一种L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，尤其是一种最适温度、最适pH和km降低的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程领域、酶工程领域。
背景技术
L-天冬酰胺酶(E.C.3.5.1.1)能催化L-天冬酰胺脱氨生成L-天冬氨酸和氨。L-天冬酰胺酶广泛存在微生物、动物及植物中。E.coli，Erwiniachrysanthemi及E.carotovora中分离纯化的L-天冬酰胺酶已经被用作化疗药中的成分，被广泛应用于治疗急性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤及网状细胞肉瘤等疾病中。由于L-天冬酰胺酶能降解油炸、烘焙等高温处理食品中致癌物质丙烯酰胺的前体物质L-天冬酰胺的含量，从源头上降低了致癌物质丙烯酰胺的含量，也被应用与食品行业中。
食品行业中，利用L-天冬酰胺酶处理食品，常使用“热烫法”，即将食品置于较高温度(如85℃)的水中，并加入L-天冬酰胺酶来降低丙烯酰胺的前体物质L-天冬酰胺，进而降低高温处理食品中的丙烯酰胺含量(LWT-Food Science and Technology,2011,44(6):1473-1476；Molecular Nutrition & Food Research,2009,53(12):1532-1539；EXTREMOPHILES，2015,19(4))，此方法的关键在于寻找满足预处理温度的L-天冬酰胺酶。人工序列
发明内容
本发明在Pyrococcus yayanosii CH1来源的L-天冬酰胺酶的基础上，进行突变，构建了一种最适温度、pH及km值降低的L-天冬酰胺酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明还提供了一种能有效表达所述L-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌的制备方法，是在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的基础上，将编码第298位赖氨酸的密码子突变成亮氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体pMA5上得到重组质粒，将质粒转化到枯草芽孢杆菌168中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：
以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，F1primer(序列如SEQ ID NO.3所示)和R1primer(序列如SEQ ID NO.4所示)、F2(序列如SEQ ID NO.5所示)和R2(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行重叠延伸PCR即得到SEQ ID NO.7所示的重组基因K298L。将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-K298L，重组质粒化转化B.subtilis 168，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌株，命名为B.subtilis168/pMA5-K298L。
本发明在Pyrococcus yayanosii CH1来源的L-天冬酰胺酶的基础上，通过定点突变生物技术改造L-天冬酰胺酶分子结构，突变体最适温度从95℃降低到85℃，最适pH从8降低到7，底物亲和性Km值从6.5降低到4.9。本发明构建的突变体更加满足L-天冬酰胺酶在食品行业中的应用，并且表面298位氨基酸残基对酶与底物的亲和性有较大影响，为该酶催化机理的研究提供了一定的基础。
本发明提供的L-天冬酰胺酶可用于加工食品，例如“热烫”处理，也可以用于治疗急性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤及网状细胞肉瘤等。
具体实施方式
实施例1含L-天冬酰胺酶突变体的重组载体的构建
(1)K298L突变体的获得：以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，F1 primer(序列如SEQ ID NO.3所示)和R1primer(序列如SEQ ID NO.4所示)、F2(序列如SEQ ID NO.5所示)和R2(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行重叠延生PCR即得到SEQ ID NO.7所示的重组基因。
(2)将重组基因与pMA5分别用BamHI、MluI双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化JM109感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，挑取转化子，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，正确后，命名为pMA5-K298L。
实施例2产L-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌工程菌构建
将实施例1得到的重组质粒pMA5-K298L化学法转化入B.subtilis 168感受态细胞，具体方法如下：
(1)转化实验所需溶液如下(g/L)：
Sp-A：(NH4)2SO44，K2HPO428，柠檬酸钠12，Sp-B：MgSO4·7H2O 0.4，
100×CAYE：Casamino acid 20，酵母粉100；
Sp I培养基：Sp-A49％，Sp-B 49％，50％葡萄糖2％，100×CAYE 2％；
Sp II培养基：Sp I培养基98％，50mmol/LCaCl21％，250mmol/L MgCl21％。115℃湿热灭菌。
(2)将B.Subtilis 168的单菌落接种至2mL Sp I培养基中(50mL离心管)，37℃、200 r/min培养过夜；
(3)取100μL培养液至5mL Sp I培养基中，37℃、200r/min培养至对数期(OD600值为1左右)，约4～5h；
(4)取200μL培养液至2mL Sp II培养基中，37℃、200r/min培养90min，取出后加入20μL 10mmol/L EGTA，于37℃、200r/min继续培养10min，然后分装成500μL每管，加入5μL重组质粒pMA5-K298L，混匀，37℃、200r/min培养90min，取菌液涂布抗性平板。37℃培养12h，挑取阳性转化子验证。得到重组菌B.subtilis 168/pMA5-K298L。
实施例3重组菌B.subtilis 168/pMA5-K298L的表达及酶活测定。
(1)将实施例2构建的重组菌B.subtilis 168/pMA5-K298L与表达未突变的酶(SEQID NO.2)的对照菌株B.subtilis 168/pMA5-asnase分别接种于l0mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按0.5％的接种量转接于100mL LB培养基中，37℃培养24h，取发酵液于4℃、10000r/min离心l0min，上清为胞外粗酶液，细胞破碎上清液为胞内粗酶液，用于酶活力的测定。
(2)取胞内粗酶液，用AKTA蛋白纯化仪及1mL HisTrapTM HP型镍柱，进行镍柱亲和层析法进行纯化，得到纯酶液。
(3)L-天冬酰胺酶的酶活测定。反应体系：100μL适当稀释酶液、800μL 25mmol·L- 1L-天冬酰胺溶液(用50mmol·L-1、pH 8Tris-HCl缓冲液溶解L-天冬酰胺)，在设定温度水浴中反应15min，加入100μL质量体积百分浓度为15％(w·v-1)的三氯乙酸溶液(TCA)终止反应。对照组在酶反应即水浴前加入100μL质量体积百分浓度为15％的TCA提前终止酶促反应。反应后在10000g转速下常温离心10min，显色反应体系为：200μL离心上清液、4.8mLddH2O、200μL奈斯勒试剂，混匀后室温静置10-15min，于450nm波长处读取吸光度。同条件下。用不同浓度的氯化铵进行显色反应，绘制氨浓度标准曲线。L-天冬酰胺酶酶活通过测定酶促反应所生成氨的量来计算。酶活单位：在一定条件下,每分钟内产生1μmol氨气所需的酶量为1个酶活单位,用Bradford法测定蛋白浓度。
(4)最适温度和最适pH：设置60、70、80、85、90、95、100℃设置7个反应温度。在不同温度下，按实施例3[3]所述的方法测定纯酶的酶活，以确定最适温度；分别用0.05M醋酸盐缓冲液(pH＝4-6)、PB缓冲液(pH＝6-7)、Tris-HCl缓冲液(pH＝7-9)、甘氨酸-NaOH缓冲液(9-10)与底物L-天冬酰胺配置成pH从4到10的反应缓冲体系，按实施例3[3]所述的方法测定纯酶的酶活，以确定最适pH。
(5)动力学参数测定。用pH＝7、50mMTris-HCl缓冲液配制(0.05-4.0mmol·L-1)的L-Asn底物溶液，加入100μL L-天冬酰胺酶纯酶液，在最适温度下与底物反应，测定酶活，利用Lineweaver-Burk双倒数法作图计算得到动力学参数。
得到的突变体K298L与突变前相比，最适温度从95℃降低到85℃，最适pH从8降低到7，底物亲和性km值从6.5降低到4.9，其比酶活前后无变化，均为1486±73U/mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法
<130> 1
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Arg Leu Leu Ile Leu Gly Met Gly Gly Thr Ile Ala Ser Val Pro
1 5 10 15
Ser Glu Glu Gly Tyr Glu Ser Ser Leu Ser Val Glu Glu Ile Leu Arg
20 25 30
Leu Ala Gly Leu Glu Leu Lys Trp Glu Val Glu Ala Arg Asp Leu Leu
35 40 45
Asn Ile Asp Ser Thr Leu Ile Gln Pro Glu Asp Trp Val Leu Leu Ala
50 55 60
Glu Thr Val Phe Glu Ala Phe Glu Glu Phe Asp Gly Val Val Ile Thr
65 70 75 80
His Gly Thr Asp Thr Leu Ala Tyr Thr Ala Ser Met Leu Ser Phe Met
85 90 95
Val Arg Asn Pro Pro Val Pro Ile Val Leu Thr Gly Ala Met Arg Pro
100 105 110
Ile Thr Glu Pro Gly Ser Asp Ala Pro Arg Asn Leu Trp Thr Ala Leu
115 120 125
Arg Phe Ala Ile Glu Gly Val Pro Gly Val Tyr Val Ala Phe Met Asp
130 135 140
Lys Val Met Leu Gly Val Arg Val Ser Lys Val Arg Ala Val Gly Leu
145 150 155 160
Asn Ala Phe Gln Ser Ile Asn Tyr Pro Asp Ile Ala Tyr Val Lys Gly
165 170 175
Asn Arg Ile His Trp Asn Ala Lys Pro Pro Lys Leu Glu Gly Glu Pro
180 185 190
Val Leu Asp Thr Arg His Glu Pro Arg Val Leu Val Leu Arg Leu Val
195 200 205
Pro Gly Met Glu Gly Asp Val Leu Glu Ala Ala Leu Glu Leu Gly Tyr
210 215 220
Arg Gly Ile Val Leu Glu Gly Tyr Gly Val Gly Gly Ile Pro Tyr Arg
225 230 235 240
Gly Arg Asp Leu Leu Asp Val Val Arg Arg Val Ala Thr Glu Ile Pro
245 250 255
Val Val Met Thr Thr Gln Thr Leu Tyr Asp Gly Val Asp Leu Thr Lys
260 265 270
Tyr Lys Val Gly Arg Lys Ala Leu Glu Val Gly Val Ile Pro Ala Gly
275 280 285
Asp Met Thr Lys Glu Ala Thr Ile Thr Leu Leu Met Trp Ile Leu Gly
290 295 300
His Thr Arg Asp Val Gly Glu Val Arg Arg Leu Met Leu Thr Asn Met
305 310 315 320
Val Gly Glu Ile Gly Lys Ser Ala
325
<210> 2
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagactgc tgatcctggg aatgggagga acaatcgcaa gtgtgccttc agaagaggga 60
tacgaatcat cactgtctgt ggaggagatc ctgagacttg caggacttga gctgaagtgg 120
gaagttgagg ctagagatct gctgaacatc gattctacgt tgatccagcc tgaggattgg 180
gttctgctgg ctgaaacagt attcgaggca ttcgaggaat ttgacggagt ggtaataacc 240
cacggtacag acacgctcgc ttacacagct tcgatgctta gctttatggt gagaaaccct 300
cctgtgccta tcgtactcac gggagcaatg aggcctatta cagagccagg ttccgatgca 360
ccaaggaact tatggacagc tttgagattt gctatcgaag gagtgccagg agtttacgtg 420
gcctttatgg ataaggtcat gctcggagtg agagtaagca aggtccgtgc agttggtctt 480
aacgcctttc aaagcattaa ttatccagac atagcctatg tcaagggcaa tcgtattcat 540
tggaatgcca aaccgccgaa actcgaaggc gaaccggtgc tcgacacgcg acatgaaccg 600
cgtgttcttg tattgcgact tgttccgggt atggaaggcg atgtacttga agcggcctta 660
gaattgggtt atcgcggtat tgtccttgaa ggctatgggg tgggcgggat tccgtatcgt 720
ggccgcgatt tgcttgatgt tgttcggcgg gttgcgactg aaattccggt tgtaatgact 780
acacaaacat tatatgacgg cgttgacttg accaaataca aagtcggccg gaaagcgtta 840
gaagtcggcg tcattccggc gggggatatg actaaagaag cgaccattac gaaattaatg 900
tggatattag gccatacgcg cgatgtcggg gaagtccggc gcttaatgtt aaccaatatg 960
gtcggcgaaa ttgggaaatc cgcgtaa 987
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggatccat gagactgctg atcctgg 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attaacaacg taatggtcgc ttctt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cattacgttg ttaatgtgga tatta 25
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcacgcgttt agtggtggtg gtggtggtgc gcggatttcc caatttcg 48
<210> 7
<211> 987
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgagactgc tgatcctggg aatgggagga acaatcgcaa gtgtgccttc agaagaggga 60
tacgaatcat cactgtctgt ggaggagatc ctgagacttg caggacttga gctgaagtgg 120
gaagttgagg ctagagatct gctgaacatc gattctacgt tgatccagcc tgaggattgg 180
gttctgctgg ctgaaacagt attcgaggca ttcgaggaat ttgacggagt ggtaataacc 240
cacggtacag acacgctcgc ttacacagct tcgatgctta gctttatggt gagaaaccct 300
cctgtgccta tcgtactcac gggagcaatg aggcctatta cagagccagg ttccgatgca 360
ccaaggaact tatggacagc tttgagattt gctatcgaag gagtgccagg agtttacgtg 420
gcctttatgg ataaggtcat gctcggagtg agagtaagca aggtccgtgc agttggtctt 480
aacgcctttc aaagcattaa ttatccagac atagcctatg tcaagggcaa tcgtattcat 540
tggaatgcca aaccgccgaa actcgaaggc gaaccggtgc tcgacacgcg acatgaaccg 600
cgtgttcttg tattgcgact tgttccgggt atggaaggcg atgtacttga agcggcctta 660
gaattgggtt atcgcggtat tgtccttgaa ggctatgggg tgggcgggat tccgtatcgt 720
ggccgcgatt tgcttgatgt tgttcggcgg gttgcgactg aaattccggt tgtaatgact 780
acacaaacat tatatgacgg cgttgacttg accaaataca aagtcggccg gaaagcgtta 840
gaagtcggcg tcattccggc gggggatatg actaaagaag cgaccattac gttgttaatg 900
tggatattag gccatacgcg cgatgtcggg gaagtccggc gcttaatgtt aaccaatatg 960
gtcggcgaaa ttgggaaatc cgcgtaa 987

Claims (8)

1.一种L-天冬酰胺酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.一种含有权利要求2所述基因的载体或细胞。
4.一种表达权利要求1所述L-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主。
5.一种制备权利要求4所述基因工程菌的方法，其特征在于，是在SEQ ID NO.2所示序列的基础上，将其编码的第298位赖氨酸突变成亮氨酸，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体是:(1)以SEQ ID NO.2所示核酸序列为模板，以序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，进行重叠延伸PCR，即得到编码的298位氨基酸由赖氨酸突变成亮氨酸的K298L突变体基因序列；(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5表达载体中，得到重组质粒pMA5-K298L，重组质粒转化B.subtilis168中，获得重组枯草芽孢杆菌基因工程菌B.subtilis168/pMA5-K298L。
7.权利要求1所述L-天冬酰胺酶突变体在降低食品中丙烯酰胺的含量中的应用。
8.含有权利要求1所述L-天冬酰胺酶突变体的制剂。
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