CN112662644B

CN112662644B - 一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112662644B
Application number: CN202110067082.1A
Authority: CN
Inventors: 王方华; 王永华; 闵雪珂; 杨博; 蓝东明
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112662644A

Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，公开了一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)突变体及其应用，所述突变体是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的亲本序列基础上突变所得，即亲本序列中第60位的天冬氨酸和第67位的丝氨酸中的至少一个突变为除与自身同一生化特性类别氨基酸以外的其他任意一种氨基酸。本发明获得的GDPD突变体可用于催化溶血磷脂获得高纯度溶血磷脂酸，相较于野生型，突变体能够达到水解溶血磷脂只生成单一溶血磷脂酸的目的，降低了溶血磷脂酸制备过程中的纯化难度，进一步提升了该酶在药物、食品、化妆品等领域的利用价值。

Description

一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及利用分子生物学技术获得可用于高纯度溶血磷脂酸酶解制备的GDPD突变体及其大肠杆菌重组表达制备方法。

背景技术

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是一种结构简单、具有多种生物活性的磷脂介质。近年来研究发现，LPA在体内信号传递过程中起着十分重要的作用,是一种多功能的“磷脂信使”。通过G蛋白耦联受体影响靶细胞的功能，激活多种细胞信号通路。其生物学效应包括：刺激细胞增殖和生存；促进血小板聚集；增加血管内皮细胞的通透性、血管平滑肌细胞收缩和肿瘤细胞浸润等。在医疗诊断领域，由于LPA在多种重大疾病如心脑血管病、肾病、肿瘤的发生、发展中亦发挥重要作用,溶血磷脂酸可以作为癌症早期诊断的分子标志物。在药剂领域，溶血磷脂酸可用于调控炎症因子例如IL-1和/或IL-6的表达，减轻炎症反应；并可以促进成纤维细胞分泌胶原、促进表皮增殖和再生。目前，市面上已有以溶血磷脂酸作为其主要成分的拮炎剂出售。

目前，溶血磷脂酸的制备方法主要是通过磷脂酶A1、A2水解大豆磷脂的方式制备。除此之外，也可从一些植物如拟南芥中提取。但无论是磷脂酶水解法还是植物提取法，在制备过程中都会产生大量杂质，进而影响下一步的纯化工作，而在医药领域，对于该成分的纯度要求较高，因此，导致溶血磷脂酸价格较为昂贵。因此，急需开发新的制备方法，简化纯化制备流程，以降低生产成本，从而促进溶血磷脂酸的广泛应用。

甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD；EC 3.1.4.46)是一类催化甘油磷酸二酯的3′–5′磷酸二酯键水解的酶。发明人在前期研究中(Wang FH,Lai LH,Liu YH,Yang B,Wang YH*.Expression and Characterization of a Novel GlycerophosphodiesterPhosphodiesterase from Pyrococcus furiosus DSM 3638That PossessesLysophospholipase D Activity.Int.J.Mol.Sci.2016,17(6),831.)成功构建了来自激烈热球菌(Pyrococcus furiosusDSM 3638)的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(pfGDPD)的大肠杆菌重组表达菌株及酶蛋白的制备方法，该酶除了水解甘油磷酸二酯底物外，还表现出溶血磷脂的水解活性。但在水解溶血磷脂底物的过程中除了产生溶血磷脂酸外，还生成了一些甘油磷酸二酯、甘油磷酸等杂质，给后续LPA的分离纯化和高纯度制备带来较大困难。

发明内容

本发明解决的技术问题是提高pfGDPD在水解溶血磷脂时的产物溶血磷脂酸的纯度。本发明以pfGDPD基因为模板，利用蛋白质理性设计技术设计突变体，改造获得了单一产溶血磷脂酸的pfGDPD突变体，进一步提高了该酶的应用范围。

本发明的技术方案如下：

一种GDPD突变体，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的亲本序列基础上突变第60位的天冬氨酸或第67位的丝氨酸所得。其中第60位和第67位中的至少一个被突变为除与自身同一生化特性类别氨基酸以外的其他任意一种氨基酸。

一种GDPD突变体，其氨基酸序列为SEQID NO:2或SEQID NO:3。

一种编码所述GDPD突变体的基因，其核酸序列为SEQID NO:5或SEQID NO:6。

一种所述基因的重组基因工程菌，将所述基因克隆到表达载体pET-21a、pET28a或pET32a上，转化大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，获得重组基因工程菌。以获得的重组基因工程菌为发酵菌株进行液体发酵，制备重组GDPD。以核磁共振的方法测定GDPD对于溶血磷脂的水解情况。结果表明相比于野生型，突变体仅产生溶血磷脂酸产物，而不产生甘油磷酸二酯等杂质。所述的GDPD突变体可应用于医疗、制药、美容等领域中。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明获得的pfGDPD突变体，显著提高了其水解溶血磷脂底物产生溶血磷脂酸的纯度，相较于野生型，突变体能够达到水解溶血磷脂只生成单一溶血磷脂酸的目的。所述的GDPD突变体更适合应用于食品、药品、化妆品等工业领域，具有广阔的市场空间。

附图说明

图1为pfGDPD突变体蛋白纯化SDS-PAGE检测结果图。

图2为pfGDPD野生型水解溶血磷脂的核磁共振图谱。

图3为pfGDPDD60A突变体水解溶血磷脂的核磁共振图谱。

图4为pfGDPDD60A突变体水解溶血磷脂的质谱图。

图5为pfGDPDS67A突变体水解溶血磷脂的核磁共振图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1：甘油磷酸二酯磷酸二酯酶GDPD突变体表达载体及表达菌株的构建

(1)参照激烈热球菌(Pyrococcus furiosusDSM 3638)的甘油磷酸二酯磷酸二酯酶完整氨基酸序列(GenBank：AAL82127.1)，通过信号肽预测分析软件，对其信号肽进行准确预测并从完整序列中进行删除，获得pfGDPD成熟肽编码序列，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；

(2)根据(1)所得氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性设计基因编码序列，其碱基序列如SEQ ID NO.4所示。在序列上游引入EcoR I，下游引入Xho I酶切位点，所得pfGDPD基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

(3)将(2)所合成的pfGDPD基因用限制性内切酶EcoRI和XhoI分别对纯化的基因片段和质粒pET28a进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含50μg/mL卡那霉素)平板。挑取阳性克隆通过EcoRI和XhoI双酶切鉴定及基因测序，获得野生型pfGDPD的pET28a-pfGDPD重组质粒；

(4)采用两步重叠延伸PCR方法构建本发明所述突变体SEQ ID NO.5，SEQ IDNO.6，首先进行引物全长的拼接，然后以含有目的基因的质粒模板进行扩增。反应条件如下：

反应条件1：

其中突变体D60A构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：CCTGATGCACGCGGAAACCATCG

下游引物：ATCACTTTGTTGTCTTTAGAC

其中突变体S67A构建所用上游引物和下游引物序列为：

上游引物：CGACCGTACCGCGAACCTGAAAG

下游引物：ATGGTTTCGTCGTGCATC

扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，10s；20个循环；72℃，2min。

扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化获得。

反应条件2：

PCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，408s；31个循环；72℃，2min。PCR产物利用DNA纯化试剂盒进行产物纯化得到pfGDPD突变基因。

用Dpn I酶切消化模板质粒，Dpn I酶切消化体系如下：

将Dpn I酶切消化体系置于37℃条件下，2h。将消化产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含50μg/mL卡那霉素)平板。挑取阳性克隆通过EcoRI和XhoI双酶切鉴定及基因测序，获得pET28a-pfGDPD突变体质粒。

(5)将(4)所得的重组质粒转化到大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆并测序验证，即获得重组pET28a-pfGDPD突变体的SHuffle T7大肠杆菌表达菌株。

实施例2：pET28a-pfGDPD突变体重组表达菌株发酵及重组蛋白纯化

(1)将重组大肠杆菌pET28a-pfGDPD突变体表达菌株接种于含卡那霉素50μg/mL的种子培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；

(2)将(1)中所述种子液按5％的接种量接种到种到LB液体发酵培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.2mM，于28℃，200r/min条件下诱导培养4h；

(3)将(2)中所得发酵液离心(4000rpm,10min)，收集菌体，用50mM Tris-HCl,500mM NaCl缓冲液(pH 8.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心(10000rpm,10min)，取上清，即为制备得到的pfGDPD粗酶液；

(4)将(3)中所得粗酶液利用镍柱亲和层析柱纯化，上样流速4mL/min，用含10-500mM咪唑的50mM Tris-HCl,500mM NaCl缓冲液(pH 8.0)洗脱，目标蛋白在200mM咪唑浓度下被洗脱下来。将洗脱下来的目的蛋白过G-25脱盐柱，用含50mM Tris-HCl,500mM NaCl缓冲液(pH 8.0)洗脱得到目的蛋白。

实施例3:pfGDPD野生型水解溶血磷脂实验

以核磁共振的方法测定pfGDPD野生型对于溶血磷脂的水解。反应在100mM硼酸缓冲液(pH 8.0)中进行，溶血磷脂底物浓度为4mM，总反体系为500μL，30℃条件下反应48h。

取反应后的产物进行核磁共振检测，结果表明，催化反应体系中除了有LPA外，还有甘油磷酸二酯(如GPC)等杂质生成(图2)。

实施例4:pfGDPDD60A突变体水解溶血磷脂实验

反应体系与反应条件同实施例3。

取反应后的产物进行核磁共振检测，结果表明(图3)相比于野生型，突变体仅产生溶血磷脂酸产物，而不产生甘油磷酸二酯等杂质。

将本实施例的反应样品进行质谱检测，结果表明(图4)只检测到溶血磷脂酸(LPA)的存在。

实施例5:pfGDPDS67A突变体水解溶血磷脂实验

反应体系与反应条件同实施例3。

取反应后的产物进行核磁共振检测，结果表明(图5)相比于野生型，突变体仅产生溶血磷脂酸产物，而不产生甘油磷酸二酯等杂质。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Gly Asn Pro Met Trp Glu Arg Asp Lys Ile Ile Val Leu Gly

1 5 10 15

His Arg Gly Tyr Met Ala Lys Tyr Pro Glu Asn Ser Leu Leu Ser Ile

20 25 30

Arg Lys Ala Ile Glu Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile Asp Val Trp

35 40 45

Leu Ser Lys Asp Asn Lys Val Ile Leu Met His Asp Glu Thr Ile Asp

50 55 60

Arg Thr Ser Asn Leu Lys Gly Arg Gln Lys Glu Met Thr Leu Glu Glu

65 70 75 80

Leu Lys Lys Ala Asn Ile Gly Met Gly Glu Arg Ile Pro Thr Leu Glu

85 90 95

Glu Val Phe Glu Ile Leu Pro Lys Asp Ala Leu Leu Asn Ile Glu Ile

100 105 110

Lys Asp Arg Asp Ala Ala Lys Glu Val Ala Arg Ile Val Ser Glu Asn

115 120 125

Asn Pro Glu Arg Val Met Ile Ser Ser Phe Asp Ile Glu Ala Leu Arg

130 135 140

Glu Tyr Arg Lys Tyr Asp Asp Thr Thr Ile Met Gly Leu Leu Val Asp

145 150 155 160

Lys Glu Glu Thr Val Pro Leu Ile Pro Lys Leu Lys Glu Lys Leu Asn

165 170 175

Leu Trp Ser Val Asn Val Pro Met Glu Ala Ile Pro Ile Ile Gly Phe

180 185 190

Glu Lys Thr Tyr Gln Ala Ile Lys Trp Val Arg Ser Leu Gly Leu Lys

195 200 205

Ile Val Leu Trp Thr Glu Asp Asp Lys Leu Phe Tyr Val Asp Glu Asn

210 215 220

Leu Lys Arg Leu Leu Gly Met Phe Glu Val Val Ile Ala Asn Asp Val

225 230 235 240

Glu Arg Met Val Ser Tyr Leu Ser Ser Leu Gly Ile Arg

245 250

<210> 2

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Val Gly Asn Pro Met Trp Glu Arg Asp Lys Ile Ile Val Leu Gly

1 5 10 15

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20 25 30

Arg Lys Ala Ile Glu Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile Asp Val Trp

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Leu Ser Lys Asp Asn Lys Val Ile Leu Met His Ala Glu Thr Ile Asp

50 55 60

Arg Thr Ser Asn Leu Lys Gly Arg Gln Lys Glu Met Thr Leu Glu Glu

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Leu Lys Lys Ala Asn Ile Gly Met Gly Glu Arg Ile Pro Thr Leu Glu

85 90 95

Glu Val Phe Glu Ile Leu Pro Lys Asp Ala Leu Leu Asn Ile Glu Ile

100 105 110

Lys Asp Arg Asp Ala Ala Lys Glu Val Ala Arg Ile Val Ser Glu Asn

115 120 125

Asn Pro Glu Arg Val Met Ile Ser Ser Phe Asp Ile Glu Ala Leu Arg

130 135 140

Glu Tyr Arg Lys Tyr Asp Asp Thr Thr Ile Met Gly Leu Leu Val Asp

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Leu Trp Ser Val Asn Val Pro Met Glu Ala Ile Pro Ile Ile Gly Phe

180 185 190

Glu Lys Thr Tyr Gln Ala Ile Lys Trp Val Arg Ser Leu Gly Leu Lys

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Ile Val Leu Trp Thr Glu Asp Asp Lys Leu Phe Tyr Val Asp Glu Asn

210 215 220

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225 230 235 240

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<210> 3

<211> 253

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

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115 120 125

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Ile Val Leu Trp Thr Glu Asp Asp Lys Leu Phe Tyr Val Asp Glu Asn

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Leu Lys Arg Leu Leu Gly Met Phe Glu Val Val Ile Ala Asn Asp Val

225 230 235 240

Glu Arg Met Val Ser Tyr Leu Ser Ser Leu Gly Ile Arg

245 250

<210> 4

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtaggta acccaatgtg ggagcgtgat aagatcatcg tcctgggtca tcgtggttac 60

atggcaaagt acccggagaa cagcctgctg tctatccgta aagctattga agcaggtgca 120

gatggtgttg aaatcgatgt atggctgtct aaagacaaca aagtgatcct gatgcacgac 180

gaaaccatcg accgtacctc taacctgaaa ggccgtcaga aagaaatgac gctggaggaa 240

ctgaagaaag cgaacatcgg tatgggcgaa cgtatcccga ctctggaaga agtattcgaa 300

atcctgccga aagacgctct gctgaacatc gaaatcaaag accgtgacgc tgctaaagaa 360

gtcgcccgta ttgtctctga gaacaacccg gaacgtgtta tgatctcttc ctttgacatc 420

gaagcgctgc gtgaataccg caaatacgac gacactacta tcatgggtct gctggtagat 480

aaagaagaaa ccgtgccgct gatccctaaa ctgaaagaga aactgaacct gtggagcgtt 540

aacgtgccga tggaagcgat tccgattatt ggcttcgaga agacctacca agcgatcaaa 600

tgggtgcgca gcctgggcct gaagattgtt ctgtggaccg aagatgataa actgttctat 660

gtggatgaga atctgaaacg cctgctgggc atgttcgaag ttgttattgc caatgatgtt 720

gaacgcatgg tttcctatct gtcctccctg ggcattcgc 759

<210> 5

<211> 765

<212> DNA

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<400> 5

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<210> 6

<211> 759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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ctgaagaaag cgaacatcgg tatgggcgaa cgtatcccga ctctggaaga agtattcgaa 300

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gtcgcccgta ttgtctctga gaacaacccg gaacgtgtta tgatctcttc ctttgacatc 420

gaagcgctgc gtgaataccg caaatacgac gacactacta tcatgggtct gctggtagat 480

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gtggatgaga atctgaaacg cctgctgggc atgttcgaag ttgttattgc caatgatgtt 720

gaacgcatgg tttcctatct gtcctccctg ggcattcgc 759

Claims

1.一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。

2.一种编码权利要求1所述甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核酸序列为SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。

4.一种含权利要求2或3所述基因的重组基因工程菌。

5.权利要求4所述重组基因工程菌的制备方法，其特征在于，将权利要求2或3所述基因克隆到表达载体pET-21a、pET28a或pET32a上，转化大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，获得重组基因工程菌。

6.权利要求1所述突变体的应用，其特征在于，所述突变体应用于催化溶血磷脂制备高纯度溶血磷脂酸。