CN106801046B - 热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用。本发明选择野生型酸性普鲁兰酶的6个位点进行定点突变，从中筛选出3个热稳定性提高的单点突变体。本发明进一步在单点突变的基础上进行组合突变，获得热稳定性和催化效率提高的普鲁兰酶组合突变体，其中组合突变体PulB‑D328H/N387D/A414P的Tm比突变前提高了4.91℃，在65℃下处理10min后，其残余酶活是突变前的12.4倍。本发明进一步公开了含有所述酸性普鲁兰酶突变体编码基因的重组表达载体和重组宿主细胞。本发明所述酸性普鲁兰酶突变体的热稳定性和催化效率明显提高，在食品、化工或纺织等领域具有更好的应用前景。

Description

热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一种酸性普鲁兰酶突变体，尤其涉及一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，本发明还涉及编码所述酸性普鲁兰酶突变体的基因，属于酸性普鲁兰酶突变体的构建及其应用领域。
背景技术
淀粉作为最常见的碳水化合物之一，一般含75％到80％的支链淀粉。在糖化过程中，糖化酶只能特异性水解α-1,4-糖苷键，对组成淀粉分支结构的α-1,6-糖苷键的作用有限。普鲁兰酶(EC 3.2.1.41)作为最广为人知的淀粉脱支酶，能特异性水解支链淀粉的分支α-1,6-糖苷键，属于α-淀粉酶家族。如果在糖化过程中添加脱支酶和糖化酶协同作用，可将淀粉质原料的转化率提高到97％以上，大幅提高生产效率，降低生产成本。此外，普鲁兰酶在燃料乙醇、低热量的啤酒、抗性淀粉、麦芽三糖等产品的生产过程中也起着重要作用。
目前为止，多种不同物种来源的普鲁兰酶已经被分离得到，如芽孢杆菌、微小杆菌属、热袍菌属、克雷伯氏菌等；不同来源的普鲁兰酶，酶学性质也各不相同。由于糖化工艺需在60℃以上和pH 4.5的条件下进行，所以大多数天然的普鲁兰酶的酶学性质限制了其在工业生产中的应用。来源于Bacillus naganoensis(AB231790.1)酸性普鲁兰酶PulB，最适温度60℃，最适pH 4.5，符合糖化工艺条件，但是此酸性普鲁兰酶PulB的热稳定性较差，不能在工艺条件下始终维持最高的酶活力，因此通过蛋白质工程技术提高Bacillusnaganoensis普鲁兰酶PulB的热稳定性，意义重大。
随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，通过理性设计进行定点突变已成为常用的定向改良蛋白质工程技术，是提高工业用酶热稳定性的主要手段，也是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶热稳定性的方法。到目前为止，通过理性设计定点改造基因，已经被成功运用到许多不同普鲁兰酶的稳定性改良研究中。因此，通过对Bacillus naganoensis(AB231790.1)酸性普鲁兰酶PulB进行定点突变，获得的热稳定性和催化效率提高的酸性普鲁兰酶突变体，将更适合工业应用。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，通过对来源于Bacillus naganoensis(GenBank AB231790.1)的酸性普鲁兰酶PulB进行多轮定点突变，获得热稳定性和催化效率提高的酸性普鲁兰酶单点突变体和多点组合突变体；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供编码所述酸性普鲁兰酶突变体的基因；
本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述酸性普鲁兰酶突变体在食品、化工或纺织工业中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，所述突变体选自(a)、(b)、(c)、(d)或(e)：
(a)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸获得的突变体，即PulB-D328H；或
(b)、将野生型酸性普鲁兰酶的第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体，即PulB-N387D；或
(c)、将野生型酸性普鲁兰酶的第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体，即PulB-A414P；或
(d)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，且第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸获得的突变体，即PulB-D328H/N387D；或
(e)、将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，且第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体，即PulB-D328H/N387D/A414P。
本发明突变体的命名方式为，采用“原始氨基酸-位置-替换的氨基酸”来表示突变体，如D328H，表示位置328的氨基酸由亲本普鲁兰酶的Asp(D)替换成His(H)，位置的编号对应于亲本普鲁兰酶的氨基酸序列。
本发明所述野生型酸性普鲁兰酶(PulB-WT)的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。
本发明进一步公开了所述酸性普鲁兰酶突变体的氨基酸序列及其编码基因的核苷酸序列。
当所述突变体选自(a)时，其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；
所述突变体选自(b)时，其氨基酸序列为SEQ ID No.7所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；
所述突变体选自(c)时，其氨基酸序列为SEQ ID No.9所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；
所述突变体选自(d)时，其氨基酸序列为SEQ ID No.11所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；
所述突变体选自(e)时，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
本发明采用同源建模、序列比对分析、保守位点分析，选择Bacillus naganoensis(GenBank AB231790.1)来源的酸性普鲁兰酶PulB-WT的6个位点进行突变，分别获得了A287K、D328H、N387D、A414P、I662V、V687S六个单点突变体。突变前后酶的热稳定性比较结果表明，突变酶PulB-D328H在60℃下的热稳定性最好，其次为PulB-N387D，再次为PulB-A414P，而其余的几个单点突变体稳定性均差于PulB-WT；单点突变体PulB-D328H、PulB-N387D及PulB-A414P的比活力均与PulB-WT相近，没有下降。单点突变体PulB-D328H、PulB-N387D和PulB-A414P的Tm分别比PulB-WT提高了1.69℃、0.38℃和1.16℃。
本发明进一步分别选择离328位点距离较近的D321、D331两个位点突变成D321H、D331H，选择离414位点距离较近的A411、A448两个位点突变成A411P、A448P。野生型和单点突变体在60℃处理不同时间剩余酶活的比较结果表明，突变体PulB-D321H、PulB-D331H、PulB-A411P和PulB-A448P的热稳定性均差于PulB-WT；此外，突变体PulB-D321H、PulB-D331H、PulB-A411P和PulB-A448P的比活力均较PulB-WT有不同程度的大幅下降。上述实验结果证明，D328H和A414P是有效提高突变体热稳定性的特定位点。因此，本发明筛选出3个热稳定性强于PulB-WT的突变体，即PulB-D328H、PulB-N387D和PulB-A414P。
由于单个突变对蛋白质热稳定性的影响往往是独立存在的，而且存在叠加效应，为了进一步提高PulB的热稳定性，本发明在PulB-D328H的基础上，进行了D328H/N387D和D328H/N387D/A414P的组合突变。在65℃处理不同时间剩余酶活的比较结果表明，在65℃保温5min后，PulB-D328H的剩余酶活还有87.9％，PulB-D328H/N387D的剩余酶活还有92.7％，PulB-D328H/N387D/A414P的剩余酶活还有100％，然而PulB-WT只剩24.7％。在65℃保温10min后，PulB-D328H的剩余酶活还有49.6％，PulB-D328H/N387D的剩余酶活还有85.5％，PulB-D328H/N387D/A414P的剩余酶活还有95.4％，但PulB-WT仅剩7.7％，几乎已完全失活。可见，在65℃处理10min后，PulB-D328H/N387D/A414P的残余酶活是PulB-WT的12.4倍。
Tm值测定结果表明，双点突变体PulB-D328H/N387D的Tm值在PulB-D328H的基础上提高了2.24℃，三点突变体PulB-D328H/N387D/A414P的Tm值在PulB-D328H/N387D的基础上提高了0.79℃。双点突变体PulB-D328H/N387D和三点突变体PulB-D328H/N387D/A414P的Tm值分别比PulB-WT提高了4.12℃和4.91℃。
突变前后酶的动力学性质参数的测定结果表明，各单点突变体PulB-D328H、PulB-N387D、PulB-A414P以及双点突变体PulB-D328H/N387D和三点突变体PulB-D328H/N387D/A414P的kcat都有不同程度提高；除PulB-D328H的kcat/Km与PulB-WT相似外，其他突变体的kcat/Km都有不同程度提高，说明这些可以提高普鲁兰酶热稳定性的位点突变并不会导致催化效率的降低。其中，突变体PulB-D328H/N387D/A414P的kcat及kcat/Km分别比PulB-WT提高了38.8％和12.9％。
本发明进一步公开了含有所述酸性普鲁兰酶突变体的编码基因的重组表达载体。将本发明的酸性普鲁兰酶突变体的编码基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。
本发明还公开了含有所述重组表达载体的重组宿主细胞；所述重组宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括但不限于大肠杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞。
本发明进一步公开了一种制备所述酸性普鲁兰酶突变体的方法，包括以下步骤：(1)用含有所述酸性普鲁兰酶突变体的编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导酸性普鲁兰酶突变体表达；(3)回收并纯化所表达的酸性普鲁兰酶突变体，即得。
本发明所述酸性普鲁兰酶突变体具有更高的热稳定性和更高的催化效率，因此所述酸性普鲁兰酶突变体或其编码基因能够应用于食品、化工或纺织工业中。例如，应用于葡萄糖生产行业，通过添加本发明所述酸性普鲁兰酶突变体，能够提高将淀粉转化为葡萄糖的效率，降低原料成本。在酒精、啤酒生产行业中，目前酒精和啤酒生产原料大多都是淀粉质原料，而原料中的淀粉由20％左右的直链淀粉和80％左右的支链淀粉组成，在酒精发酵过程中加入本发明所述酸性普鲁兰酶突变体，可以提高淀粉发酵率以及淀粉出酒率；啤酒生产中加入本发明所述酸性普鲁兰酶突变体，能够使啤酒的发酵度、口感、色度及泡沫等指标得到提高。本发明所述酸性普鲁兰酶突变体能够使支链淀粉变为直链淀粉，而直链淀粉具有强度好等特性，能够用于淀粉软糖制造以及肉食品的加工中，还因为直链淀粉具有易成膜性、水溶性差和不溶于脂肪等特点，能够用于生产食品包装薄膜，作为食品的保护层。本发明所述酸性普鲁兰酶突变体或其编码基因在生产高浓度麦芽糖、歧化环糊精或抗性淀粉等也具有广泛的应用前景。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明利用蛋白质工程技术，通过对Bacillus naganoensis(AB231790.1)酸性普鲁兰酶PulB进行定点突变，获得了多个热稳定性和催化效率提高的酸性普鲁兰酶突变体，尤其普鲁兰酶组合突变体PulB-D328H/N387D/A414P，与PulB-WT相比，其Tm提高了4.91℃，在65℃下处理10min后残余酶活是PulB-WT的12.4倍，kcat及kcat/Km也分别提高38.8％和12.9％。本发明所述酸性普鲁兰酶突变体的最适温度和最适pH没有变化，并具有更高的热稳定性和更高的催化效率，因此更适合糖化工艺，在工业上具有更好的应用潜能。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
附图说明
图1为各普鲁兰酶单点突变体(A287K、D328H、N387D、A414P、I662V、V687S)和野生型(PulB-WT)在60℃处理不同时间后的残余酶活曲线图，以各突变体和野生型在60℃处理0min测得的酶活作为100％；
图2为普鲁兰酶单点突变体(D321H、D331H、A411P、A448P)和野生型(PulB-WT)在60℃处理不同时间后的残余酶活曲线图，以各突变体和野生型在60℃处理0min测得的酶活作为100％；
图3为普鲁兰酶组合突变体(PulB-D328H/N387D/A414P，PulB-D328H/N387D)和野生型(PulB-WT)在65℃处理不同时间后的残余酶活曲线图，以各突变体和野生型在65℃处理0min测得的酶活作为100％。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、材料
菌株、质粒与试剂：表达载体pET-22b(+)购自Novagen公司。克隆菌株Escherichiacoli TOP10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。表达菌株E.coli BL21(DE3)感受态细胞、dNTPs、DNA聚合酶、重组酶购自天根生化科技(北京)公司，DNA纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司，普鲁兰糖购自日本和光纯药工业株式会社，其他试剂为国产分析纯，购自北京化学试剂公司。
培养基：LB培养基：酵母浸取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。固体培养基含1.5％琼脂粉。
实施例1热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体的获得
1、突变体的构建
普鲁兰酶野生型基因pul-WT由引物pul-WT-F和pul-WT-R从长野芽孢杆菌Bacillus naganoensis的基因组中经PCR反应获得，经酶切连接到质粒pET22b上。所有突变体都是通过两个片段的同源重组来获得，片段1和片段2分别由引物pET22b-R和突变位点处的pul-F；pET22b-F和突变位点处的pul-R，以质粒pET22b-pul-WT为模板经PCR反应获得。引物序列见表1。
表1引物序列
Figure GDA0002560619470000091
Figure GDA0002560619470000101
PCR条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，68℃退火30s，每个循环退火温度降低1℃至退火温度为55℃，72℃延伸2min 30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR片段1和2经PCR反应获得后，经胶回收纯化，在55℃下重组20min，转化克隆菌株TOP10。转化子在作物遗传育种国家重点实验室测序正确后，转化到表达菌株BL21(DE3)中。
2、突变体酶的获取
将含有重组质粒的菌株于平板上划线活化，挑取单克隆至含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，200r/min振荡培养，将该培养液以1％接种量转接至50mL含50μg/mL氨苄青霉素的液体培养基中，37℃，200r/min培养至OD600＝0.6后，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，16℃，200r/min振荡诱导20h。诱导后的菌液在4℃，8000r/min离心10min后，弃上清收集菌体。菌体用20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)重悬，冰上超声破碎。破碎后的粗酶液经4℃，12000r/min离心20min后小心地取出上清，进行Ni柱纯化，纯化后用于后续研究。
3、突变前后酶的热稳定性比较
本发明比较了突变前后酶的热稳定性变化，其中野生酶是指Bacillusnaganoensis(GenBank AB231790.1)来源的普鲁兰酶PulB-WT(氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示)。
(1)野生型和单点突变体在60℃处理不同时间剩余酶活的比较
各酶液在60℃下分别保温0min，2min，5min，10min，20min，30min，40min，50min，60min后，在最适温度60℃及最适pH 4.5条件下测定剩余酶活，以60℃下保温0min的酶活作为100％。
普鲁兰酶酶活的测定：
取500μL 0.5％普鲁兰糖溶液在60℃水浴中预热5min，取稀释适当倍数的粗酶液250μL加入反应体系，60℃反应20min，加入750μL DNS溶液终止反应(阴性对照取250μL缓冲液代替酶液，其他反应条件相同)，沸水浴显色10min，流动水迅速冷却，用分光光度计测定样品在550nm光吸收值。
一个酶活力单位(U)定义为：在60℃时，每分钟产生相当于1μmoL葡萄糖还原力所消耗的酶量。
结果如图1、图2所示，六个单点突变体(A287K、D328H、N387D、A414P、I662V、V687S)中，突变酶D328H在60℃下的热稳定性最好，其次为N387D，再次为A414P，剩余的几个单点突变体稳定性均差于PulB-WT(图1)。单点突变体D328H、N387D及A414P的比活力均与PulB-WT相近，没有下降。
选择离328位点距离较近的D321、D331两个位点突变成D321H、D331H，选择离414位点距离较近的A411、A448两个位点突变成A411P、A448P，同样进行野生型和单点突变体在60℃处理不同时间剩余酶活的比较，发现D321H、D331H、A411P、A448P的热稳定性均差于PulB-WT(图2)；此外，D321H、D331H、A411P、A448P突变体的比活力均较PulB-WT有不同程度的大幅下降(表2)。因此，证明D328H和A414P是有效提高突变体热稳定性的特定位点。
表2各突变体与野生型的比活力
Figure GDA0002560619470000121
(2)突变前后酶的Tm值比较
Tm值由差示扫描量热法测定，将不同样品用20mM Tris/HCl(pH 7.0)缓冲液同样稀释到0.2mg ml-1，以2℃min-1的速度从40℃扫描到105℃，用氮气维持0.413MPa的压力，结果如表3所示。PulB-D328H、PulB-N387D和PulB-A414P的Tm分别比PulB-WT提高了1.69℃、0.38℃和1.16℃。
其中，突变体PulB-D328H的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；突变体PulB-N387D的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；突变体PulB-A414P的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。
表3各突变体与野生型的Tm值
Figure GDA0002560619470000122
(3)野生型和组合突变体在65℃处理不同时间剩余酶活的比较
由于单个突变对蛋白质热稳定性的影响往往是独立存在的，而且存在叠加效应，为了进一步提高PulB的热稳定性，本发明在PulB-D328H的基础上，进行了D328H/N387D和D328H/N387D/A414P的组合突变。其中，突变体PulB-D328H/N387D的氨基酸序列为SEQ IDNo.11所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；突变体PulB-D328H/N387D/A414P的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
在65℃下保温5min后，PulB-D328H的剩余酶活还有87.9％；双点突变PulB-D328H/N387D的剩余酶活还有92.7％，高于PulB-D328H；PulB-D328H/N387D/A414P的剩余酶活还有100％，高于双点突变PulB-D328H/N387D；然而PulB-WT只剩24.7％。在65℃下保温10min后，PulB-D328H的剩余酶活还有49.6％；双点突变PulB-D328H/N387D的剩余酶活还有85.5％，高于PulB-D328H；PulB-D328H/N387D/A414P的剩余酶活还有95.4％，高于双点突变PulB-D328H/N387D；但PulB-WT仅剩7.7％几乎已完全失活(图3)。在65℃下处理10min后，PulB-D328H/N387D/A414P的残余酶活是PulB-WT的12.4倍。
(4)组合突变前后酶的Tm值比较
Tm值测定同上，双点突变PulB-D328H/N387D的Tm值在PulB-D328H的基础上提高了2.24℃，三点突变PulB-D328H/N387D/A414P的Tm值在PulB-D328H/N387D的基础上提高了0.79℃。双点突变PulB-D328H/N387D和三点突变PulB-D328H/N387D/A414P的Tm值分别比PulB-WT提高了4.12℃和4.91℃(表4)。
表4组合突变前后酶的Tm值
Figure GDA0002560619470000131
4、突变前后酶的动力学性质参数的测定
在最适温度60℃及最适pH4.5条件下，以不同底物浓度(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，8.0，10.0，12.5，15.0及17.5mg mL-1)的普鲁兰糖进行酶活测定。每个酶活性测定进行了至少三个重复。使用GraphPad Prism软件拟合米氏方程初始速度数据，求得突变体和野生型的稳态动力学参数Km和kcat，结果见表5。各突变体的kcat都有不同程度提高，除PulB-D328H的kcat/Km与PulB-WT相似外，其他突变体的kcat/Km都有不同程度提高，说明这些可以提高热稳定性的位点突变并不会导致催化效率的降低。
表5各突变体与野生型酶动力学性质参数
Figure GDA0002560619470000141
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Claims (7)

1.一种热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述突变体将野生型酸性普鲁兰酶的第328位的天冬氨酸突变为组氨酸，第387位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，且第414位的丙氨酸突变为脯氨酸获得的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述酸性普鲁兰酶突变体的基因。
3.按照权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5.一种制备权利要求1所述酸性普鲁兰酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；(2)培养重组菌株，诱导酸性普鲁兰酶突变体表达；(3)回收并纯化所表达的酸性普鲁兰酶突变体，即得。
6.权利要求1所述的酸性普鲁兰酶突变体在食品、化工或纺织工业中的应用。
7.权利要求2或3所述的基因在食品、化工或纺织工业中的应用。
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