CN109355276B

CN109355276B - 一种普鲁兰酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN109355276B
Application number: CN201811426687.XA
Authority: CN
Inventors: 周哲敏; 周丽; 闫勤; 崔文璟; 刘中美; 庞博
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-11-27
Also published as: CN109355276A

Abstract

本发明公开了一种普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明构建了一种普鲁兰酶突变体，得到的单突变体K419R(第419位赖氨酸突变为精氨酸)的酶活是野生型的1.3，67℃保温30min剩余酶活达67.3U/mg；迭代突变体K419R+Y102C+K383C(第419位赖氨酸突变为精氨酸，第102位酪氨酸和第383位赖氨酸分别突变为半胱氨酸)的酶活提高为野生型的2倍，在67℃保温30min剩余酶活达88.3U/mg，为保温前的43.1％，具有较好的热稳定性。本发明的普鲁兰酶突变体能够应用于淀粉糖化过程。

Description

一种普鲁兰酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种普鲁兰酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶是α-1,6-糖苷键水解酶，能够专一、高效地切割支链淀粉中的支链，被广泛地应用于现代淀粉糖工业中，成为高品质糖浆生产过程中的关键酶制剂。淀粉糖化过程需要在高温(60-65℃)下进行，糖化时间一般为48-60h，因此，普鲁兰酶必须具备在高温下保持较高酶活性和稳定性的能力。

淀粉糖化生产的葡萄糖浆不但可以生产结晶葡萄糖、高果糖浆，还可以作为最主要的发酵碳源，因此现阶段对能够与糖化酶复配的普鲁兰酶的开发也尤为重要。近年来，国内对普鲁兰酶的研究逐渐升温，取得了许多较好的研究成果，但是在高活性、耐热普鲁兰酶的开发上仍然存在一些问题，主要表现为开发的普鲁兰酶难以同时满足淀粉糖化过程对普鲁兰酶性质的苛刻要求。

本发明使用的野生型普鲁兰酶在最适反应条件下比酶活为102.7±1.7U/mg，67℃保温30min残余酶活仍剩余50％以上。其热稳定性较诺维信公司的商业普鲁兰酶(60℃，pH5.0条件下半衰期仅为35min)有明显优势。因此，如果能够通过基因工程和分子生物学手段对本发明使用的野生型普鲁兰酶进行酶学性质改造，提高其比活力，那么就可能打破国外公司对该酶的长期垄断地位，使我国在普鲁兰酶工业应用领域有自主产权和技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种普鲁兰酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的普鲁兰酶第419位氨基酸进行突变；

或，同时将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的普鲁兰酶第419位、第102位、第383位氨基酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ IDNO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为K419R。

在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过同时将出发氨基酸序列为SEQID NO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸、第102位酪氨酸突变为半胱氨酸、第383位氨基酸赖氨酸突变为半胱氨酸得到的，突变体命名为K419R+Y102C+K383C。

所述普鲁兰酶的来源为Anoxybacillus sp.WB42。

所述普鲁兰酶突变体的基因。

携带普鲁兰酶突变体基因的载体。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种普鲁兰酶突变体的方法，包括如下步骤：

(1)在普鲁兰酶氨基酸序列上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，分别纯化普鲁兰酶突变体K419R和迭代突变体K419R+Y102C+K383C。

携带普鲁兰酶突变体的基因或普鲁兰酶突变体基因的载体的宿主细胞。

所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述普鲁兰酶突变体在淀粉糖化中的应用。

本发明取得的有益效果：

本发明构建了一种普鲁兰酶突变体，得到的单突变体K419R(第419位赖氨酸突变为精氨酸)的酶活是野生型的1.3倍，67℃保温30min剩余酶活为67.3U/mg；迭代突变体K419R+Y102C+K383C(第419位赖氨酸突变为精氨酸，第102位酪氨酸和第383位赖氨酸分别突变为半胱氨酸)的酶活是野生型的2倍，67℃保温30min剩余酶活为88.3U/mg，是保温前的43.1％，具有较好的热稳定性。

本发明的环普鲁兰酶突变体能够应用于淀粉糖化中。

附图说明

图1pET-22b(+)-pulA定点突变全质粒PCR结果，其中1表示DNA marker；2表示pET-22b(+)-pulA定点突变全质粒PCR结果。

图2普鲁兰酶的纯化结果，其中1表示protein marker；2表示纯化后的普鲁兰酶。

具体实施方式

本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

下述实施例中涉及的培养基、缓冲液如下：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L。

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L。

结合缓冲溶液：50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑。

磷酸盐缓冲液：50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl。

实施例1：重组菌构建

根据来源于Anoxybacillus sp.WB42(Wang J，Liu Z，Zhou Z.Cloning andcharacterization of a novel thermophilic amylopullulanase with a type Ipullulanase structure from Anoxybacillus sp.WB42[J].

2018，70(5-6)：1700265.doi：10.1002/star.201700265)的普鲁兰酶如SEQ ID NO.2所示的碱基序列，设计普鲁兰酶的克隆引物如表1所示，用于构建大肠杆菌的质粒是pET-22b(+)，带有Nde I、XhoI酶切位点。将普鲁兰酶克隆至载体pET-22b(+)的Nde I、Xho I酶切位点之间，得到重组质粒pET-22b(+)-pulA。步骤如下：

(1)普鲁兰酶克隆引物的设计；

(2)以Anoxybacillus sp.WB42为模板对基因pulA进行PCR克隆；

(3)将上述PCR产物进行回收纯化，用限制性内切酶Nde I、Xho I分别对纯化后的PCR产物和载体pET-22b(+)进行双酶切，之后对酶切产物回收纯化；

(4)将酶切纯化后的PCR产物和载体在DNA连接酶的作用下连接过夜，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行测序。

实施例2：普鲁兰酶突变体的制备

(1)单突变体

根据如SEQ ID NO.2所示的普鲁兰酶的基因序列，设计并合成引入突变体K419R的引物，利用快速PCR技术，以携带编码野生型普鲁兰酶的基因的重组质粒pET-22b(+)-pulA为模板，对普鲁兰酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第419位赖氨酸密码子变成精氨酸密码子，得到单突变体普鲁兰酶K419R。

引入K419R突变的定点突变引物为：

核苷酸序列为SEQ ID NO.3的正向引物：

5’-GCATTCTCGATATTGACACGATGCGTGAAGTC-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列为SEQ ID NO.4的反向引物：

5’-ACAACTGCCTCGACTTCACGCATCGTGTC-3’(下划线为突变碱基)

PCR反应体系见表1：

表1 PCR反应体系

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；随后25个循环(98℃10s，55℃30s，72℃2min)；72℃继续延伸10min。

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1。

将验证正确的PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)上，挑克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌分别命名为E.coliJM109/pET-22b(+)-pulA(K419R)。

将测序正确的突变体从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到的重组菌命名为E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-pulA(K419R)。

(2)普鲁兰酶迭代突变体

以(1)中得到的单突变体K419R编码基因为模板，设计并合成引入Y102C和K383C突变的引物，利用快速PCR技术，以携带编码单突变体K419R的基因的重组载体pET-22b(+)-pulA(K419R)为模板，对普鲁兰酶基因进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第102位酪氨酸密码子变成半胱氨酸密码子、第383位赖氨酸密码子变成半胱氨酸密码子的迭代突变体K419R+Y102C+K383C。

引入Y102C+K383C突变的定点突变引物为：

核苷酸序列为SEQ ID NO.5的正向引物：

5’-AAGCATTTGATGAGCAGTTTTGTTATGACG-3’(下划线为突变碱基)

核苷酸序列为SEQ ID NO.6的反向引物：

5’-ACAATGAGCTTGCGAACCATACAGCGCTCG-3’(下划线为突变碱基)

PCR反应体系、扩增条件及产物检测方法同(1)。

将验证正确的PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌分别命名为E.coliJM109/pET-22b(+)-pulA(K419R+Y102C+K383C)。

测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到的重组菌命名为E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-pulA(K419R+Y102C+K383C)。

实施例3：普鲁兰酶的发酵与纯化

挑取表达野生型普鲁兰酶的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-pulA接种于5ml的LB培养基(含100μg/mL氨苄抗生素)中，37℃、200r/min振荡过夜培养。将过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于100mL LB培养基(含100μg/mL氨苄抗生素)中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀至0.6-0.8时，加入10μM诱导剂IPTG，16℃诱导16-18h得到菌体，4℃、8000r/min的转速离心收集重组菌体。

将上述离心收集的重组菌体溶于20mL结合缓冲溶液，超声破碎，13000g离心25min后，将上清液用0.22μm滤膜过滤。然后用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的His TrapHP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用8倍柱体积的150、300和500mmol/L咪唑的缓冲液洗脱蛋白，收集样品，4℃、2L磷酸盐缓冲透析20h后，即得野生型的纯化普鲁兰酶，SDS-PAGE分析鉴定结果如图2所示；

采用同样的方法获得重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-pulA(K419R)和E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-pulA(K419R+Y102C+K383C)的纯化普鲁兰酶。

实施例4：普鲁兰酶酶活及其酶热稳定性的测定

测定普鲁兰酶野生型、突变体K419R和突变体K419R+Y102C+K383C在摇瓶发酵的酶活及酶热稳定性。酶活测定方法：70μL的反应体系(10μL终浓度100mM pH 5.8醋酸缓冲液、40μL初始浓度6％普鲁兰多糖和20μL初始浓度30μg/mL纯酶液)在65℃反应15min，加入70μLDNS反应液，沸水浴6min，流水速冷至室温，加蒸馏水稀释，混匀，测定OD₄₇₆。1个酶活力单位(U)定义为在测定条件下，每分钟释放相当于1μmol葡萄糖还原力的还原糖所需要的酶量。

酶热稳定性的测定方法：20μL初始浓度30μg/mL纯酶液与10μL终浓度100mM pH5.8醋酸缓冲液混匀，在67℃条件下保温30min，迅速冷却至4℃，加入40μL初始浓度6％普鲁兰多糖于65℃反应15min，加入70μL DNS反应液，沸水浴6min，流水速冷至室温，加蒸馏水稀释，混匀，测定OD₄₇₆，计算普鲁兰酶剩余酶活。

结果见表2，突变体与野生型的普鲁兰酶相比，单突变体K419R的酶活是野生型的1.3倍，67℃保温30min剩余酶活达67.3U/mg；迭代突变体K419R+Y102C+K383C的酶活是野生型的2倍，在67℃保温30min剩余酶活达88.3U/mg，为保温前的43.1％，具有较好的热稳定性。

表2普鲁兰酶酶活及热稳定性比较

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种普鲁兰酶突变体及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 711

<212> PRT

<213> Anoxybacillus sp.WB42

<400> 1

Met Leu Thr Val His Arg Thr Phe Glu Ala Tyr Leu Asp Thr Met Glu

1 5 10 15

Thr Ile Thr Ile Leu Val Pro Lys Ser Tyr Cys Gln Gly Ile Val Arg

20 25 30

Ser Phe Thr Ile Gln Thr Pro Asn Gly Glu Arg Arg Ala Leu Gln Ile

35 40 45

Thr Lys Arg Glu Asp Leu Trp Thr Ser Ile Lys Tyr Glu Cys Ile Pro

50 55 60

Asp Val Pro Val Glu Ile Gly Lys Ser Tyr Phe Ile Tyr Glu Glu His

65 70 75 80

Gly Ala Phe Thr Asp Leu Gln Met Gly Ala Val Ile Arg Thr Glu Ala

85 90 95

Phe Asp Glu Gln Phe Tyr Tyr Asp Gly Asp Leu Gly Ile Thr Tyr Ser

100 105 110

Asn Asp Ala Thr Thr Phe Lys Leu Trp Ala Pro Thr Ala Thr Glu Val

115 120 125

Lys Leu Lys Leu Ile Asn Lys Ala Gly Lys Glu Glu Gln Ile Ser Met

130 135 140

Gln Arg Gly Glu Lys Gly Val Trp Cys Ala Thr Val Leu Gly Asn Leu

145 150 155 160

Asp Gly Ile Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ala Cys Ile Asn Leu Val Trp Arg

165 170 175

Glu Ala Val Asp Pro Tyr Ala Val Ala Val Ser Val Asn Gly Glu Tyr

180 185 190

Gly Val Val Val Asp Leu Ala Lys Thr Arg Val Pro Lys Pro Ala Leu

195 200 205

Pro Pro Leu Thr Ala Pro Val Asp Ala Ile Ile Tyr Glu Met His Val

210 215 220

Arg Asp Phe Thr Ile Asp Pro His Ser Gly Val Val His Lys Gly Lys

225 230 235 240

Tyr Leu Gly Leu Thr Glu Phe Pro Thr Thr Glu Pro Ser Gly Thr Val

245 250 255

Thr Gly Leu Ala Tyr Leu Lys Gln Leu Gly Val Thr His Val Glu Leu

260 265 270

Leu Pro Val Asn Asp Phe Ala Gly Val Asp Glu Arg Glu Pro Glu Lys

275 280 285

Glu Tyr Asn Trp Gly Tyr Asn Pro Leu His Tyr Asn Ala Pro Glu Gly

290 295 300

Ser Tyr Ala Thr Asp Pro Tyr Asp Pro Tyr Ala Arg Ile His Glu Leu

305 310 315 320

Lys Arg Ala Ile Arg Ala Leu Gln Gln Glu Gly Ile Arg Val Ile Leu

325 330 335

Asp Val Val Tyr Asn His Val Tyr Ile Arg Glu Gln Ser Ser Leu Glu

340 345 350

Lys Leu Val Pro Gly Tyr Tyr Phe Arg His Asp Ile Tyr Gly Met Pro

355 360 365

Ser Asn Gly Thr Gly Val Gly Asn Asp Leu Ala Pro Glu Arg Lys Met

370 375 380

Val Arg Lys Leu Ile Val Asp Ser Val Arg Phe Trp Leu Thr Glu Tyr

385 390 395 400

Gly Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Gly Ile Leu Asp Ile Asp

405 410 415

Thr Met Lys Glu Val Glu Ala Val Val Arg Ala Leu His Pro Ser Ala

420 425 430

Leu Leu Leu Gly Glu Gly Trp Asp Leu Pro Thr Pro Leu Pro Ser Glu

435 440 445

Lys Lys Ala Thr Met Gln Asn Ala His Leu Leu Pro Thr Ile Ala Phe

450 455 460

Phe Asn Asp Arg Phe Arg Asp Tyr Val Lys Gly Ser Thr Phe His Leu

465 470 475 480

Gly Glu Gln Gly Phe Val Leu Gly Asn Ser Ala His Arg Glu Gln Val

485 490 495

Lys Arg Val Ile Glu Gly Ser His His Leu Phe Ser Gln Pro Thr Gln

500 505 510

Thr Val Asn Tyr Val Glu Ser His Asp Asn His Thr Leu Trp Asp Lys

515 520 525

Met Ser Ile Ala Asn Tyr Tyr Glu Arg Glu Thr Ile Arg Lys Lys Arg

530 535 540

Gln Lys Leu Ala Thr Ala Met Thr Leu Leu Ala Gln Gly Ile Pro Phe

545 550 555 560

Leu His Ser Gly Gln Glu Phe Tyr Arg Thr Lys Gln Gly Val Glu Asn

565 570 575

Ser Tyr Asn Ala Pro Asp Asp Ile Asn Arg Ile Asp Trp Thr Arg Lys

580 585 590

Ser Met His Glu Gln Asp Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Ile Arg Leu

595 600 605

Arg Lys Trp His Gly Ala Phe Arg Phe Gln Thr Val Glu Glu Ile Arg

610 615 620

Asn His Leu Val Trp Leu Glu Pro Met Pro Ser Thr Val Leu Ala Phe

625 630 635 640

His Leu Tyr Asp Val Ser Ala Tyr Gly Pro Trp Arg Asp Ile Ile Val

645 650 655

Ile His His Asn Glu Glu Thr Arg Leu Ala Val Ala Leu Pro Asp Glu

660 665 670

Glu Arg Trp Tyr Val Val Cys Asp Glu Thr Arg Ser Gly Ile Asp Pro

675 680 685

Leu Tyr Ala Ala Thr Lys Lys Ile Glu Leu Gln Gly Ile Gly Thr Val

690 695 700

Val Leu Val Lys Gly Leu Thr

705 710

<210> 2

<211> 2136

<212> DNA

<213> Anoxybacillus sp.WB42

<400> 2

atgctaacgg ttcatcggac gtttgaagca tatttagata caatggaaac gattacgatt 60

ttagtaccga aatcgtattg ccaagggata gtgcgctcat ttaccatcca aacgccaaac 120

ggagaacgac gcgcactaca aattacgaaa cgcgaagatt tatggacgag cattaaatat 180

gagtgcatcc ccgatgttcc ggtggaaatc ggaaaaagtt atttcattta tgaagaacat 240

ggggcgttta ccgatttgca aatgggagcg gttattcgca ccgaagcatt tgatgagcag 300

ttttattatg acggtgacct tggcattacg tacagcaacg atgccacaac gtttaaactt 360

tgggcaccga cagcaacaga ggtaaaacta aagctcatta acaaagcagg aaaagaagaa 420

caaatctcga tgcagcgcgg agaaaaaggg gtatggtgcg cgacagtact cggtaattta 480

gatgggatat actatacgta tttagcgtgt attaaccttg tttggcgaga agcggtcgac 540

ccgtatgctg tagcggtatc ggtgaatgga gaatacgggg tcgtcgtcga tctcgccaaa 600

acgcgagtgc ccaaaccagc gctacctccg cttactgccc cagtcgatgc cattatttat 660

gaaatgcacg ttcgtgattt tacaattgat cctcatagcg gcgttgtcca taaaggaaag 720

tatctaggac tgactgaatt tccaacaaca gaaccgtctg gaacagtgac ggggcttgct 780

tatttgaaac aacttggggt tacacacgta gagctgcttc cggtgaacga ttttgccggg 840

gtcgatgaac gtgaaccgga aaaagagtac aactgggggt acaatccgct tcactacaac 900

gcgccggaag gaagttatgc gaccgatcct tacgatccgt atgcgcgtat tcatgaattg 960

aaacgagcaa ttcgcgcttt gcagcaagaa ggtattcgtg tcattctcga tgtcgtttat 1020

aaccacgttt acattcgcga acagtcgtca ctagaaaaac tcgtgcctgg gtattatttt 1080

cgccatgata tttacggtat gccatcgaac gggacagggg tcggaaatga tcttgccccc 1140

gagcgcaaaa tggttcgcaa gctcattgtc gattccgttc gtttctggct tacagagtat 1200

ggcattgatg ggtttcgttt tgatttaatg ggcattctcg atattgacac gatgaaagaa 1260

gtcgaggcag ttgttcgtgc gctccatcca tccgctctat tgctcggcga aggatgggat 1320

ttgccgacac cattgccgtc ggaaaaaaaa gcaacgatgc aaaatgccca ccttctgccg 1380

acgattgcct tttttaacga tcggtttcgc gattatgtca aagggagtac gtttcattta 1440

ggggaacaag gatttgttct aggaaacagc gcacatcgcg aacaagtgaa acgagtaatc 1500

gaaggaagcc atcatttgtt ttctcaacca acgcaaacgg ttaactacgt cgaatcacac 1560

gacaaccata cgctttggga caaaatgagc atcgccaact attacgagcg agaaaccatt 1620

cgtaaaaaac gacaaaaatt agcgacagcg atgaccttat tagcacaagg cattccattt 1680

ttgcatagcg gccaagaatt ttaccgtaca aaacaaggag tagaaaatag ttataacgct 1740

ccagatgaca ttaaccgcat cgattggacg agaaaaagca tgcacgaaca agacgtccgt 1800

tacgtgcaag gattgattcg gctgcggaaa tggcacggtg cttttcgttt tcaaacagtg 1860

gaagaaataa gaaaccatct tgtatggctt gaaccgatgc cgtcgacagt gctcgctttt 1920

catctttacg acgtatcagc gtatgggccg tggcgtgata ttattgtcat tcaccataat 1980

gaagaaacac ggctagcagt tgcgctccct gatgaagaaa gatggtatgt cgtatgtgat 2040

gaaacaagga gtggaatcga tcctctttac gcggcgacaa aaaaaatcga gctgcaagga 2100

attggaacag tcgtgcttgt gaaaggactg acttaa 2136

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcattctcga tattgacacg atgcgtgaag tc 32

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acaactgcct cgacttcacg catcgtgtc 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aagcatttga tgagcagttt tgttatgacg 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

acaatgagct tgcgaaccat acagcgctcg 30

Claims

1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQID NO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸；

或，同时将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的普鲁兰酶第419位赖氨酸突变为精氨酸、第102位酪氨酸突变为半胱氨酸、第383位氨基酸赖氨酸突变为半胱氨酸。

2.根据权利要求1所述的普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述普鲁兰酶的来源为Anoxybacillus sp.WB42。

3.编码权利要求1所述普鲁兰酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的载体。

5.制备权利要求1所述普鲁兰酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）在普鲁兰酶氨基酸序列上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带普鲁兰酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

（2）将突变体质粒转化进宿主细胞；

（3）挑选阳性克隆进行发酵培养，分别纯化普鲁兰酶突变体。

6.携带权利要求3所述基因或权利要求4所述载体的宿主细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

8.权利要求1所述的普鲁兰酶突变体在淀粉糖化中的应用。