CN112662645B - 一种鞘磷脂酶d突变体及其应用 - Google Patents
一种鞘磷脂酶d突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112662645B CN112662645B CN202110067084.0A CN202110067084A CN112662645B CN 112662645 B CN112662645 B CN 112662645B CN 202110067084 A CN202110067084 A CN 202110067084A CN 112662645 B CN112662645 B CN 112662645B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- asn
- ala
- lys
- gly
- val
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Abstract
本发明属于酶的基因工程技术领域，本发明公开了一种鞘磷脂酶D突变体及其应用，所述的鞘磷脂酶D突变体是以来自Loxoscelesarizonica的鞘磷脂酶D(Laz‑SMD)(氨基酸序列SEQ ID NO:1)的亲本序列基础上突变第78位的半胱氨酸或第84位的半胱氨酸。本发明改造获得的Laz‑SMD突变体水解溶血磷脂底物改变了原有反应只产环状磷脂酸(cPA)的特点，转而只反应产生溶血磷脂酸，本发明提供了一种利用Laz‑SMD水解溶血磷脂生产溶血磷脂酸的方法，进一步提升了该酶在药物领域的利用价值。
Description
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及利用分子生物学技术获得鞘磷脂酶D突变体及其催化反应生成溶血磷脂酸的应用和大肠杆菌重组表达制备方法。
背景技术
溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)是一种结构简单、具有多种生物活性的磷脂介质。近年来研究发现，LPA在体内信号传递过程中起着十分重要的作用,是一种多功能的“磷脂信使”。作为脂质介质，LPA通过G蛋白耦联受体影响靶细胞的功能，参与许多重要的生理和病理过程，如促进血小板聚集和血栓形成激活，促进平滑肌收缩，抗凋亡，伤口愈合，促进血管生成，神经系统发育，肿瘤生长，影响心脏功能和肥胖等。而环状磷脂酸(cPA)作为LPA的类似物，其sn-2羟基与sn-3磷酸形成5元环的环状磷脂酸，虽然与LPA的结构相似，但与LPA的功能相反，cPA具有抑制细胞增殖，肿瘤细胞侵袭和转移等功能。与cPA相比，LPA具有较高的经济价值，在医疗、食品、药品、化妆品等工业领域，具有广泛的应用。
目前，溶血磷脂酸的制备方法主要是酶法水解和从天然原料中提取。酶法水解主要是通过磷脂酶A1、A2水解大豆磷脂的方式制备。除此之外，也可从一些植物如拟南芥中提取。但无论是磷脂酶水解法还是提取法，在制备过程中都会产生大量杂质，进而影响下一步的纯化工作，而在医药领域，对于该成分的纯度要求较高。因此，急需开发新的制备方法，简化纯化制备流程，提高产物纯度，并降低生产成本，从而促进溶血磷脂酸的广泛应用。
鞘磷脂酶D(E.C.3.1.4.41)是一类催化鞘磷脂的水解产生神经酰胺-1-磷酸(神经酰胺-1-磷酸)，或水解溶血磷脂酰胆碱(LPC)产生溶血磷脂酸的酶。Lajoie等前期研究中(Lajoie D M,Zobel-Thropp P A,Kumirov V K,et al.Phospholipase D toxins ofbrown spider venomconvert lysophosphatidylcholine and sphingomyelin to cyclicphosphates[J].PLoS One,2013,8(8):e72372.)成功构建了来自棕色蜘蛛毒素(Loxoscelesarizonica)的鞘磷脂酶D(Laz-SMD)的大肠杆菌重组表达菌株及酶蛋白的制备方法，发现该酶在水解溶血磷脂底物时，其水解产物并不是具有较高经济价值的LPA，而是环状溶血磷脂酸(cPA)。
发明内容
本发明解决的技术问题是使得Laz-SMD在水解溶血磷脂时只产生LPA，不会产生cPA杂质，从而提供一种高纯度LPA的制备方法。本发明以Laz-SMD基因为模板，利用蛋白质理性设计技术设计突变体，改造获得了单一产溶血磷脂酸的Laz-SMD突变体，进一步提高了该酶的应用范围。
本发明的技术方案如下：
一种Laz-SMD突变体，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的亲本序列基础上突变第78位半胱氨酸和/或第84位半胱氨酸所得，即其中第78位和第84位中的至少一个半胱氨酸突变为除半胱氨酸以外的其余19种中的任意一种氨基酸。
一种Laz-SMD突变体，其氨基酸序列为SEQID NO:2或SEQID NO:3或SEQID NO:4。。
一种编码所述Laz-SMD突变体的基因，其核酸序列为SEQID NO:6或SEQID NO:7或SEQID NO:8。
一种所述基因的重组基因工程菌，将所述基因克隆到表达载体pET-21a、pET28a或pET32a上，转化大肠杆菌BL21(DE)3感受态细胞，获得重组基因工程菌。以获得的重组基因工程菌为发酵菌株进行液体发酵，制备重组Laz-SMD。以核磁共振的方法测定Laz-SMD对于溶血磷脂的水解情况。结果表明相比于野生型，突变体仅产生溶血磷脂酸产物，而不产生环状磷脂酸。所述的Laz-SMD突变体可应用于医疗、制药、美容等领域中。
二硫键(disulfide bond)是连接不同肽链或同一肽链中，两个不同半胱氨酸残基之巯基的化学键。在蛋白结构中，二硫键是由两个半胱氨酸残基中两个硫醇基团耦合而成。二硫键是比较稳定的共价键，在蛋白质分子中，起着稳定肽链空间结构的作用。从结构上，Laz-SMD的第78位和第84位是半胱氨酸，两个半胱氨酸可以形成一个连接可变环的链内二硫键。因此，将其中任意一个氨基酸突变为除半胱氨酸以外的任意其它19种氨基酸将直接影响到该位置二硫键的形成。我们研究发现，当把该酶蛋白结构中的一个二硫键破坏后，获得的突变体酶蛋白当同样催化溶血磷脂底物时，其反应产物转向只生成LPA，反而不催化产生环状溶血磷脂酸(cPA)，由此形成了一种可催化制备LPA的酶突变体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
相比于野生型，本发明获得的突变体仅产生溶血磷脂酸产物，而不产生环状磷脂酸，本发明提供了一种利用Laz-SMD突变体蛋白水解溶血磷脂制备LPA的方法，该方法一步可实现目标产物获得，并且反应过程无其他副反应产物生成，利于后续纯化制备高纯度的LPA，更适合应用于食品、药品、化妆品等工业领域，具有广阔的市场空间。
附图说明
图1为Laz-SMD突变体蛋白纯化SDS-PAGE检测结果图。
图2为Laz-SMD野生型水解溶血磷脂的核磁共振图谱。
图3为Laz-SMDC78A突变体水解溶血磷脂的核磁共振图谱。
图4为Laz-SMDC84A突变体水解溶血磷脂的核磁共振图谱。
图5为Laz-SMD突变体水解溶血磷脂的质谱图。
图6为Laz-SMDC78A-C84AS双突变体水解溶血磷脂的核磁共振图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1：Laz-SMD突变体表达载体及表达菌株的构建
(1)参照棕色蜘蛛毒素(Loxoscelesarizonica)的鞘磷脂酶D(Laz-SMD)完整氨基酸序列(GenBank：AAW22997.1)，通过信号肽预测分析软件，对其信号肽进行准确预测并从完整序列中进行删除，获得Laz-SMD成熟肽编码序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)根据(1)所得氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏好性设计基因编码序列，其碱基序列如SEQ ID NO.5所示。在序列上游引入Nde I，下游引入Xho I酶切位点，所得Laz-SMD基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
(3)将(2)所合成的Laz-SMD基因用限制性内切酶Nde I和Xho I分别对纯化的基因片段和质粒pET21a进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过Nde I和Xho I双酶切鉴定及基因测序，获得野生型Laz-SMD的pET21a-Laz-SMD重组质粒；
(4)采用两步重叠延伸PCR方法构建本发明所述突变体SEQ ID NO.6,SEQ IDNO.7,SEQ ID NO.8，首先进行引物全长的拼接，然后以含有目的基因的质粒模板进行扩增。反应条件如下：
反应条件1：
其中突变体C78A构建所用上游引物和下游引物序列为：
上游引物：TGGTGTTCCGGCGGATTGTCGTCG
下游引物：TGATAGGTATATTCCGGATTTG
突变体C84A构建所用上游引物和下游引物序列为：
上游引物：TCGTCGCTGGGCGAAAAAATGGGAATATTTTAATAATTTTC
下游引物：CAATCACACGGAACACCATG
扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，10s；20个循环；72℃，2min。扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化得到全长引物。
反应条件2：
PCR扩增条件:98℃，3min；98℃，10s；58℃，15s；72℃，408s；31个循环；72℃，2min。PCR产物利用DNA纯化试剂盒进行产物纯化得到Laz-SMD突变基因。
用Dpn I酶切消化模板质粒，Dpn I酶切消化体系如下：
将Dpn I酶切消化体系置于37℃条件下，2h。将消化产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取阳性克隆通过EcoRI和XhoI双酶切鉴定及基因测序，获得pET21a-Laz-SMD突变体质粒。
(5)将(4)所得的重组质粒转化到大肠杆菌SHuffle T7感受态细胞，挑选阳性克隆并测序验证，即获得重组pET21a-Laz-SMD突变体的SHuffle T7大肠杆菌表达菌株。
实施例2：pET21a-Laz-SMD野生型及突变体重组表达菌株发酵及重组蛋白纯化
(1)将重组大肠杆菌pET21a-Laz-SMD突变体表达菌株接种于含氨苄青霉素100μg/mL的种子培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；
(2)将(1)中所述种子液按5％的接种量接种到种到LB液体发酵培养基(NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.2～7.4)中，于37℃，200r/min摇瓶培养至OD600＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mg/mL，于37℃，200r/min条件下诱导培养2h；
(3)将(2)中所得发酵液离心(4000rpm,10min)，收集菌体沉淀，用50mM Tris-HCl,500Mm NaCl缓冲液(pH 8.0)重悬并超声破碎细胞，将细胞破碎液离心(10000rpm,10min)，取上清，即为制备得到的Laz-SMD粗酶液；
(4)将(3)中所得Laz-SMD粗酶液，利用镍柱亲和层析柱纯化，流速4mL/min，最后用含10-500mM咪唑的50mM Tris-HCl,500mM NaCl缓冲液(pH 8.0)洗脱，目标蛋白在250mM咪唑浓度处被洗脱下来。将洗脱下来的目的蛋白过G-25脱盐柱，用含50mM Tris-HCl,500mMNaCl缓冲液(pH 8.0)洗脱得到目的蛋白(图1)。
实施例3:Laz-SMD野生型水解溶血磷脂实验
以核磁共振的方法测定pET21a-Laz-SMD野生型对于溶血磷脂的水解。反应在100mM硼酸缓冲液(pH 8.0)中进行，溶血磷脂底物浓度为4mM，总反体系为500μL，30℃条件下反应48h。只检测到cPA的生成(图2)。
实施例4:Laz-SMDC78A单点突变体水解溶血磷脂实验
以核磁共振的方法测定pET21a-Laz-SMDC78A单点突变体对于溶血磷脂的水解。反应体系与反应条件同实施例3。
结果表明相比于野生型，突变体仅产生溶血磷脂酸产物(LPA)，而不产生环状磷脂酸(cPA)等杂质(图3)。将本实施例的反应样品进行质谱检测，结果表明(图5)只检测到溶血磷脂酸(LPA)的存在，不存在cPA。
实施例5:Laz-SMDC84A单点突变体水解溶血磷脂实验
以核磁共振的方法测定pET21a-Laz-SMDC84A单点突变体对于溶血磷脂的水解。反应体系与反应条件同实施例3。
将本实施例的反应样品进行核磁检测，结果表明(图4)只检测到溶血磷脂酸(LPA)的存在。质谱检测结果同样证实，反应体系中只检测到溶血磷脂酸(LPA)的存在，不存在cPA。
实施例6:Laz-SMDC78A-C84A双突变体水解溶血磷脂实验
以核磁共振的方法测定pET21a-Laz-SMDC78A-C84A双突变体对于溶血磷脂的水解。反应体系与反应条件同实施例3。将本实施例的反应样品进行核磁检测，结果表明：只检测到溶血磷脂酸(LPA)的存在(图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 一种鞘磷脂酶D突变体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Arg Ala Thr Glu Lys Phe Ala Pro Ile Tyr Phe Phe Cys His Pro
1 5 10 15
Leu Gln Ser Ala Glu Thr Asp Val Ala Glu Arg Ala Asn Lys Arg Pro
20 25 30
Ile Trp Ile Met Gly His Met Val Asn Ala Asn Tyr Gln Ile Asp Glu
35 40 45
Phe Val Asn Leu Gly Ala Asn Ser Ile Glu Thr Asp Val Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Ser Ala Asn Pro Glu Tyr Thr Tyr His Gly Val Pro Cys Asp Cys
65 70 75 80
Arg Arg Trp Cys Lys Lys Trp Glu Tyr Phe Asn Asn Phe Leu Lys Ala
85 90 95
Leu Arg Lys Ala Thr Thr Pro Gly Asp Ser Lys Tyr His Glu Lys Leu
100 105 110
Val Leu Val Val Phe Asp Leu Lys Thr Gly Ser Leu Tyr Asp Asn Gln
115 120 125
Ala Tyr Asp Ala Gly Lys Lys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln His Tyr
130 135 140
Trp Asn Asn Gly Asn Asn Gly Gly Arg Ala Tyr Ile Val Leu Ser Ile
145 150 155 160
Pro Asn Leu Ala His Tyr Lys Leu Ile Thr Gly Phe Lys Glu Thr Leu
165 170 175
Lys Thr Glu Gly His Pro Glu Leu Met Glu Lys Val Gly Tyr Asp Phe
180 185 190
Ser Gly Asn Asp Asn Ile Asp Gln Val Ala Asn Ala Tyr Lys Lys Ala
195 200 205
Gly Val Thr Gly His Val Trp Gln Ser Asp Gly Ile Thr Asn Cys Val
210 215 220
Ala Ser Phe Ile Arg Gly Leu Asp Arg Ala Lys Lys Ala Val Lys Asn
225 230 235 240
Arg Asp Ser Ser Asn Gly Tyr Ile Asn Lys Val Tyr Tyr Trp Thr Val
245 250 255
Asp Lys Tyr Ala Thr Thr Arg Glu Ala Phe Asp Ile Gly Val Asp Gly
260 265 270
Ile Met Thr Asn Tyr Pro Asp Val Ile Ala Asn Val Leu Asn Glu Ser
275 280 285
Ala Tyr Lys Gly Lys Phe Arg Leu Ala Thr Tyr Asp Asp Asn Pro Trp
290 295 300
Glu Thr Phe Lys Asn
305
<210> 2
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Arg Ala Thr Glu Lys Phe Ala Pro Ile Tyr Phe Phe Cys His Pro
1 5 10 15
Leu Gln Ser Ala Glu Thr Asp Val Ala Glu Arg Ala Asn Lys Arg Pro
20 25 30
Ile Trp Ile Met Gly His Met Val Asn Ala Asn Tyr Gln Ile Asp Glu
35 40 45
Phe Val Asn Leu Gly Ala Asn Ser Ile Glu Thr Asp Val Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Ser Ala Asn Pro Glu Tyr Thr Tyr His Gly Val Pro Ala Asp Cys
65 70 75 80
Arg Arg Trp Cys Lys Lys Trp Glu Tyr Phe Asn Asn Phe Leu Lys Ala
85 90 95
Leu Arg Lys Ala Thr Thr Pro Gly Asp Ser Lys Tyr His Glu Lys Leu
100 105 110
Val Leu Val Val Phe Asp Leu Lys Thr Gly Ser Leu Tyr Asp Asn Gln
115 120 125
Ala Tyr Asp Ala Gly Lys Lys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln His Tyr
130 135 140
Trp Asn Asn Gly Asn Asn Gly Gly Arg Ala Tyr Ile Val Leu Ser Ile
145 150 155 160
Pro Asn Leu Ala His Tyr Lys Leu Ile Thr Gly Phe Lys Glu Thr Leu
165 170 175
Lys Thr Glu Gly His Pro Glu Leu Met Glu Lys Val Gly Tyr Asp Phe
180 185 190
Ser Gly Asn Asp Asn Ile Asp Gln Val Ala Asn Ala Tyr Lys Lys Ala
195 200 205
Gly Val Thr Gly His Val Trp Gln Ser Asp Gly Ile Thr Asn Cys Val
210 215 220
Ala Ser Phe Ile Arg Gly Leu Asp Arg Ala Lys Lys Ala Val Lys Asn
225 230 235 240
Arg Asp Ser Ser Asn Gly Tyr Ile Asn Lys Val Tyr Tyr Trp Thr Val
245 250 255
Asp Lys Tyr Ala Thr Thr Arg Glu Ala Phe Asp Ile Gly Val Asp Gly
260 265 270
Ile Met Thr Asn Tyr Pro Asp Val Ile Ala Asn Val Leu Asn Glu Ser
275 280 285
Ala Tyr Lys Gly Lys Phe Arg Leu Ala Thr Tyr Asp Asp Asn Pro Trp
290 295 300
Glu Thr Phe Lys Asn
305
<210> 3
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Arg Ala Thr Glu Lys Phe Ala Pro Ile Tyr Phe Phe Cys His Pro
1 5 10 15
Leu Gln Ser Ala Glu Thr Asp Val Ala Glu Arg Ala Asn Lys Arg Pro
20 25 30
Ile Trp Ile Met Gly His Met Val Asn Ala Asn Tyr Gln Ile Asp Glu
35 40 45
Phe Val Asn Leu Gly Ala Asn Ser Ile Glu Thr Asp Val Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Ser Ala Asn Pro Glu Tyr Thr Tyr His Gly Val Pro Cys Asp Cys
65 70 75 80
Arg Arg Trp Ala Lys Lys Trp Glu Tyr Phe Asn Asn Phe Leu Lys Ala
85 90 95
Leu Arg Lys Ala Thr Thr Pro Gly Asp Ser Lys Tyr His Glu Lys Leu
100 105 110
Val Leu Val Val Phe Asp Leu Lys Thr Gly Ser Leu Tyr Asp Asn Gln
115 120 125
Ala Tyr Asp Ala Gly Lys Lys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln His Tyr
130 135 140
Trp Asn Asn Gly Asn Asn Gly Gly Arg Ala Tyr Ile Val Leu Ser Ile
145 150 155 160
Pro Asn Leu Ala His Tyr Lys Leu Ile Thr Gly Phe Lys Glu Thr Leu
165 170 175
Lys Thr Glu Gly His Pro Glu Leu Met Glu Lys Val Gly Tyr Asp Phe
180 185 190
Ser Gly Asn Asp Asn Ile Asp Gln Val Ala Asn Ala Tyr Lys Lys Ala
195 200 205
Gly Val Thr Gly His Val Trp Gln Ser Asp Gly Ile Thr Asn Cys Val
210 215 220
Ala Ser Phe Ile Arg Gly Leu Asp Arg Ala Lys Lys Ala Val Lys Asn
225 230 235 240
Arg Asp Ser Ser Asn Gly Tyr Ile Asn Lys Val Tyr Tyr Trp Thr Val
245 250 255
Asp Lys Tyr Ala Thr Thr Arg Glu Ala Phe Asp Ile Gly Val Asp Gly
260 265 270
Ile Met Thr Asn Tyr Pro Asp Val Ile Ala Asn Val Leu Asn Glu Ser
275 280 285
Ala Tyr Lys Gly Lys Phe Arg Leu Ala Thr Tyr Asp Asp Asn Pro Trp
290 295 300
Glu Thr Phe Lys Asn
305
<210> 4
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Arg Ala Thr Glu Lys Phe Ala Pro Ile Tyr Phe Phe Cys His Pro
1 5 10 15
Leu Gln Ser Ala Glu Thr Asp Val Ala Glu Arg Ala Asn Lys Arg Pro
20 25 30
Ile Trp Ile Met Gly His Met Val Asn Ala Asn Tyr Gln Ile Asp Glu
35 40 45
Phe Val Asn Leu Gly Ala Asn Ser Ile Glu Thr Asp Val Ser Phe Asp
50 55 60
Ser Ser Ala Asn Pro Glu Tyr Thr Tyr His Gly Val Pro Ala Asp Cys
65 70 75 80
Arg Arg Trp Ala Lys Lys Trp Glu Tyr Phe Asn Asn Phe Leu Lys Ala
85 90 95
Leu Arg Lys Ala Thr Thr Pro Gly Asp Ser Lys Tyr His Glu Lys Leu
100 105 110
Val Leu Val Val Phe Asp Leu Lys Thr Gly Ser Leu Tyr Asp Asn Gln
115 120 125
Ala Tyr Asp Ala Gly Lys Lys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln His Tyr
130 135 140
Trp Asn Asn Gly Asn Asn Gly Gly Arg Ala Tyr Ile Val Leu Ser Ile
145 150 155 160
Pro Asn Leu Ala His Tyr Lys Leu Ile Thr Gly Phe Lys Glu Thr Leu
165 170 175
Lys Thr Glu Gly His Pro Glu Leu Met Glu Lys Val Gly Tyr Asp Phe
180 185 190
Ser Gly Asn Asp Asn Ile Asp Gln Val Ala Asn Ala Tyr Lys Lys Ala
195 200 205
Gly Val Thr Gly His Val Trp Gln Ser Asp Gly Ile Thr Asn Cys Val
210 215 220
Ala Ser Phe Ile Arg Gly Leu Asp Arg Ala Lys Lys Ala Val Lys Asn
225 230 235 240
Arg Asp Ser Ser Asn Gly Tyr Ile Asn Lys Val Tyr Tyr Trp Thr Val
245 250 255
Asp Lys Tyr Ala Thr Thr Arg Glu Ala Phe Asp Ile Gly Val Asp Gly
260 265 270
Ile Met Thr Asn Tyr Pro Asp Val Ile Ala Asn Val Leu Asn Glu Ser
275 280 285
Ala Tyr Lys Gly Lys Phe Arg Leu Ala Thr Tyr Asp Asp Asn Pro Trp
290 295 300
Glu Thr Phe Lys Asn
305
<210> 5
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttcgtgcca ccgaaaaatt tgccccgatt tatttctttt gccatccgct gcagagcgcc 60
gaaaccgatg ttgcagaacg cgcaaataaa cgtccgattt ggattatggg tcacatggtt 120
aatgccaatt atcagattga tgaatttgtt aatctgggtg cgaatagcat tgaaaccgat 180
gttagctttg atagcagcgc aaatccggaa tatacctatc atggtgttcc gtgtgattgt 240
cgtcgctggt gcaaaaaatg ggaatatttt aataattttc tgaaagcact gcgtaaagcc 300
accacccctg gtgatagcaa atatcatgaa aaactggttc tggttgtttt tgatctgaaa 360
accggtagcc tgtatgataa tcaggcctat gatgccggta aaaaactggc aaaaaatctg 420
ctgcagcatt attggaataa tggtaataat ggtggtcgtg catatattgt tctgagtatt 480
ccgaatctgg cacattataa actgattacc ggttttaaag aaaccctgaa aaccgaaggt 540
catccggaac tgatggaaaa agttggctat gattttagcg gtaatgataa tattgatcag 600
gttgcgaatg cctataaaaa agccggtgtg accggccatg tttggcagag cgatggtatt 660
accaattgcg ttgccagttt tattcgtggt ctggatcgtg ccaaaaaagc cgttaaaaat 720
cgtgatagta gtaatggtta tattaataaa gtttattatt ggaccgttga taaatatgcc 780
accacccgtg aagcatttga tattggtgtt gatggtatta tgaccaatta tccggatgtg 840
attgccaatg ttctgaatga aagcgcatat aaaggtaaat ttcgtctggc cacctatgat 900
gataatccgt gggaaacctt taaaaat 927
<210> 6
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttcgtgcca ccgaaaaatt tgccccgatt tatttctttt gccatccgct gcagagcgcc 60
gaaaccgatg ttgcagaacg cgcaaataaa cgtccgattt ggattatggg tcacatggtt 120
aatgccaatt atcagattga tgaatttgtt aatctgggtg cgaatagcat tgaaaccgat 180
gttagctttg atagcagcgc aaatccggaa tatacctatc atggtgttcc ggcggattgt 240
cgtcgctggt gcaaaaaatg ggaatatttt aataattttc tgaaagcact gcgtaaagcc 300
accacccctg gtgatagcaa atatcatgaa aaactggttc tggttgtttt tgatctgaaa 360
accggtagcc tgtatgataa tcaggcctat gatgccggta aaaaactggc aaaaaatctg 420
ctgcagcatt attggaataa tggtaataat ggtggtcgtg catatattgt tctgagtatt 480
ccgaatctgg cacattataa actgattacc ggttttaaag aaaccctgaa aaccgaaggt 540
catccggaac tgatggaaaa agttggctat gattttagcg gtaatgataa tattgatcag 600
gttgcgaatg cctataaaaa agccggtgtg accggccatg tttggcagag cgatggtatt 660
accaattgcg ttgccagttt tattcgtggt ctggatcgtg ccaaaaaagc cgttaaaaat 720
cgtgatagta gtaatggtta tattaataaa gtttattatt ggaccgttga taaatatgcc 780
accacccgtg aagcatttga tattggtgtt gatggtatta tgaccaatta tccggatgtg 840
attgccaatg ttctgaatga aagcgcatat aaaggtaaat ttcgtctggc cacctatgat 900
gataatccgt gggaaacctt taaaaat 927
<210> 7
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttcgtgcca ccgaaaaatt tgccccgatt tatttctttt gccatccgct gcagagcgcc 60
gaaaccgatg ttgcagaacg cgcaaataaa cgtccgattt ggattatggg tcacatggtt 120
aatgccaatt atcagattga tgaatttgtt aatctgggtg cgaatagcat tgaaaccgat 180
gttagctttg atagcagcgc aaatccggaa tatacctatc atggtgttcc gtgtgattgt 240
cgtcgctggg cgaaaaaatg ggaatatttt aataattttc tgaaagcact gcgtaaagcc 300
accacccctg gtgatagcaa atatcatgaa aaactggttc tggttgtttt tgatctgaaa 360
accggtagcc tgtatgataa tcaggcctat gatgccggta aaaaactggc aaaaaatctg 420
ctgcagcatt attggaataa tggtaataat ggtggtcgtg catatattgt tctgagtatt 480
ccgaatctgg cacattataa actgattacc ggttttaaag aaaccctgaa aaccgaaggt 540
catccggaac tgatggaaaa agttggctat gattttagcg gtaatgataa tattgatcag 600
gttgcgaatg cctataaaaa agccggtgtg accggccatg tttggcagag cgatggtatt 660
accaattgcg ttgccagttt tattcgtggt ctggatcgtg ccaaaaaagc cgttaaaaat 720
cgtgatagta gtaatggtta tattaataaa gtttattatt ggaccgttga taaatatgcc 780
accacccgtg aagcatttga tattggtgtt gatggtatta tgaccaatta tccggatgtg 840
attgccaatg ttctgaatga aagcgcatat aaaggtaaat ttcgtctggc cacctatgat 900
gataatccgt gggaaacctt taaaaat 927
<210> 8
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttcgtgcca ccgaaaaatt tgccccgatt tatttctttt gccatccgct gcagagcgcc 60
gaaaccgatg ttgcagaacg cgcaaataaa cgtccgattt ggattatggg tcacatggtt 120
aatgccaatt atcagattga tgaatttgtt aatctgggtg cgaatagcat tgaaaccgat 180
gttagctttg atagcagcgc aaatccggaa tatacctatc atggtgttcc ggcggattgt 240
cgtcgctggg cgaaaaaatg ggaatatttt aataattttc tgaaagcact gcgtaaagcc 300
accacccctg gtgatagcaa atatcatgaa aaactggttc tggttgtttt tgatctgaaa 360
accggtagcc tgtatgataa tcaggcctat gatgccggta aaaaactggc aaaaaatctg 420
ctgcagcatt attggaataa tggtaataat ggtggtcgtg catatattgt tctgagtatt 480
ccgaatctgg cacattataa actgattacc ggttttaaag aaaccctgaa aaccgaaggt 540
catccggaac tgatggaaaa agttggctat gattttagcg gtaatgataa tattgatcag 600
gttgcgaatg cctataaaaa agccggtgtg accggccatg tttggcagag cgatggtatt 660
accaattgcg ttgccagttt tattcgtggt ctggatcgtg ccaaaaaagc cgttaaaaat 720
cgtgatagta gtaatggtta tattaataaa gtttattatt ggaccgttga taaatatgcc 780
accacccgtg aagcatttga tattggtgtt gatggtatta tgaccaatta tccggatgtg 840
attgccaatg ttctgaatga aagcgcatat aaaggtaaat ttcgtctggc cacctatgat 900
gataatccgt gggaaacctt taaaaat 927
Claims (6)
1.一种鞘磷脂酶D突变体，其特征在于，所述的鞘磷脂酶D突变体是在氨基酸序列为SEQID NO:1的亲本序列基础上突变所得，其氨基酸序列为SEQID NO:2或SEQID NO:3或SEQIDNO:4。
2.一种编码权利要求1所述鞘磷脂酶D突变体的基因，其核酸序列为SEQID NO:6或SEQID NO:7或SEQID NO:8。
3.一种含权利要求2所述基因的重组基因工程菌。
4.权利要求3所述重组基因工程菌的制备方法，其特征在于，将权利要求2所述基因克隆到表达载体pET-21a、pET28a或pET32a上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)，SHuffleT7或Arctic Express(DE3)。
6.权利要求1所述鞘磷脂酶D突变体的应用，其特征在于，所述的鞘磷脂酶D突变体应用于制备高纯度的溶血磷脂酸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110067084.0A CN112662645B (zh) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | 一种鞘磷脂酶d突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110067084.0A CN112662645B (zh) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | 一种鞘磷脂酶d突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112662645A CN112662645A (zh) | 2021-04-16 |
| CN112662645B true CN112662645B (zh) | 2022-04-22 |
Family
ID=75415636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110067084.0A Active CN112662645B (zh) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | 一种鞘磷脂酶d突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112662645B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112662644B (zh) * | 2021-01-19 | 2022-04-22 | 华南理工大学 | 一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用 |
Citations (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA927228B (en) * | 1991-09-23 | 1993-05-24 | Csl Ltd | Enzymatically inactive phospholipase D of corynebacterium pseudotuberculosis. |
| AU2003264140A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-19 | Ingenium Pharmaceuticals Ag | Modified phospholipase c-gamma-2, expression products, and non-human animal models comprising said genes, and therapeutic uses |
| CN100999695A (zh) * | 2006-12-27 | 2007-07-18 | 华南理工大学 | 高酸值油脂的加工方法 |
| WO2008045515A2 (en) * | 2006-10-11 | 2008-04-17 | University Of Massachusetts | Methods and compostions for modulating hair growth |
| CN101818176A (zh) * | 2010-04-09 | 2010-09-01 | 浙江兴业集团有限公司 | 脂肪酸乙酯转化为甘油酯的方法 |
| CN104017786A (zh) * | 2014-06-20 | 2014-09-03 | 天津科技大学 | 一种磷脂酶a2突变体及其制备方法 |
| WO2014164800A1 (en) * | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
| CN104582751A (zh) * | 2012-06-29 | 2015-04-29 | 西托索尔本茨公司 | 使用聚合物的方法 |
| WO2015081407A1 (pt) * | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Fundação Butantan | Uso de compostos químicos capazes de inibir a ação tóxica das esfingomie-linase d do veneno de aranhas loxosceles e composição farmacêutica compreendendo os referidos compostos |
| CN104946668A (zh) * | 2015-06-29 | 2015-09-30 | 湖南省植物保护研究所 | cry1Ia基因及应用、由其编码的Cry1Ia蛋白及制备方法和应用 |
| CN106085984A (zh) * | 2016-06-02 | 2016-11-09 | 天津科技大学 | 一种新型磷脂酶d及其制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸的方法 |
| CN108118041A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-05 | 华南理工大学 | 一种磷脂酶d突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用 |
| CN112094853A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-18 | 扬州大学 | 白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用 |
| CN112662644A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-16 | 华南理工大学 | 一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用 |
| CN112877377A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-06-01 | 华南理工大学 | 一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法 |
| JP2021101629A (ja) * | 2019-12-24 | 2021-07-15 | モレキュラー ヘルス ゲーエムベーハー | ゲノム解析および遺伝子解析用のシステム並びに方法 |
| CN113604453A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-11-05 | 华南理工大学 | 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体和应用 |
| CN113801862A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-12-17 | 华南理工大学 | 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体及其重组表达菌株的制备方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2388659A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-11-30 | Mcgill University | Phospholipase a2 expression and activity and use thereof for diagnosis, prognostication, prevention and treatment of neural inflammatory and demyelinating disease |
| WO2004094629A1 (en) * | 2003-04-24 | 2004-11-04 | Skånemejerier Ek. För. | Human alkaline sphingomyelinase and use thereof |
| WO2010121093A2 (en) * | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Lpath, Inc. | Humanized antibody compositions and methods for binding lysophosphatidic acid |
| WO2012009576A2 (en) * | 2010-07-14 | 2012-01-19 | Lpath, Inc. | Prevention and treatment of pain using monoclonal antibodies and antibody fragments to lysophosphatidic acid |
| JP5060666B2 (ja) * | 2011-02-01 | 2012-10-31 | 国立大学法人福島大学 | 酵素及びその製造方法 |
| KR101584722B1 (ko) * | 2011-09-19 | 2016-01-13 | 건국대학교 산학협력단 | 인삼에서 분리 동정한 당지질단백질 진토닌의 천연 약용식물 유래 리간드로서의 용도 |
| CN113637654B (zh) * | 2021-09-28 | 2023-08-08 | 江南大学 | 一种重组磷脂酶d突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用 |
-
2021
- 2021-01-19 CN CN202110067084.0A patent/CN112662645B/zh active Active
Patent Citations (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA927228B (en) * | 1991-09-23 | 1993-05-24 | Csl Ltd | Enzymatically inactive phospholipase D of corynebacterium pseudotuberculosis. |
| AU2003264140A1 (en) * | 2002-08-30 | 2004-03-19 | Ingenium Pharmaceuticals Ag | Modified phospholipase c-gamma-2, expression products, and non-human animal models comprising said genes, and therapeutic uses |
| WO2008045515A2 (en) * | 2006-10-11 | 2008-04-17 | University Of Massachusetts | Methods and compostions for modulating hair growth |
| CN100999695A (zh) * | 2006-12-27 | 2007-07-18 | 华南理工大学 | 高酸值油脂的加工方法 |
| CN101818176A (zh) * | 2010-04-09 | 2010-09-01 | 浙江兴业集团有限公司 | 脂肪酸乙酯转化为甘油酯的方法 |
| CN104582751A (zh) * | 2012-06-29 | 2015-04-29 | 西托索尔本茨公司 | 使用聚合物的方法 |
| WO2014164800A1 (en) * | 2013-03-11 | 2014-10-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase combinatorial variants |
| WO2015081407A1 (pt) * | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Fundação Butantan | Uso de compostos químicos capazes de inibir a ação tóxica das esfingomie-linase d do veneno de aranhas loxosceles e composição farmacêutica compreendendo os referidos compostos |
| CN104017786A (zh) * | 2014-06-20 | 2014-09-03 | 天津科技大学 | 一种磷脂酶a2突变体及其制备方法 |
| CN104946668A (zh) * | 2015-06-29 | 2015-09-30 | 湖南省植物保护研究所 | cry1Ia基因及应用、由其编码的Cry1Ia蛋白及制备方法和应用 |
| CN106085984A (zh) * | 2016-06-02 | 2016-11-09 | 天津科技大学 | 一种新型磷脂酶d及其制备磷脂酸、磷脂酰丝氨酸的方法 |
| CN108118041A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-06-05 | 华南理工大学 | 一种磷脂酶d突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用 |
| JP2021101629A (ja) * | 2019-12-24 | 2021-07-15 | モレキュラー ヘルス ゲーエムベーハー | ゲノム解析および遺伝子解析用のシステム並びに方法 |
| CN112094853A (zh) * | 2020-09-24 | 2020-12-18 | 扬州大学 | 白斑综合征病毒vp28基因、重组蛋白、多克隆抗体及制备方法和应用 |
| CN112877377A (zh) * | 2021-01-15 | 2021-06-01 | 华南理工大学 | 一种高纯度甘油磷酸二酯的制备方法 |
| CN112662644A (zh) * | 2021-01-19 | 2021-04-16 | 华南理工大学 | 一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用 |
| CN113604453A (zh) * | 2021-07-12 | 2021-11-05 | 华南理工大学 | 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体和应用 |
| CN113801862A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-12-17 | 华南理工大学 | 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体及其重组表达菌株的制备方法 |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| "Constitutive and Lysophosphatidic Acid (LPA)-induced LPA Production: Role of Phospholipase D and Phospholipase A21";Astrid M. Eder等;《Clinical Cancer Research》;20060630;第6卷;第2482-2491页 * |
| "Phospholipase D Toxins of Brown Spider Venom Convert Lysophosphatidylcholine and Sphingomyelin to Cyclic Phosphates";Daniel M. Lajoie等;《Plos One》;20130829;第1-7页 * |
| "伪结核棒状杆菌毒力因子的研究进展";周作勇等;《中国人兽共患病学报》;20171215(第12期);第1115-1119页 * |
| "碱性鞘磷脂酶在结肠癌中作用研究进展";雒润华等;《交通医学》;20130820;第27卷(第4期);第319-322页 * |
| "磷脂改性现状";钱峰等;《粮食与油脂》;20060910(第09期);第7-9页 * |
| AltName: Full=Laz-SMase D ; AltName: Full=Phospholipase D * |
| Binford,G.J.等."RecName: Full=Dermonecrotic toxin LarSicTox-alphaIB2bi * |
| Flags: Precursor".《Genbank Database》.2020, * |
| Short=PLD ; AltName: Full=Sphingomyelinphosphodiesterase D 2 * |
| Short=SMD 2 ; Short=SMase D 2 ; Short=Sphingomyelinase D 2 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112662645A (zh) | 2021-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Romier et al. | Crystal structure of tRNA‐guanine transglycosylase: RNA modification by base exchange. | |
| CN108118041B (zh) | 一种磷脂酶d突变体、重组基因工程菌及其制备方法和应用 | |
| CN109055346B (zh) | 一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶 | |
| CN113801862B (zh) | 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体及其重组表达菌株的制备方法 | |
| WO2004056990A1 (ja) | 新規なニトリルヒドラターゼ | |
| CN112899256B (zh) | 一种来源于南极细菌的耐低温磷脂酶d及其制备方法和应用 | |
| CN108865962B (zh) | 一种可高效可溶性表达4-α-糖基转移酶的大肠杆菌工程菌 | |
| CN112662644B (zh) | 一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用 | |
| CN107794275B (zh) | 一种产(+)γ-内酰胺酶的重组毕赤酵母及其构建方法和应用 | |
| CN112662645B (zh) | 一种鞘磷脂酶d突变体及其应用 | |
| CN113736763B (zh) | 黑芥子酶Rmyr及其在制备萝卜硫素、莱菔素中的应用 | |
| CN113637654B (zh) | 一种重组磷脂酶d突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用 | |
| CN112661820B (zh) | 天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用 | |
| CN112725315B (zh) | 一种壳聚糖酶及其突变体在制备壳寡糖中的应用 | |
| CN111139229A (zh) | 一种新型gdsl家族脂类水解酶eii-2及其编码基因与应用 | |
| CN113604453B (zh) | 一种海洋链霉菌磷脂酶d突变体和应用 | |
| CN111808836B (zh) | 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用 | |
| CN110951711B (zh) | 一种具有降解手性酯活性的酯酶及其编码基因和应用 | |
| CN109251923B (zh) | 丝氨酸消旋酶突变体 | |
| CN114214308A (zh) | 一种经半理性改造提升活性的腈水解酶突变体 | |
| CN114525266B (zh) | 一种来源于南极细菌的磷脂酶d突变体及其应用 | |
| CN108690837B (zh) | 一种提高多聚体蛋白热稳定性的方法及热稳定性提高的醇脱氢酶 | |
| CN108220268B (zh) | 一种禾谷镰胞菌脂肪酶突变体及其编码基因和工程菌 | |
| JP3855097B2 (ja) | フコース特異的レクチン遺伝子 | |
| CN110862977B (zh) | 一种耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体h328d及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |