CN107245470B - 一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用，方法如下：(1)将脂肪酶GZEL基因克隆到pFL‑B62cl表达载体上，构建得到重组质粒；所述脂肪酶GZEL基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。以获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组脂肪酶。本发明酶来源方便，发酵工艺简单、成本低；本发明同时公开了该酶在植物油酶法脱胶中的应用。将所制备的重组脂肪酶在30℃条件下脱胶反应3h即可将毛油中的磷含量降低到10mg/kg以下，与传统酶法脱胶工艺相比，能降低反应能耗。

Description

一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用

技术领域

本发明涉及生物技术和油脂加工领域，特别涉及一种脂肪酶的制备方法以及该酶在植物油脱胶中的应用。

背景技术

植物油脂中的胶质主要是磷脂混合物，脱胶是植物油精炼中非常重要的一道工序，脱胶效果好坏将直接影响精炼效率和产品质量。若脱胶不完全，则会加重脱色负担，影响油脂质量和精炼经济效益。

酶法脱胶不仅具有反应条件温和、油损耗低、经济环保等优点，而且采用酶法脱胶精炼的植物油含磷低、口感好、贮藏稳定，因此，以酶法脱胶替代传统的水化脱胶和酸法脱胶，是植物油精炼工业的发展趋势。我国是世界上第四大植物油生产国和第一大植物油消费国，在世界植物油生产、消费和进出口贸易中占有重要地位。但是，目前国内用于植物油酶法脱胶的磷脂酶多依赖进口，价格昂贵，限制了酶法脱胶的大规模应用。基于此，研制出具有我国自主产权、低价、优质、通用性强的酶法脱胶用酶具有重要的战略意义。

在脱胶用酶的开发方面，研究的关注点大都集中在磷脂酶上。应用新型磷脂酶进行油脂中磷脂脱除的酶法脱胶技术也得到了越来越多人的关注。磷脂酶A是目前比较常用的脱胶用酶之一，具体又包含了磷脂酶A1(PLA1)和磷脂酶A1(PLA2)。除此之外，磷脂酶C和磷脂酶B也可以用于磷脂的脱除。最早将酶法脱胶用于大工业生产的是德国Lurgi公司，称为“EnzyMax process”。Novozymes公司也推出了该种酶的商品酶

10L，该酶来源于猪的胰脏，属于PLA2。但因其制备数量有限，导致价格昂贵，况且使用时需以钙离子为激活剂，给操作带来极大不便，因此，最终未能得到大规模的推广。随后，Novozymes公司推出Lecitase Novo商品化的脱胶用酶(磷脂酶B)。除此之外，Verenium公司推出了Purifine(商品化的磷脂酶C)，Danisco公司推出了Lysomax Oil(一种类似PLA₂的酰基转移酶)。目前，脂肪酶可用于酶法脱胶的案例还较少，诺维信公司推出的Lecitase Ultra是唯一可商品化用于植物油脱胶的一种脂肪酶。研究发现该酶除了具有脂肪酶活力外，还具有较高的磷脂酶活力，这也是其成功用于脱胶的基础。国内对脱胶用酶的开发，尤其是基于脂肪酶的脱胶用酶开发还处于起步阶段。

GZEL是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)分泌的一种脂肪酶，据报道该酶在由该菌感染农作物导致镰刀菌属感染所致的头部枯萎病Fusarium Head Blight(FHB)中作为一种毒力因子起重要的作用。虽然已有文献报道该酶的表达方法，但是其所采用的是Pichia pastoris KM71真核表达系统，其采用的是甲醇诱导型的表达方式进行表达，因此，该酶的制备周期较长(单单发酵就需要7天的时间)，耗时耗力，导致所产酶的成本较高。

发明内容

本发明目的之一是提供一种可用于酶法脱胶的重组脂肪酶。对于本发明所提及的GZEL脂肪酶，本课题组首次研究发现，该酶除了具有已报道的脂肪酶活性外，还具有较高的磷脂酶活性，具备脱胶用酶的基本条件。

本发明目的之二是提供一种脂肪酶GZEL重组大肠杆菌表达菌株。在研究过程中，我们还发现，在该酶的大肠杆菌重组表达菌株构建方面，载体的类别及表达菌株的选择对于该酶的高效可溶性表达具有重要的影响，往往会导致无活性的包涵体产生。因此，我们对相关的表达载体和表达菌株进行了筛选和优化组合，最终建立了GZEL大肠杆菌高效重组表达的方法。

本发明目的之三是提供所述重组脂肪酶在植物油脱胶中的应用。

基于以上发现，本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株，由下述方法制得：

(1)将脂肪酶GZEL基因克隆到pFL-B62cl表达载体上，构建得到重组质粒；所述脂肪酶GZEL基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。

一种重组脂肪酶，以上述获得的重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组脂肪酶。

所述的重组脂肪酶的制备步骤如下：

(1)将重组大肠杆菌表达菌株接种于含氨苄青霉素的LB液体发酵培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至对数生长期，制备种子液；

(2)将所述种子液按5～10％的接种量接种到LB液体发酵培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度10mM，于20℃，摇瓶条件下诱导培养；

(3)将步骤(2)中所得发酵液离心，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心，取上清，即为重组脂肪酶粗酶液。

所述LB液体发酵培养基成分为：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4。

优选地，将所得重组脂肪酶粗酶液，分别利用镍柱亲和层析、G-25脱盐和DEAE层析纯化，获得电泳纯的重组脂肪酶酶液。

所述的纯化方案中，镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液为含有150mM咪唑的磷酸盐缓冲液(pH7.0)。DEAE层析中所用的洗脱缓冲液为含有200mM NaCl的磷酸盐缓冲液(pH7.0)

所述重组脂肪酶在植物毛油脱胶中的应用，具体包括如下步骤：

(1)将植物油毛油水浴加热至80℃，加入45％柠檬酸，进行均质处理；

(2)将(1)中处理完的毛油冷却至30～60℃，加入NaOH溶液调节体系pH在4～7之间；

(3)按400～2000U/kg植物毛油的比例加入重组脂肪酶，再加入蒸馏水，酶液和蒸馏水的总体积占油重的2％～5％，混合均匀；

(4)在搅拌条件下，30℃～60℃水浴反应，反应时间为0.5～4h；

(5)将脱胶体系升温至70～100℃灭活酶，离心，保留上层油样，完成脱胶。

步骤(1)所述均质处理的条件为：10000r/min均质1min，80℃水浴、500r/min机械搅拌下维持20min。

步骤(5)所述离心条件为4000r/min，离心5min。

步骤(1)所述植物油为大豆油、菜籽油、花生油、棕榈油、葵花籽油、玉米油和米糠油中的一种或两种以上的混合物。

本发明具有如下优点和有益效果：

(1)相比较于已报道的对于该酶的真核酵母重组表达方法，大大节约了生产成本，提高了效率。

(2)本发明采用重组大肠杆菌所产脂肪酶GZEL作为催化剂，酶蛋白发酵工艺简单且成本低；利用该酶进行植物油脱胶可在较低温度下实现与传统商品化脱胶用酶LecitaseUltra同等的脱胶效果，在降低能耗方面优势明显。

附图说明

图1为重组表达GZEL的SDS-PAGE电泳检测结果；泳道1为蛋白Marker；泳道2为破碎后总蛋白；泳道3为破碎后的总蛋白经10000g离心10min所获得的上清样品；泳道4为破碎后的总蛋白经10000g离心10min所获得的沉淀样品；泳道5为镍柱亲和层析中150mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱样品；泳道6为镍柱洗脱样品经G25脱盐柱洗脱样品峰样品；泳道7为脱盐后样品过DEAE层析柱后用含有200mM NaCl的磷酸缓冲液洗脱下来的目的蛋白样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

重组脂肪酶GZEL大肠杆菌表达载体pFL-B62cl-GZEL的构建

(1)参照禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)脂肪酶GZEL完整氨基酸序列(GenBank登录号：AY292529.1)，获得截短的脂肪酶GZEL蛋白编码序列，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示；

(2)根据(1)所得氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性设计基因编码序列，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示。在序列上游引入EcoR I，下游引入BamH I酶切位点，所得脂肪酶GZEL基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

(3)将(2)所合成的脂肪酶GZEL基因用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别对纯化的基因片段和质粒pFL-B62cl进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过EcoR I和BamH I双酶切鉴定及基因测序，结果表明获得了pFL-B62cl-GZEL重组质粒；

(4)将(3)所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，即获得重组pFL-B13cl-GZELShuffle T7大肠杆菌表达菌株。

实施例2

重组脂肪酶GZEL大肠杆菌的诱导表达及纯化

(1)将重组大肠杆菌pFL-B62cl-GZEL Shuffle T7表达菌株接种于含氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；

(2)将(1)中所述种子液按5％的接种量接种到LB液体发酵培养基(NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度10mM，于20℃，200r/min条件下诱导培养24h；

(3)将(2)中所得发酵液离心(4000r/min,10min)，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心(10000r/min,10min)，取上清，即为制备得到的脂肪酶GZEL粗酶液；

(4)将(3)中所得脂肪酶GZEL粗酶液，用0.45μm的滤膜抽滤。滤液利用镍柱亲和层析柱纯化，流速4mL/min，最后用含10-500mM咪唑的磷酸缓冲液(pH7.4)梯度洗脱，目标蛋白在150mM咪唑浓度处被洗脱下来。将洗脱下来的目的蛋白过G-25脱盐柱后，上样DEAE层析柱，用含有200mM NaCl的磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱得到目的蛋白。利用SDS-PAGE电泳对纯化的重组脂肪酶GZEL进行纯度鉴定，结果如附图1。

实施例3

一种使用重组脂肪酶GZEL对大豆毛油脱胶的方法，步骤如下：

用300mL具塞三角瓶准确称取150g大豆油毛油(含磷量为128.5mg/kg)，水浴加热至80℃，加入45％柠檬酸0.18mL，10000r/min均质1min，80℃水浴、500r/min机械搅拌下维持20min；冷却至30℃，加入质量浓度为4％的NaOH溶液调节体系pH在5.0；按2000U/kg大豆毛油的比例加入重组脂肪酶GZEL，再加入蒸馏水，酶液和蒸馏水的总体积占油重的3％，混合均匀；在500r/min搅拌速度下，30℃水浴反应，反应时间为3h；将脱胶体系升温至70℃灭酶，于4000r/min转速下，离心5min，保留上层油样，完成脱胶。油脂中磷含量分析：取一定量上层油样进行含磷量分析。油脂中磷含量分析参照GB/T 5537-2008(钼蓝比色法测定)进行。结果如表1。

实施例4

一种使用重组脂肪酶GZEL对菜籽毛油脱胶的方法

本实施例与实施例3的不同之处在于：用300mL具塞三角瓶准确称取150g菜籽毛油(含磷量为176.3mg/kg)。取上层油相分析含磷量，结果如表1。

实施例5

一种使用重组脂肪酶GZEL对米糠毛油脱胶的方法

本实施例与实施例3的不同之处在于：用300mL具塞三角瓶准确称取150g米糠毛油(含磷量为176.3mg/kg)。取上层油相分析含磷量，结果如表1。

实施例6

一种使用重组脂肪酶GZEL对大豆和米糠来源的混合毛油进行脱胶的方法

本实施例与实施例3的不同之处在于：所称取的150g毛油为大豆毛油和米糠毛油的混合物(1:1)(含磷量为152.4mg/kg)。

实施例7

本实施例与实施例3的不同在于，按与实施例3加入同等比例酶活的商品化Lecitase Ultra(诺维信公司)进行反应。取反应后的上层油相分析含磷量，结果如表1。

实施例8

本实施例与实施例3的不同在于，加入商品化的Lecitase Ultra(诺维信公司)在45℃进行反应。取反应后的上层油相分析含磷量，结果如表1。

表1

实施例	脱胶油中的含磷量(mg/kg)
		实施例3	7.5
实施例4	9.7
		实施例5	10.3
实施例6	9.1
		实施例7	18.5
实施例8	7.6

由表1结果可见，使用本发明的重组脂肪酶GZEL，在30℃条件下反应3h，即可实现对大豆毛油、菜籽毛油、米糠毛油较好的脱胶效果。此外，对于两种毛油的混合物，3h脱胶反应后脱胶油脂中含磷量也可达到10mg/kg以下，表明该酶对不同来源植物毛油的脱胶普适性较好。相反的，使用商品化的Lecitase Ultra在同等温度下脱胶3h后，所获得脱胶油脂中含磷量为18.5mg/kg，远高于本发明所使用脂肪酶GZEL的脱胶结果(7.5mg/kg),而只有在反应温度控制在45℃条件下才能达到跟本发明所用酶同等的脱胶效果(7.6mg/kg)，显现出本发明的重组脂肪酶GZEL在反应温度方面的优势。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南理工大学

<120> 一种脂肪酶重组大肠杆菌表达菌株、重组脂肪酶和应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 334

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 1

Ser Pro Leu Ser Val Glu Glu Tyr Ala Lys Ala Leu Asp Glu Arg Ala

1 5 10 15

Val Ser Val Ser Thr Thr Asp Phe Gly Asn Phe Lys Phe Tyr Ile Gln

20 25 30

His Gly Ala Ala Ala Tyr Cys Asn Ser Glu Ala Pro Ala Gly Ala Lys

35 40 45

Val Thr Cys Ser Gly Asn Gly Cys Pro Thr Val Gln Ser Asn Gly Ala

50 55 60

Thr Ile Val Ala Ser Phe Thr Gly Ser Lys Thr Gly Ile Gly Gly Tyr

65 70 75 80

Val Ala Thr Asp Pro Thr Arg Lys Glu Ile Val Val Ser Phe Arg Gly

85 90 95

Ser Ile Asn Ile Arg Asn Trp Leu Thr Asn Leu Asp Phe Asp Gln Asp

100 105 110

Asp Cys Ser Leu Thr Ser Gly Cys Gly Val His Ser Gly Phe Gln Asn

115 120 125

Ala Trp Asn Glu Ile Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ala Val Ala Lys Ala

130 135 140

Arg Lys Ala Asn Pro Ser Phe Lys Val Val Ser Val Gly His Ser Leu

145 150 155 160

Gly Gly Ala Val Ala Thr Leu Ala Gly Ala Asn Leu Arg Val Gly Gly

165 170 175

Thr Pro Leu Asp Ile Tyr Thr Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Thr

180 185 190

Gln Leu Ala Ala Phe Val Ser Asn Gln Ala Gly Gly Glu Phe Arg Val

195 200 205

Thr Asn Ala Lys Asp Pro Val Pro Arg Leu Pro Pro Leu Ile Phe Gly

210 215 220

Tyr Arg His Thr Ser Pro Glu Tyr Trp Leu Ser Gly Ser Gly Gly Asp

225 230 235 240

Lys Ile Asp Tyr Thr Ile Asn Asp Val Lys Val Cys Glu Gly Ala Ala

245 250 255

Asn Leu Gln Cys Asn Gly Gly Thr Leu Gly Leu Asp Ile Asp Ala His

260 265 270

Leu His Tyr Phe Gln Ala Thr Asp Ala Cys Ser Ala Gly Gly Ile Ser

275 280 285

Trp Arg Arg Tyr Arg Ser Ala Lys Arg Glu Ser Ile Ser Glu Arg Ala

290 295 300

Thr Met Thr Asp Ala Glu Leu Glu Lys Lys Leu Asn Ser Tyr Val Glu

305 310 315 320

Met Asp Lys Glu Tyr Ile Lys Thr His Ala Ser Arg Ser Ser

325 330

<210> 2

<211> 1002

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 1

<400> 2

tccccactta gtgttgaaga atatgctaag gctctggacg aacgagctgt atctgtatcc 60

acaacagact tcggtaactt caagttttac atccagcacg gggctgcagc atattgcaac 120

tcagaagctc ctgctggtgc aaaagtaaca tgttccggaa atggttgtcc aactgtacaa 180

tccaacggag ctacaattgt cgcatctttc acaggaagta agacgggaat cggaggttac 240

gttgcaacag atcctactag aaaggaaatc gtggtttcat tccgtggttc cataaacatc 300

aggaactggc tgactaatct tgacttcgac caggacgact gctctctaac ttccggatgt 360

ggagttcatt ctggtttcca gaacgcttgg aatgagatct ctgcagctgc tactgcagca 420

gttgcaaaag caagaaaagc taacccatct tttaaggtcg tttccgttgg tcacagtcta 480

ggaggagctg ttgctacttt agctggagct aatctaagag ttggtggtac tcctttggat 540

atatacacct acggttcccc aagagtcggt aatactcaat tggctgcttt tgtctcaaac 600

caagccggag gtgaatttag agtgactaac gctaaggacc ctgttcctag attgccaccc 660

ttgatttttg gttacaggca cacctctccc gaatattggc tttctggttc aggtggggat 720

aaaattgatt acaccattaa cgatgtgaag gtgtgcgagg gcgccgccaa tttacaatgt 780

aatggcggga ccttgggctt agatatagat gcccatttgc attactttca agccacggat 840

gcctgttcag ccggcggcat ttcatggaga agatatcgat cagccaaaag ggaatctatt 900

tctgaacgtg ccaccatgac cgatgccgag ttggagaaaa aactgaatag ttatgtcgag 960

atggataagg agtatattaa gacgcatgcc agtcgttcta gt 1002

Claims (8)

1.一种重组脂肪酶在植物油脱胶中的应用，其特征在于，以重组大肠杆菌表达菌株为发酵菌株进行液体发酵，制备重组脂肪酶；所述重组大肠杆菌表达菌株由下述方法制得：

(1)将脂肪酶GZEL基因克隆到pFL-B62cl表达载体上，构建得到重组质粒；所述脂肪酶GZEL基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)将所得的重组质粒转化大肠杆菌Shuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆，获得重组大肠杆菌表达菌株。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组脂肪酶的具体制备步骤如下：

①将重组大肠杆菌表达菌株接种于含氨苄青霉素的种子培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至对数生长期，制备种子液；

②将所述种子液按5～10％的接种量接种到LB液体发酵培养基中，于37±2℃，摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至终浓度10mM，于20℃，摇瓶条件下诱导培养；

③将步骤②中所得发酵液离心，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心，取上清，即为重组脂肪酶粗酶液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所得重组脂肪酶粗酶液，分别经镍柱亲和层析、G-25脱盐柱纯化和DEAE层析纯化，获得电泳纯的重组脂肪酶酶液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述镍柱亲和层析所用的洗脱缓冲液为含有150mM咪唑的磷酸盐缓冲液；DEAE层析中所用的洗脱缓冲液为含有200mM NaCl的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(a)将植物油毛油水浴加热至80℃，加入45％柠檬酸，进行均质处理；

(b)将(a)中处理完的毛油冷却至30～60℃，加入NaOH溶液调节体系pH在4～7之间；

(c)按400～2000U/kg植物毛油的比例加入重组脂肪酶，再加入蒸馏水，酶液和蒸馏水的总体积占油重的2％～5％，混合均匀；

(d)在搅拌条件下，30℃～60℃水浴反应，反应时间为0.5～4h；

(e)将脱胶体系升温至70～100℃灭活酶，离心，保留上层油样，完成脱胶。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(a)所述均质处理的条件为：10000r/min均质1min，80℃水浴、500r/min机械搅拌下维持20min。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(e)所述离心条件为4000r/min，离心5min。

8.根据权利要求1～4任意一项所述的应用，其特征在于，所述植物油为大豆油、菜籽油、花生油、棕榈油、葵花籽油、玉米油和米糠油中的一种或两种以上的混合物。

Images