CN117645991B - 一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法 - Google Patents
一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117645991B CN117645991B CN202410121546.6A CN202410121546A CN117645991B CN 117645991 B CN117645991 B CN 117645991B CN 202410121546 A CN202410121546 A CN 202410121546A CN 117645991 B CN117645991 B CN 117645991B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutant
- pmgl
- pectin lyase
- thermostable
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010029182 Pectin lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 102220009232 rs111430410 Human genes 0.000 claims description 13
- 102220079370 rs369233658 Human genes 0.000 claims description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 8
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 claims description 7
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000001814 pectin Substances 0.000 claims description 7
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 5
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 4
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 38
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 7
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 4
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241001098824 Bacillus sp. RN1 Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical group OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 1
- 241000588700 Dickeya chrysanthemi Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- 241000999856 Thermotoga maritima MSB8 Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000002761 deinking Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 108010087558 pectate lyase Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102220262380 rs1554458350 Human genes 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000003041 virtual screening Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法，属于酶工程领域。其中，本发明获得的组合突变体P36、P47和P48，与野生型相比，在75℃下的半衰期由原来的10.48 min分别提高至779.05 min、613.95 min和716.73 min，分别提高了大约74倍、59倍和68倍，在80℃下的半衰期由原来的3.03 min分别提高至127.92 min、91.43 min和123.52 min，分别提高了大约42倍、30倍、41倍。本发明获得了一种热稳定性显著提高的果胶裂解酶突变体，在工业生产中具有较大的应用潜力以及经济价值。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，特别涉及一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法。
背景技术
果胶（Pectin）是植物细胞壁中层的一种天然成分，由α-1,4-糖苷键连接的半乳糖醛酸链组成，具有较高的甲基酯化率，并能与其他非纤维素材料形成网络，需要在多种果胶酶协同作用下才能够完全降解。果胶裂解酶（Pectin lyases）是果胶酶家族中的一种重要的酶，可通过反式消除作用断开聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键，生成不饱和寡聚半乳糖醛酸，在制浆造纸行业中的木材脱胶、胶黏物控制以及脱墨等过程发挥着重要的作用，具有广阔的发展前景。然而天然的果胶裂解酶稳定性不好，在高温条件下容易失活，这严重限制了果胶裂解酶在工业上的应用。因此，筛选出热稳定性好的果胶裂解酶突变体，对于提高其工业应用效率以及促进相关工业的发展具有重要的作用。
目前常用的酶分子改造策略有定向进化（Directed evolution）、理性设计（Rational design）和半理性设计（Semirational design）。定向进化通过对目标酶分子进行多轮突变、表达和筛选，从而获得所需功能的酶突变体。但是此法筛选工作量极大、耗时长、成本高，常因缺乏易实现的高通量筛选技术而受到限制。相反，理性设计和半理性设计通过计算模拟考察某位点突变对催化性能的影响，从而对酶定向进化进行设计指导和虚拟筛选，在酶工程领域发挥着重要的作用。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体及其制备方法，其中，组合突变体P36、P47和P48，与野生型相比，在75℃下的半衰期由原来的10.48 min分别提高至779.05 min、613.95 min和716.73min，分别提高了大约74倍、59倍和68倍，在80℃下的半衰期由原来的3.03 min分别提高至127.92 min、91.43 min和123.52min，分别提高了大约42倍、30倍、41倍；具有较大的工业应用潜力以及经济价值。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：
（1）S361N，即第361位氨基酸由S突变为K，其他同理；
（2）S361N，且R11H、Q35P、S115P、V195I、R310L、R340W、Y357F和K360Y中的至少一个；
进一步的，热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：
S361N、Q35P/S361N、S361N/R310L、S361N/K360Y、S361N/R340W、S361N/V195I、Y357F/S361N/R310L、R310L/K360Y/S361N、K360Y/S361N/Y357F、R310L/R340W/Y357F/S361N、R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N、R11H/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N、R11H/Q35P/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N、R11H/S115P/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N、R11H/Q35P/S115P/V195I/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N。
优选的，编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
一种所述突变体的编码基因。
优选的，一种热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体P36（R11H/Q35P/S115P/V195I/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N），所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
具体，所述突变体P36的第11位、35位、115位、195位、310位、340位、357位、360位和361位发生突变，分别由精氨酸R突变为组氨酸H、谷氨酰胺Q突变为脯氨酸P、丝氨酸S突变为脯氨酸P、缬氨酸V突变为异亮氨酸I、精氨酸R突变为亮氨酸L、精氨酸R突变为色氨酸W、酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F、赖氨酸K突变为酪氨酸Y和丝氨酸S突变为天冬酰胺N。
一种如上述所述热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体P36的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述突变体相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
（a）含有上述编码基因的表达盒；
（b）含有上述编码基因的重组表达载体；
（c）含有（a）中所述表达盒的重组表达载体；
（d）含有上述编码基因的重组微生物；
（e）含有（a）中所述表达盒的重组微生物；
（f）含有（b）或（c）中所述重组表达载体的重组微生物。
进一步的，（b）、（c）中所述重组表达载体的出发载体为pET系列的载体或pPICZα载体等；优选为pET-28a(+)载体或pPICZαA载体。
进一步的，（d）、（e）、（f）中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物或酵母等；所述原核生物包括埃希氏菌属（Escherichia）等细菌；所述酵母包括毕赤酵母等酵母。更具体而言，所述原核生物是大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli），具体可为大肠杆菌BL21(DE3)；所述酵母是毕赤酵母X33或GS115。
一种固定化酶，含有上述突变体。
上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在制备热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体中的应用。
上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在降解果胶中的应用；
进一步的，上述突变体、编码基因、突变体相关的生物材料或固定化酶在造纸中的应用。
一种获得上述突变体的方法，包括如下步骤：通过设计引物对编码果胶裂解酶PMGL-Ba的基因进行定点突变后表达。
进一步的，设计含有突变位点的引物向编码果胶裂解酶PMGL-Ba的基因中引入突变，经测序正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体。
更进一步的，是以质粒pET-28a(+)-PMGL-Ba为模板，设计含有突变位点的引物向编码果胶裂解酶PMGL-Ba的基因中引入突变，然后转化至大肠杆菌Top10中，随机挑取转化子提质粒进行测序。
一种热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的酶活测定方法，其特征在于，步骤如下：
酶活测定采用540 nm光吸收法，以果胶为底物测定果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的酶活，一个酶活力单位指在pH 8.0、60℃的条件下，1 min内产生1μmoL还原糖的反应效力；反应体系在1.5 mL的EP管中加入190 μL的底物溶液，所述底物溶液为0.5%的果胶溶液，恒温混匀仪中60℃预热5 min，加入10 μL适当稀释的酶液，反应10 min，立即加入300 μL的DNS溶液，煮沸5 min终止反应；取200 μL反应后的溶液在540 nm处测量其吸光度值。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过FireProt和BayeStab网站预测以及共有序列设计等半理性设计方法获得了18个热稳定性增强的突变体；进一步地，通过将18个热稳定性增强的突变体进行随机组合，测定其在65℃下热处理30 min后的残余酶活，获得了14个热稳定性提高的组合突变体；其中，组合突变体P36、P47和P48，与野生型相比，在75℃下的半衰期由原来的10.48min分别提高至779.05 min、613.95min和716.73 min，分别提高了大约74倍、59倍和68倍，在80℃下的半衰期由原来的3.03 min分别提高至127.92 min、91.43 min和123.52 min，分别提高了大约42倍、30倍、41倍。这一发明获得了一种热稳定性显著提高的果胶裂解酶突变体，在工业生产中具有较大的应用潜力。
附图说明
图1是果胶裂解酶组合突变体P36在75℃和80℃下的半衰期测定。
图2是果胶裂解酶组合突变体P47在75℃和80℃下的半衰期测定。
图3是果胶裂解酶组合突变体P48在75℃和80℃下的半衰期测定。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。另外，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中，所用的果胶裂解酶PMGL-Ba，来源于Bacillus菌种，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示，对其进行密码子优化后的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，由商业公司合成得到。
实施例1 果胶裂解酶PMGL-Ba单点突变体构建
1. 半理性设计获得单点突变体
首先，通过AlphaFold2和RoseTTAFold从头建模网站，对果胶裂解酶PMGL-Ba的三维结构进行建模，并借助拉氏图进行评价，由AlphaFold2建模得到的模型有88.4%的残基处于高置信区间，与此相比，RoseTTAFold建模得到的模型只有83.5%的残基处于高置信区间。由此可见，RoseTTAFold建模得到的模型质量不如AlphaFold2建模得到的模型，但两个模型均可用于后续的实验分析与设计。
其次，将评价合格的PMGL-Ba三维结构提交到FireProt和BayeStab网站，对果胶裂解酶PMGL-Ba突变前后的结合自由能变化（ΔΔG=ΔG突变体-ΔG野生型）进行预测。当ΔΔG大于0时，表示突变使得结合更加不稳定，反应更不可能发生；当ΔΔG小于0时，说明突变使得结合更加稳定，反应更有可能发生。因此，我们选择以下结合自由能ΔΔG小于0的突变体（共51个）作为待验证突变体：R11H、T21V、Q35P、Q53Y、A68M、N76M、Y81W、S85G、S115P、T132L、S134M、S135P、S143P、R154K、N184L、S188N、R191Y、V195I、S196C、G200L、G200S、T208F、A211P、I216F、I216V、N225F、K230R、S250G、N255D、S264G、R265I、T305Y、T305V、D308N、R310L、W317Y、N329M、S337Q、S337H、Y357F、Y367F、Y367W、A383W、A402Y、P410W、A411P、S425L、T432P、G436W、T451S、A452F。
此外，根据共有序列设计原则，基于蛋白质序列同源物中出现频率最高的氨基酸比其他氨基酸对蛋白质稳定性的贡献更大。我们将PMGL-Ba的氨基酸序列与其它已知的六个耐热的碱性果胶裂解酶序列进行比对，这六个已知耐热的碱性果胶裂解酶菌株分别来自Bacillus subtilis（NCBI登录号：P39116）、Bacillus sp. N16-5（NCBI登录号：ACY38198）、Erwinia chrysanthemi（NCBI登录号：P11073）、Thermotoga maritimaMSB8（NCBI登录号：Q9WYR4）、Bacillus sp. TS-47（NCBI登录号：Q9AJM4）、Bacillus sp.RN1（NCBI登录号：B1B6T1）。选择以下突变体（共12个）作为额外的待验证突变体：Y311K、Y291D、V259I、S337H、Y357V、S361N、I364Y、R340W、R340Y、A383N、Q449G、K360Y。
综上，总共获得63个潜在有益的单点突变体。
2. 单点突变体重组质粒构建及验证
（1）重组质粒克隆
以野生型菌株重组质粒pET-28a(+)-PMGL-Ba核苷酸序列作为模板，通过含有突变位点的引物进行全质粒PCR聚合酶链式反应。PCR反应体系为2×KOD buffer 25 μL，2 mmdNTP 10 μL，上下游引物各1.5 μL，质粒模板50~100 ng，KOD酶1 μL，ddH2O补加至终体系为50 μL。反应条件为94℃ 5 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃，3 min 25 s，30个循环；68℃10 min；4℃保存。
其中，重组质粒pET-28a(+)-PMGL-Ba是在pET-28a(+)载体和编码果胶裂解酶PMGL-Ba（SEQ ID NO.1）的基因的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）上设计同源臂重组引物，通过同源重组的方法构建得到。
pET-28a(+)载体上的引物为：
上游引物为：5’-TGAGATCCGGCTGCTAACAA-3’；
下游引物为：5’-GTGATGATGATGATGATGGCT-3’；
编码果胶裂解酶PMGL-Ba的基因核苷酸序列上的引物为：
上游引物为：5’-AGCCATCATCATCATCATCACATGGCTAATGAAGATTACCCAGAAC-3’；
下游引物为：5’-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAATCCTTCTTAAATTGAGAATAG-3’。
（2）产物回收与模板消化
产物回收：往上述PCR产物中加入50 μL无菌水，然后再加入200 μL Buffer GDP，混匀，12000 rpm离心30 s；弃滤液，用700 μLBuffer PW2（用无水乙醇稀释）洗涤2次；最后用30 μL的水进行洗脱、测浓度。
模板消化：向上述回收的产物中加入限制性内切酶DpnI，去除模板质粒。消化的反应为PCR回收产物600~1200 ng，10×buffer 1 μL，DpnI消解酶0.5 μL，ddH2O补加至终体系为10 μL。反应条件为37℃，30 min。
（3）重组质粒转化与验证
重组质粒转化：将上述消化后的产物10 μL转化至80 μL大肠杆菌Top10感受态细胞中，涂布于含有终浓度50 μg/mL卡那的LB固体平板中，于37℃恒温培养箱中过夜培养12~16 h。
转化克隆子验证：随机挑取1~2个单克隆菌落，进行测序验证。
3. 单点突变体发酵、诱导表达
取5 μL测序验证成功后的质粒转化至80 μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有终浓度50 μg/mL卡那的LB固体平板中，于37℃恒温培养箱中过夜培养12~16 h。
挑取菌落，经菌落PCR验证正确后，接种于含有终浓度50 μg/mL卡那的LB培养基中，装液量为10 mL/50 mL，于37℃摇床，200 rpm培养12~16 h，获得种子液。
以初始OD600=0.1的接种量将种子液转接至含有终浓度50 μg/mL卡那的LB培养基中，装液量为100 mL/250 mL，于37℃摇床，200 rpm培养至OD600=0.6~0.8，加入终浓度为0.04 mmol/L的IPTG，在16℃，200 rpm摇床中培养16 h进行诱导表达。
取相同OD的发酵菌液，在4℃条件下，6000 rpm离心5 min，用15 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗菌一次，再用10 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体。在冰水浴条件下，使用超声破碎细胞仪破碎细胞15 min（工作3 s，间隔3 s），4℃条件下，10000 rpm离心30 min，用0.22 μm的滤膜进行过滤，从而获得各突变体的发酵上清液（即粗酶液）。说明：所有突变体都是在同一条件下进行活化、转接、诱导，且收菌破碎条件一致。
实施例2 果胶裂解酶PMGL-Ba耐热单点突变体筛选
对以上63个单点突变体，通过测量其发酵上清液在65℃下热处理30 min后的残余酶活，与野生型进行对比，进而筛选出热稳定性提高的单点突变体。最终获得18个热稳定性提高的单点突变体（表1）。
果胶裂解酶PMGL-Ba酶活测定方法：酶活测定采用540 nm光吸收法，以果胶为底物测定果胶裂解酶PMGL-Ba的酶活，一个酶活力单位指在pH 8.0、60℃的条件下，1 min内产生1μmoL还原糖的反应效力；反应体系在1.5 mL的EP管中加入190 μL的底物溶液，所述底物溶液为0.5%的果胶溶液，恒温混匀仪中60℃预热5 min，加入10 μL适当稀释的酶液，反应10min，立即加入300 μL的DNS溶液，煮沸5 min终止反应；取200 μL反应后的溶液在540 nm处测量其吸光度值。
果胶裂解酶PMGL-Ba残余酶活测定方法：取100 μL发酵上清液（或纯酶液）于65℃下热处理30 min，测定其酶活，通过将热处理后的酶活与热处理前的酶活相比，从而得出各突变体的残余酶活，与野生型进行比较，获得各突变体的相对残余酶活，见表1。由于相对残余酶活和热稳定性是正相关，因此，表1中的单点突变体的热稳定性均高于野生型。
表1 单点突变体发酵上清液在65℃下热处理30 min后的相对残余酶活
实施例3 果胶裂解酶PMGL-Ba组合突变体的构建
将实施例2中的18个热稳定性提高的单点突变体进行随机组合，通过实施例1所述突变体构建、诱导表达技术，实施例2所述突变体热稳定性测定方法，获得了14个组合突变体（表2）；该14个组合突变体在65℃下热处理30 min后的相对残余酶活，见表2。由于相对残余酶活和热稳定性是正相关，因此，表2中的组合突变体的热稳定性均高于野生型。
表2 组合突变体发酵上清液在65℃下热处理30 min后的相对残余酶活
实施例4 部分果胶裂解酶PMGL-Ba组合突变体的热稳定性测定
1. 组合突变体纯化
通过镍柱亲和层析重力柱对果胶裂解酶PMGL-Ba组合突变体进行纯化。发酵上清液上样量为10 mL；首先用缓冲液A（20 mmol/L Tris/HCl、500 mmol/L NaCl、pH=7.5）进行平衡；其次用15 mL30%缓冲液B（20 mmol/L Tris/HCl、500 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑、pH=7.5）进行杂蛋白洗脱；最后用15 mL 50%缓冲液B进行目的蛋白洗脱，利用SDS-PAGE电泳进行检测，从而获得纯化后的果胶裂解酶PMGL-Ba组合突变体，记为纯酶。
2. 组合突变体半衰期测定
将组合突变体置于75℃和80℃下孵育不同的时间，分别测定其在不同孵育时间段的酶活，从而获得其在各温度条件下，酶活损失一半的时间，即半衰期。结果如图1～图3及表3所示，与野生型相比，组合突变体P36、P47和P48在75℃下的半衰期由原来的10.48 min分别提高至779.05 min、613.95 min和716.73min，分别提高了大约74倍、59倍和68倍，在80℃下的半衰期由原来的3.03 min分别提高至127.92 min、91.43 min和123.52min，分别提高了大约42倍、30倍和41倍。
表3 组合突变体纯酶在75℃下和80℃下的半衰期
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体，其特征在于：所述果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1经如下任意一种突变而得：
S361N、Q35P/S361N、S361N/R310L、S361N/K360Y、S361N/R340W、S361N/V195I、Y357F/S361N/R310L、R310L/K360Y/S361N、K360Y/S361N/Y357F、R310L/R340W/Y357F/S361N、R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N、R11H/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N、R11H/Q35P/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N、R11H/S115P/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N或R11H/Q35P/S115P/V195I/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N；
其中，所述突变体R11H/Q35P/S115P/V195I/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述的热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：
编码突变体R11H/Q35P/S115P/V195I/R310L/R340W/Y357F/K360Y/S361N的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.权利要求1所述热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体相关的生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
（a）含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒；
（b）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组表达载体；
（c）含有（a）中所述表达盒的重组表达载体；
（d）含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物；
（e）含有（a）中所述表达盒的重组微生物；
（f）含有（b）或（c）中所述重组表达载体的重组微生物。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：
（b）、（c）中所述重组表达载体的出发载体为pET系列的载体或pPICZα载体；
（d）、（e）、（f）中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物或酵母。
6.一种固定化酶，其特征在于：含有权利要求1所述的热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体。
7.权利要求1所述热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体、权利要求2～3任一项所述核酸分子、权利要求4～5任一项所述生物材料或权利要求6所述固定化酶的应用，其特征在于：为下述应用之一：
1）在制备热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体中的应用；
2）在降解果胶中的应用；
3）在造纸中的应用。
8.一种获得权利要求1所述的热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：通过设计含有突变位点的引物对编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的果胶裂解酶PMGL-Ba的基因进行定点突变后表达，得到权利要求1所述的热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：设计含有突变位点的引物向编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的果胶裂解酶PMGL-Ba的基因中引入突变，经测序正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，得到权利要求1所述的热稳定的果胶裂解酶PMGL-Ba突变体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410121546.6A CN117645991B (zh) | 2024-01-30 | 2024-01-30 | 一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410121546.6A CN117645991B (zh) | 2024-01-30 | 2024-01-30 | 一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117645991A CN117645991A (zh) | 2024-03-05 |
| CN117645991B true CN117645991B (zh) | 2024-04-19 |
Family
ID=90046372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410121546.6A Active CN117645991B (zh) | 2024-01-30 | 2024-01-30 | 一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117645991B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249363A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-08-13 | 广州博识生物科技有限公司 | 一种热稳定果胶裂解酶 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI571472B (zh) * | 2015-11-02 | 2017-02-21 | 基酵生物科技股份有限公司 | 具耐熱性之果膠裂解酶 |
-
2024
- 2024-01-30 CN CN202410121546.6A patent/CN117645991B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113249363A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-08-13 | 广州博识生物科技有限公司 | 一种热稳定果胶裂解酶 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| peptate lyase[Bacillus licheniformis], GENBANK ACCESSION NO. RCK12359;Ali, I. 等;GENBANK;20180718;FEATURE * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117645991A (zh) | 2024-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108285900B (zh) | 一种重组褐藻胶裂解酶及其构建方法及应用 | |
| CN108118041B (zh) | 一种磷脂酶d突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用 | |
| CN109355276B (zh) | 一种普鲁兰酶突变体及其应用 | |
| CN112391365B (zh) | 一种催化活力提高的淀粉分支酶突变体及其应用 | |
| CN111269907A (zh) | 一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用 | |
| CN112899258B (zh) | 一种耐热性β-甘露聚糖酶突变体ManAK-10及其编码基因和应用 | |
| CN106801046B (zh) | 热稳定性提高的酸性普鲁兰酶突变体及其编码基因和应用 | |
| CN113684198B (zh) | 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2 | |
| CN108118036A (zh) | 新型葡萄糖氧化酶突变体 | |
| CN117645991B (zh) | 一种热稳定的果胶裂解酶突变体及其制备方法 | |
| CN110184259B (zh) | 一种厌氧芽孢杆菌来源普鲁兰酶突变体及其应用 | |
| CN111926001A (zh) | 具有高热稳定性的多聚半乳糖醛酸酶突变体t316c/g344c及其基因和应用 | |
| CN111394374A (zh) | 一种编码纤维素酶家族GH30的纤维素酶基因gk2691及其应用 | |
| CN107779443B (zh) | 纤维二糖水解酶突变体及其应用 | |
| CN108823186B (zh) | 一种玉米淀粉降解能力提高的嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用 | |
| CN111187764A (zh) | 一种深海来源的壳聚糖酶csn5及其编码基因和应用 | |
| CN112921025B (zh) | 一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN110592119A (zh) | 一种来源于类芽孢杆菌新型普鲁兰酶及其基因与应用 | |
| CN116064616A (zh) | 一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用 | |
| CN115806963A (zh) | 一种褐藻酸裂解酶突变体及其制备方法与应用以及一种重组表达载体和重组表达菌株 | |
| CN112301014B (zh) | 一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用 | |
| CN117965511A (zh) | 一种热稳定性提高的果胶裂解酶突变体及其制备方法 | |
| CN114606216A (zh) | 一种表达量提高的α-淀粉酶突变体Q441N/N442H及其编码基因和应用 | |
| CN108220268B (zh) | 一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌 | |
| CN108913677B (zh) | 一种定点突变改造的碱性普鲁兰酶及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |