CN108220268B

CN108220268B - 一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌

Info

Publication number: CN108220268B
Application number: CN201711292326.6A
Authority: CN
Inventors: 王方华; 王永华; 张慧; 杨博; 蓝东明
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2020-05-22
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN108220268A

Abstract

本发明公开了一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌，其氨基酸序列为SEQ ID No:2；脂肪酶突变体的基因序列为SEQ ID No:4；将所述基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。以橄榄油乳化法测定突变体的酶活及最适反应温度，突变体的酶活力较野生型提高了2倍以上，同时最适反应温度由原来的40℃提高到55℃。

Description

一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域,具体地说涉及利用分子生物学技术获得酶活力及最适温度提高的禾谷镰胞菌脂肪酶突变体。

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3)不仅可催化油脂水解,也能催化酯合成、转酯等反应,被广泛地应用于洗涤剂、添加剂、食品、制药、造纸和生物能源等领域。脂肪酶现已成为市场上的第三大工业用酶。从二十世纪开始,美国等国家就开展了对脂肪酶的研究，并不断推出市场化产品。然而，国内对脂肪酶的研究起步较晚，在脂肪酶开发、发酵菌种、酶学性质、酶活性以及应用效果等方面与国外的先进技术有很大的差距，不仅不利于新型酶蛋白的开发，更影响了其下游的产业化应用及市场化发展。因此，急需开发新的酶学性质优良的脂肪酶，提高应用效果，并降低生产成本，从而促进脂肪酶的广泛应用。

酶学特性是影响脂肪酶应用的关键因素，其中以酶活力尤为重要。筛选获得更高活力的脂肪酶突变体一直是本领域的研究热点。目前，寻找和开发酶学性质优良的脂肪酶主要途径有两个:一是筛选产新型酶的微生物；二是通过定向进化的方法对现有酶蛋白进行适当的蛋白质工程改造。这两种方法其共同的缺点是工作量大、周期长、随机性强，往往很难筛选到理想菌株。

蛋白质理性设计是近年来新兴起的改变酶自身性质的有利工具，它建立在人们对酶结构一功能关系和催化机理的了解上，对选定的位点进行突变，从而优化酶分子的各种性质。随着结构生物学、分子动力学模拟等领域的发展，基于理性设计的蛋白质工程改造已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面(Trends Biotechnol,2002,20(10):433-437)。

发明人在前期研究中成功构建了禾谷镰胞菌(Fusarium graminearum)脂肪酶GZEL的大肠杆菌重组表达菌株及酶蛋白的制备方法(Int.J.Mol.Sci.2017,18(7):1535；中国发明专利201710375132.6)，酶学性质测定结果表明该酶具有广泛的底物选择性，可应用于多种工业领域，但该酶的活力和反应温度参数仍不是很理想。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供酶活力及最适温度提高的禾谷镰胞菌脂肪酶突变体。本发明以禾谷镰胞菌脂肪酶基因为模板,利用蛋白质理性设计技术设计突变体，改造获得了酶活力及最适温度同时提高的脂肪酶突变体,进一步提高了该酶的应用范围与催化效率。

本发明的技术方案如下：

本发明脂肪酶突变体由氨基酸序列为SEQ ID No.1(GenBank:EYB32950.1)的禾谷镰胞菌脂肪酶作为亲本，在此基础上，将284-334位点氨基酸(AGGISWRRYRSAKRESISERATMTDAELEKKLNSYVEMDKEYIKTHASRSS)删除，同时，将277-283位点的氨基酸由原来的QATDACS替换为GLIGTCL，以最终得到突变体，其氨基酸序列为SEQID No:2。

编码上述脂肪酶突变体的基因，其核酸序列为SEQID No:4。

一种重组基因工程菌，将上述基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。

优选地，所述表达载体为pFL-B62cl、pFL-B13cl、pSUMO、pMAL、pGEX、pPIC9K、pPICZα、pPIC3.5K、pPICZ或pYDI。

优选地，所述细胞为大肠杆菌、毕赤巴斯德酵母或酿酒酵母的感受态细胞。

优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21Star(DE3)plysS。

以构建得到的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组脂肪酶。以橄榄油乳化法测定突变体的酶活及最适反应温度。酶的最适温度通过将酶在相同的标准条件下采用标准的橄榄油乳化法来测定催化活力，酶催化活力最高时的反应温度即为该酶的最适温度。结果表明相比于野生型，突变体的酶活力提高了2倍以上，同时最适反应温度由原来的40℃提高到55℃。所述的脂肪酶突变体可应用于洗涤剂、添加剂、食品、制药、造纸或生物能源等工业生产中。

附图说明

图1为脂肪酶突变体与野生型相对酶活一pH变化曲线。

图2为脂肪酶突变体与野生型相对酶活一温度变化曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1：脂肪酶GZEL突变体表达载体及表达菌株的构建

(1)参照禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)脂肪酶GZEL完整氨基酸序列(GenBank：EYB32950.1)，通过信号肽预测分析软件，对其信号肽进行准确预测并从完整序列中进行删除，获得脂肪酶GZEL成熟肽编码序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)根据(1)所得氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性设计基因编码序列，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。在序列上游引入EcoR I，下游引入Xho I酶切位点，所得脂肪酶GZEL基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

(3)将(2)所合成的脂肪酶GZEL基因用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对纯化的基因片段和质粒pFL-B62cl进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过EcoR I和XhoI双酶切鉴定及基因测序，获得野生型GZEL的pFL-B62cl-GZEL重组质粒；

(4)采用两步重叠延伸PCR方法构建本发明所述突变体，首先进行引物全长的拼接，

然后以含有目的基因的质粒作为模板进行扩增。反应条件如下：

反应条件1：

其中上游引物1和下游引物1序列为：

上游引物1：TTGCATTACTTTCAAGCCACGGATGCCTGTTCACACCACCACCACCAC

下游引物1：ACTTAATTAACATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGAACAGGCATCCGT

PCR扩增条件：98℃，3min；98℃，10s，55℃，15s，72℃，10s，20个循环；

72℃，3min。扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化得到全长引物。

反应条件2：

PCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s，55℃，15s，72℃，7min，32个循环；72℃，3min。

PCR产物利用DNA纯化试剂盒进行产物纯化得到脂肪酶突变基因。

用Dpn I酶切消化模板质粒，Dpn I酶切消化体系如下：

将Dpn I酶切消化体系置于37℃条件下，2h。将消化产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过EcoR I和Xho I双酶切鉴定及基因测序，获得pFL-B62cl-GZEL-突变体质粒1。

(5)再次利用重叠延伸PCR方法构建本发明所述突变体，引入氨基酸替换突变(将277-283位点的氨基酸由原来的QATDACS替换为GLIGTCL)。反应条件如下：

其中上游引物2和下游引物2序列为：

上游引物2：

TTAGATATAGATGCCCATTTGCATTACTTTGGGTTAATTGGGACATGTCTTCACCACC下游引物2：

TAATTAACATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGACATGTCCCAATTAACCCAAAGTAAPCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s，55℃，15s，72℃，7min，32个循环；72℃，3min。PCR产物利用DNA纯化试剂盒进行产物纯化得到脂肪酶突变体基因。

用Dpn I酶切消化模板质粒，消化体系和反应条件同上。将消化产物转化至E.coliDH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过EcoR I和XhoI双酶切鉴定及基因测序，最终获得了本发明所述pFL-B62cl-GZEL突变体基因质粒。

(6)将(5)所得的重组质粒转化大肠杆菌BL21Star(DE3)plysS感受态细胞，挑选阳性克隆并测序验证，即获得重组pFL-B62cl-GZEL突变体的BL21Star(DE3)plysS大肠杆菌表达菌株。

实施例2：野生型脂肪酶GZEL及其突变体重组表达菌株发酵及重组蛋白纯化

(1)将重组大肠杆菌脂肪酶野生型及突变体表达菌株分别接种于含氨苄青霉素100μg/mL的种子培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；

(2)将(1)中所述种子液按5％的接种量接种到LB液体发酵培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度10mM，于20℃，200r/min条件下诱导培养24h；

(3)将(2)中所得发酵液离心(4000rpm,10min)，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心(10000rpm,10min)，取上清，即为制备得到的脂肪酶GZEL粗酶液；

(4)将(3)中所得脂肪酶粗酶液，用0.45μm的滤膜抽滤。滤液利用镍柱亲和层析柱纯化，流速4ml/min，最后用含10-500mM咪唑的磷酸缓冲液(pH7.4)梯度洗脱，目标蛋白在150mM咪唑浓度处被洗脱下来。将洗脱下来的目的蛋白过G-25脱盐柱后，上样DEAE层析柱，用含有200mM NaCl的磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱得到目的蛋白。

实施例3:脂肪酶酶学性质分析

(1)脂肪酶活力的测定方法

野生型脂肪酶GZEL及突变体脂肪酶活力的测定均采用橄榄油乳化法测得。橄榄油底物乳化液：按橄榄油与4％聚乙烯醇溶液体积比为1:3的比例，将定量橄榄油加入至一定量4％聚乙烯醇溶液中，用高速均质机均质，均质完全后使用。脂肪酶活力定义为：在特定温度与pH条件下，每分钟内蛋白酶催化水解橄榄油底物乳化液底物产生1微摩尔(μmol)游离脂肪酸所需的酶量即为一个脂肪酶活力单位。用U表示。计算出比酶活(U/mg)。

(2)酶最适反应pH测定

野生型及突变体脂肪酶活力的最适反应pH条件的测定方法如下：按照以上的脂肪酶活力的测定方法，固定反应温度条件为40℃，以橄榄油底物乳化液为底物，加入不同pH值的缓冲液(4.0～8.0)(不同pH缓冲液：pH4.0-5.0，0.05M柠檬酸-0.05M柠檬酸钠；pH6.0-7.0，0.05M磷酸二氢钠-0.05M磷酸氢二钠；pH8.0，0.05M Tris-HCl；pH9.0-10.0，0.05MGly-NaOH)，使酶在不同pH环境条件下进行反应，测定不同pH环境条件下各突变体酶液的脂肪酶活力。对照组和样品组均做三组平行。以pH值为横坐标，对应的酶比活力为纵坐标作图。以活力最高点为100％，计算不同pH条件下脂肪酶的相对酶活。结果如图1所示，野生型脂肪酶与突变体的最适作用pH均为7.0，位点突变未造成最适反应pH的改变。

(3)酶最适反应温度测定

野生型及突变体脂肪酶的最适反应温度条件测定方法如下：按照上述脂肪酶活力的测定方法，在已测定出的酶的最适反应pH条件下，以橄榄油乳化液为底物，加入相对应pH值的缓冲液，将反应体系置于不同温度条件下反应(25.0℃～65.0℃)，测定不同反应温度条件下突变体及野生型酶液的脂肪酶活力。对照组和样品组均做三组平行。以活力最高点为100％，计算不同温度条件下脂肪酶的相对酶活。以温度设定值为横坐标，相对活力为纵坐标作图。结果如图2所示，野生型脂肪酶的最适反应温度为30-40℃，而突变体最适作用温度为55℃，比野生型高出15℃。在最适温度40℃和pH＝7条件下测定得到野生型酶活力为153.37U/mg，而在突变体的最适作用条件下(55℃，pH7.0)，酶活力为324.24U/mg，突变体的比酶活比野生型提高了2倍以上，从而说明本发明获得的脂肪酶突变体活力得到显著提高。

综上所述，与野生型相比，本发明获得的脂肪酶突变体在没有改变其最适作用pH的情况下，显著提高了其最适反应温度及其自身酶活力，更适合应用于洗涤剂、添加剂、食品、制药、造纸、或生物能源等工业领域，具有广阔的市场空间。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110> 华南理工大学

<120> 一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Pro Leu Ser Val Glu Glu Tyr Ala Lys Ala Leu Asp Glu Arg Ala

1 5 10 15

Val Ser Val Ser Thr Thr Asp Phe Gly Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gln

20 25 30

His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Pro Ala Gly Ala Lys

35 40 45

Val Thr Cys Ser Gly Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Ser Asn Gly Ala

50 55 60

Thr Ile Val Ala Ser Phe Thr Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr

65 70 75 80

Val Ala Thr Asp Pro Thr Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly

85 90 95

Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Asp Gln Asp

100 105 110

Asp Cys Ser Leu Thr Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln Asn

115 120 125

Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ala Val Ala Lys Ala

130 135 140

Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Lys Val Val Ser Val Gly His Ser Leu

145 150 155 160

Gly Gly Ala Val Ala Thr Leu Ala Gly Ala Asn Leu Arg Val Gly Gly

165 170 175

Thr Pro Leu Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Thr

180 185 190

Gln Leu Ala Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Phe Arg Val

195 200 205

Thr Asn Ala Lys Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe Gly

210 215 220

Tyr Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Ser Gly Ser Gly Gly Asp

225 230 235 240

Lys Ile Asp Tyr Thr Ile Asn Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala

245 250 255

Asn Leu Gln Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Asp Ala His

260 265 270

Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Ser Ala Gly Gly Ile Ser

275 280 285

Trp Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Lys Arg Glu Ser Ile Ser Glu Arg Ala

290 295 300

Thr Met Thr Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser Tyr Val Glu

305 310 315 320

Met Asp Lys Glu Tyr Ile Lys Thr His Ala Ser Arg Ser Ser

325 330

<210> 2

<211> 283

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Pro Leu Ser Val Glu Glu Tyr Ala Lys Ala Leu Asp Glu Arg Ala

1 5 10 15

Val Ser Val Ser Thr Thr Asp Phe Gly Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gln

20 25 30

His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Pro Ala Gly Ala Lys

35 40 45

Val Thr Cys Ser Gly Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Ser Asn Gly Ala

50 55 60

Thr Ile Val Ala Ser Phe Thr Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr

65 70 75 80

Val Ala Thr Asp Pro Thr Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly

85 90 95

Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Asp Gln Asp

100 105 110

Asp Cys Ser Leu Thr Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln Asn

115 120 125

Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ala Val Ala Lys Ala

130 135 140

Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Lys Val Val Ser Val Gly His Ser Leu

145 150 155 160

Gly Gly Ala Val Ala Thr Leu Ala Gly Ala Asn Leu Arg Val Gly Gly

165 170 175

Thr Pro Leu Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Thr

180 185 190

Gln Leu Ala Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Phe Arg Val

195 200 205

Thr Asn Ala Lys Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe Gly

210 215 220

Tyr Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Ser Gly Ser Gly Gly Asp

225 230 235 240

Lys Ile Asp Tyr Thr Ile Asn Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala

245 250 255

Asn Leu Gln Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Asp Ala His

260 265 270

Leu His Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu

275 280

<210> 3

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccccactta gtgttgaaga atatgctaag gctctggacg aacgagctgt atctgtatcc 60

acaacagact tcggtaactt caagttttac atccagcacg gggctgcagc atattgcaac 120

tcagaagctc ctgctggtgc aaaagtaaca tgttccggaa atggttgtcc aactgtacaa 180

tccaacggag ctacaattgt cgcatctttc acaggaagta agacgggaat cggaggttac 240

gttgcaacag atcctactag aaaggaaatc gtggtttcat tccgtggttc cataaacatc 300

aggaactggc tgactaatct tgacttcgac caggacgact gctctctaac ttccggatgt 360

ggagttcatt ctggtttcca gaacgcttgg aatgagatct ctgcagctgc tactgcagca 420

gttgcaaaag caagaaaagc taacccatct tttaaggtcg tttccgttgg tcacagtcta 480

ggaggagctg ttgctacttt agctggagct aatctaagag ttggtggtac tcctttggat 540

atatacacct acggttcccc aagagtcggt aatactcaat tggctgcttt tgtctcaaac 600

caagccggag gtgaatttag agtgactaac gctaaggacc ctgttcctag attgccaccc 660

ttgatttttg gttacaggca cacctctccc gaatattggc tttctggttc aggtggggat 720

aaaattgatt acaccattaa cgatgtgaag gtgtgcgagg gcgccgccaa tttacaatgt 780

aatggcggga ccttgggctt agatatagat gcccatttgc attactttca agccacggat 840

gcctgttcag ccggcggcat ttcatggaga agatatcgat cagccaaaag ggaatctatt 900

tctgaacgtg ccaccatgac cgatgccgag ttggagaaaa aactgaatag ttatgtcgag 960

atggataagg agtatattaa gacgcatgcc agtcgttcta gt 1002

<210> 4

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccccactta gtgttgaaga atatgctaag gctctggacg aacgagctgt atctgtatcc 60

acaacagact tcggtaactt caagttttac atccagcacg gggctgcagc atattgcaac 120

tcagaagctc ctgctggtgc aaaagtaaca tgttccggaa atggttgtcc aactgtacaa 180

tccaacggag ctacaattgt cgcatctttc acaggaagta agacgggaat cggaggttac 240

gttgcaacag atcctactag aaaggaaatc gtggtttcat tccgtggttc cataaacatc 300

aggaactggc tgactaatct tgacttcgac caggacgact gctctctaac ttccggatgt 360

ggagttcatt ctggtttcca gaacgcttgg aatgagatct ctgcagctgc tactgcagca 420

gttgcaaaag caagaaaagc taacccatct tttaaggtcg tttccgttgg tcacagtcta 480

ggaggagctg ttgctacttt agctggagct aatctaagag ttggtggtac tcctttggat 540

atatacacct acggttcccc aagagtcggt aatactcaat tggctgcttt tgtctcaaac 600

caagccggag gtgaatttag agtgactaac gctaaggacc ctgttcctag attgccaccc 660

ttgatttttg gttacaggca cacctctccc gaatattggc tttctggttc aggtggggat 720

aaaattgatt acaccattaa cgatgtgaag gtgtgcgagg gcgccgccaa tttacaatgt 780

aatggcggga ccttgggctt agatatagat gcccatttgc attactttgg gttaattggg 840

acatgtctt 849

Claims

1.一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID No:2。

2.一种编码权利要求1所述脂肪酶突变体的基因，其特征在于，其核酸序列为SEQ IDNo:4。

3.一种含权利要求2所述基因的重组基因工程菌。

4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，将权利要求2所述基因克隆到表达载体上，然后进行细胞转化，获得重组基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述表达载体为pFL-B62cl、pFL-B13cl、pSUMO、pMAL、pGEX、pPIC9K、pPICZα、pPIC3.5K、pPICZ或pYDI。

6.根据权利要求4或5所述的工程菌，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌、毕赤巴斯德酵母或酿酒酵母的感受态细胞。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21Star(DE3)plysS。