CN106047844B - 一种具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有高麦芽糖生成率的真菌α‑淀粉酶变体及其制备方法，所述α‑淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO：2所示区域77‑81区、135‑140区、214‑220区、331‑335区的一个或多个区域和/或位置的取代，所述变体具有α‑淀粉酶活性。本发明提供了一种具有高麦芽糖生成率的真菌α‑淀粉酶变体，与亲本真菌α‑淀粉酶相比，本发明提供的一种真菌α‑淀粉酶变体的淀粉水解物中麦芽糖含量提高了约5％，在高麦芽糖浆的工业化生产中具有应用优势。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体及其制备方法。
背景技术
高麦芽糖浆是一种以麦芽糖为主(通常含量>50％)的淀粉糖，在食品和饮料行业具有广泛的应用。在现代淀粉糖行业，高麦芽糖浆主要采用酶转化淀粉工艺进行生产。随着糖化工艺的改进，真菌α-淀粉酶已逐渐替代β-淀粉酶做为糖化剂用于高麦芽糖浆的生产，成为高麦芽糖浆生产过程中的关键酶制剂。真菌α-淀粉酶之所以能够替代相对昂贵的β-淀粉酶，是因其具有特殊的产物生成能力——高麦芽糖生成能力。高麦芽糖浆品质的高低依据糖浆中麦芽糖的含量而定，因此，在高麦芽糖浆的工业生产过程中，真菌α-淀粉酶催化水解淀粉所生成的终产物中麦芽糖浓度的高低是评价其应用性能的一个重要特征指标。
因此，提高真菌α-淀粉酶的高麦芽糖生成能力，对真菌α-淀粉酶在高麦芽糖浆的工业生产过程中的应用是有利的。
真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)晶体结构模型研究表明，该淀粉酶家族蛋白通常含有4个保守区域(Region I-VI)和3个功能性结构域(Functional Domains)，分别为A、B和C。A为酶的催化反应中心区域，其典型结构为(α/β)8TIM-桶状结构；B位于TIM-桶状结构的第3个β-折叠和第3个α-螺旋之间，与α-淀粉酶的底物特异性有关；C形成α-淀粉酶蛋白质的羧基端，并含有α-淀粉酶家族所特有的希腊钥匙状β-Sandwich结构，一般认为其通过结构域A的疏水区域与溶剂相隔离以稳定催化区域的TIM-桶状结构。通过X-射线晶体结构、化学修饰和定点突变等研究，发现Asp206，Glu230和Asp297等3个氨基酸可能是Taka-淀粉酶及α-淀粉酶家族的核心催化位点。在水解替换反应中，认为Glu230是质子供体，Asp206具有亲质子作用，Asp297在催化过程中可能对酶和底物复合物的结合状态起稳定作用(fixer)。此外，α-淀粉酶的活性位点还包含许多亚位点(Subsites)，亚位点由位于连接β-折叠和α-螺旋环型结构中的氨基酸残基组成，且每个亚位点均可以与底物的糖基配基进行作用。由于不同α-淀粉酶的结构不同，β-折叠和α-螺旋的连接环的大小和形状不同，所以亚位点在不同淀粉酶中的存在形式和作用方式也不同，并因此赋予了不同淀粉酶以特有的功能和性质(Nielsen JE,Borchert TV.Protein engineering of bacterial alpha-amylases.Biochim Biophys Acta,2000,1543(2):253-274)，由此推测真菌α-淀粉酶的高麦芽糖生成能力极可能是由其亚位点结构决定的。虽然有关α-淀粉酶结构与功能关系的研究在酶催化效率、热/酸/碱稳定性及底物特异性等方面有很多报道，如江南大学杨海泉、陈坚等(Yang H,Liu L,Shin H-d,et al.Integrating terminal truncation andoligopeptide fusion for a novel protein engineering strategy to improvespecific activity and catalytic efficiency:alkaline alpha-amylase as a casestudy.Appl Environ Microbiol,2013,79(20):6429-6438)运用生物信息学分析结合蛋白质三级结构建模，对Alkalimonas amylolytica碱性α-淀粉酶催化活性中心的甲硫氨酸进行组合突变并确定了与热稳定性、催化效率或碱稳定性相关的关键氨基酸，中国农业大学韩鹏、江正强等(Han P,Zhou P,Hu SQ,et al.A novel multifunctionalα-amylase fromthe thermophilic fungus Malbranchea cinnamomea:Biochemical characterizationand three-dimensional structure.Appl Biochem Biotechnol,2013,170:420-435.)对Malbranchea cinnamomeaα-淀粉酶的催化功能及其三维结构进行了大量研究，但是关于α-淀粉酶结构与其高麦芽糖生成能力之间关系的研究则鲜有报道。
目前工业应用及专利公开的主要是曲霉属，尤其是米曲霉α-淀粉酶。诺维信公司的一篇专利“Fungamyl样α-淀粉酶变体”(专利公开号：CN1654641A)公开了一种用于产生亲本Fungamyl样α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，该淀粉酶来源于米曲霉，该淀粉酶变体相对于亲本提高了热稳定性，但并未涉及提高真菌α-淀粉酶麦芽糖生成率的方法。
目前工业应用及专利公开的真菌α-淀粉酶主要来源于曲霉属，尤其是米曲霉或黑曲霉。米曲霉或黑曲霉α-淀粉酶作用淀粉的终产物中麦芽糖含量极限值约为60％(w/w)左右，工业应用中麦芽糖生成率一般在40％～45％之间，具有麦芽糖生成率相对较低的特点。
发明内容
根据以上现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提出一种具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体及其制备方法，结合生物信息学、基因工程和蛋白质工程等技术手段，获得了真菌来源的亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶变体，目的是使淀粉水解物中的麦芽糖含量提高。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体在对应于SEQID NO：2所示区域77-81区、135-140区、214-220区、331-335区的一个或多个区域和/或位置的取代，所述变体具有α-淀粉酶活性。
所述真菌α-淀粉酶得自丝状真菌，所述丝状真菌为根霉属的米根霉。
所述真菌α-淀粉酶变体为选自一种亲本真菌α-淀粉酶的变体，所述亲本真菌α-淀粉酶与SEQ ID NO：1所示编码α-淀粉酶的DNA序列和/或SEQ ID NO：2所示成熟蛋白质所含氨基酸序列至少有75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的同一性或相似性。
所述具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
a、以编码SEQ ID NO：2所示亲本真菌α-淀粉酶成熟蛋白质的DNA序列模板，依据原氨基酸和替换氨基酸对应的遗传密码的差别设计引物，通过PCR扩增方法对所述DNA序列引入突变，达到对亲本真菌α-淀粉酶的定点突变；将得到的PCR产物连接入克隆载体pMD18-simple，并转化E.coli JM109，抽提质粒并对插入的DNA片段进行序列测定，以获得阳性重组子；
b、将得到的PCR产物经克隆、转化、抽提质粒、重组表达质粒载体导入受体菌感受态细胞和抽提所述导入受体菌感受态细胞得到的重组质粒并导入表达宿主感受态细胞，获得携带α-淀粉酶变体编码基因的重组宿主细胞；
c、将重组宿主细胞经发酵培养和低温诱导表达获得发酵细胞液；
d、离心收集发酵细胞液中的细胞，并经过超声破碎、硫酸铵沉淀、透析及亲和层析得到。
所述原氨基酸指SEQ ID NO：2所述亲本真菌α-淀粉酶中待突变或被替换的氨基酸。
所述替换氨基酸指在α-淀粉酶突变体中取代原氨基酸的氨基酸。
所述遗传密码指核苷酸序列中编码蛋白质中对应氨基酸的三联密码子，
所述阳性重组子指包含按设计在既定位置发生碱基变化的DNA序列的E.coli重组菌。
所述宿主细胞为革兰氏阴性细菌。革兰氏阴性细菌优选为大肠杆菌。
真菌α-淀粉酶变体的制备：抽提上述阳性重组子中的质粒DNA，使用限制性核酸内切酶EcoRI和NotI进行双酶切并与同等双酶切的表达型质粒载体pET-28a(+)相连接，利用化学转化法将连接产物导入受体菌E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pET-Roamy，抽提该重组质粒并导入表达宿主菌E.coli BL21感受态细胞，获得携带α-淀粉酶变体编码基因的重组大肠杆菌。上述重组大肠杆菌经发酵培养和低温诱导表达后获得发酵细胞液。离心收集上述细胞液中的细胞并采用超声波破碎法进行破碎，细胞破碎液中α-淀粉酶经过硫酸铵沉淀、透析及亲和层析等步骤得以纯化，即得到含有α-淀粉酶变体的酶液，进一步测定α-淀粉酶活力及淀粉酶解产物。
所述感受态细胞采用氯化钙法制得。
所述发酵培养指摇瓶发酵培养，具体为重组大肠杆菌在LB培养基中培养24h，培养温度为28～37℃，在恒温摇床中培养时转速为200rpm。
所述摇瓶发酵采用250mL三角瓶，装液量为30％。
所述LB培养基成分为每L含有酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，氨苄青霉素钠120mg，pH为7.0。
所述诱导表达指重组大肠杆菌在发酵培养过程中的光密度值达到1.2～1.6时，向发酵液中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mmol/L，以起始质粒pET-Roamy中强启动子的功能，从而实现α-淀粉酶的表达。
所述低温诱导表达指加入IPTG后将培养温度调节至28℃，减慢菌体的生长或代谢速率，利于异源蛋白质的可溶性表达。
所述强启动子指载体pET-28a(+)存在的T7启动子，该启动子在无葡萄糖而有乳糖或乳糖结构类似物(IPTG)诱导的情况下处于开启状态，可以起始其下游基因的转录活动。
所述超声波破碎采用功率为400W，破碎时间为10min，使用冰水控制环境温度为0℃。
所述硫酸铵沉淀指硫酸铵分级沉淀，本发明采用终浓度为75％的硫酸铵进行沉淀。
所述透析指使用透析袋将硫酸铵的酶蛋白在4℃的去离子水中透析24h。
所述亲和层析指利用Ni亲和柱对淀粉酶蛋白进行纯化，纯化条件为：结合缓冲液(A液)为：20mmol/L Tris,pH 8.0,0.5mol/L NaCl,1％(v/v)Triton X-100,10％(w/v)甘油,10mmol/Lβ-巯基乙醇；洗脱缓冲液(B液)为A液加200mmol/L咪唑。使用20％～100％B液的线性梯度洗脱10个柱体积，流速为1mL/min。
所述α-淀粉酶活力测定方法为：取1mL可溶性淀粉(1％,w/v)与0.25mL柠檬酸–Na2HPO4缓冲液(0.2mol/L,pH 5.0)混合，50℃温浴5min后加入0.1mLα-淀粉酶液，继续保温10min后立即加入0.1mL HCl溶液(0.1mol/L)终止反应，加入3mLDNS试剂沸水浴10min，冷却后加水稀释至25mL，测定520nm处吸光值。一个α-淀粉酶酶活单位(U)定义为：在上述反应条件下，每分钟生成1mg麦芽糖所需的酶量。
所述淀粉酶解产物的测定方法为：使用柠檬酸–Na2HPO4缓冲液(0.2mol/L,pH5.0)缓冲液配制可溶性淀粉溶液(1％,w/v)，在1mL淀粉溶液中加入0.2mL酶液(10U)，并在40℃下反应，取不同保温时间的样品使用高压液相色谱(HPLC)方法进行产物分析。HPLC方法测定条件：使用Agilent氨基柱(ZORBAX NH2，4.6×250mm,5μm)检测，以65％乙腈为流动相，流速为1mL/min，柱温为40℃。
所述变体为R333H，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述变体为R333H+Y80L，所述引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明有益效果是:本发明提供了一种具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体，与亲本真菌α-淀粉酶相比，本发明提供的一种真菌α-淀粉酶变体的淀粉水解物中麦芽糖含量提高了约5％，在高麦芽糖浆的工业化生产中具有应用优势。
具体实施方式
下面通过对实施例的描述，对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。
本发明的技术方案如下：
改变真菌α-淀粉酶麦芽糖生成率需要突变的位点
以米曲霉α-淀粉酶TAA(Yoshiki M.A possible mechanism of catalysisinvolving three essential residues in the enzymes ofα-amylasefamily.Biologia,Bratislava,2002,57(11):21-27)为模板建立亲本真菌α-淀粉酶的分子结构模型，利用分子动力学模拟和分子对接等生物信息学分析手段(Bin Tang,YingyingZhang,Yaping Yang,Zhewei Song,Xianglin Li.Expression and functional analysisof a glycoside hydrolase family 45endoglucanase from Rhizopusstolonifer.World J Microbiol Biotechnol,2014,30:2943-2952)分别对真菌α-淀粉酶的亲本α-淀粉酶和变体与底物的对接方式进行模拟，根据酶与底物对接过程中的空间堆积效果和氢键作用方式的变化，发现适合突变的区域，获得具体的提高真菌α-淀粉酶麦芽糖生成率的突变区域为：
77-81区
135-140区
214-220区
331-335区
上述区域为SEQ ID NO：2所示的亲本真菌α-淀粉酶成熟蛋白质所含氨基酸残基所在区域，为真菌α-淀粉酶内在空间结构上靠近催化中心、与催化或底物结合相关的关键氨基酸残基所在区域，区域内氨基酸残基的变化可以引起酶分子与底物对接方式的改变。
本发明涉及上述区域和/或位置的一个或多个氨基酸残基的变化。
在一个实施方案中，选择的突变区域为77-81区，具体为一或多个该区域内氨基酸的位置：77，78，79，80，81。
具体的替换是：
77R，L；
78X，优选L，I，Y；
79L，E，W；
80I，S，L，D，R，H，优选L，D，H；
81X，优选H，E，V。
在一个实施方案中，选择的突变区域为135-140区，具体为一或多个该区域内氨基酸的位置：135，136，137，138，139，140。
具体的替换是：
135D，S，Q；
136R，H，T；
137X，优选E，H，L；
138T，K，V；
139T，Q，V，R；
140X，优选S，L，X，H。
在一个实施方案中，选择的突变区域为214-220区，具体为一或多个该区域内氨基酸的位置：214，215，216，217，218，219，220。
具体的替换是：
214I，T，E，Q，S，D，优选T，S，D；
215S，T，R；
216X，优选L，R，S；
217T，S，L，N，D，优选S，L，N；
218N，H，R；
219R，W，E；
220L，H，D。
在一个实施方案中，选择的突变区域为331-335区，具体为一或多个该区域内氨基酸的位置：331，332，333，334，335。
具体的替换是：
331Q，D，R；
332Q，D，H；
333L，H，E，V，A，优选H，E，V；
334X，优选S，H，Q，L；
335I，S，D，R，H，W，L优选S，R，L。
所述氨基酸残基指α-淀粉酶分子中去除形成肽键部分的氨基酸结构。
对上述实施方案的进一步描述：所述位置指氨基酸在序列SEQ ID NO：2中所在位置，例如77，指序列SEQ ID NO：2中77位点的酪氨酸(Tyr)；例如77R，也可以表示为Y77R，L表示77位点的酪氨酸被精氨酸或亮氨酸取代；例如78X，也可以表示为H78X，指78位点的氨基酸可以是G，A，V，L，I，S，T，C，M，D，E，N，Q，K，R，H，P，F，Y，W中的任一个；实施方案中的其它氨基酸位点描述与此处氨基酸位点举例描述具有相同意义。
所述底物包括麦芽糖、麦芽三糖或短链糊精(含有10-15个葡糖糖单元结构)，具体为麦芽三糖，据文献报道推测真菌α-淀粉酶对麦芽三糖表现的特殊催化形式和水解能力可能是其具有高麦芽糖生成能力的主要原因(Doyle EM,Kelly CT,Fogarty WM.The highmaltose-producingα-amylase of Penicillium expansum.Appl Microbiol Biotechnol,1989,30(5):492-496)。
所述亲本真菌α-淀粉酶与SEQ ID NO：1所示编码α-淀粉酶的DNA序列和/或SEQ IDNO：2所示成熟蛋白质所含氨基酸序列至少有75％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少99％的同一性或相似性。
所述同一性或相似性指DNA序列和/或氨基酸序列在进行两两比对时所具有的接近或相似程度，可以利用现有的计算机软件，如DNAMAN(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.,and Lipman,D.J.Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.,1990,215:403)和/或BioEdit(Hall,T.A.BioEdit:a user-friendly biologicalsequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.NuclAcids Symp Ser,1999,41:95-98)进行分析。
亲本真菌α-淀粉酶的突变
以编码SEQ ID NO：2所示亲本真菌α-淀粉酶成熟蛋白质的DNA序列模板，依据原氨基酸和替换氨基酸对应的遗传密码的差别设计引物，通过PCR技术对上述DNA序列引入突变，从而达到对亲本真菌α-淀粉酶的定点突变。将得到的PCR产物连接入克隆载体pMD18-simple，并转化E.coli JM109，抽提质粒并对插入的DNA片段进行序列测定，以获得阳性重组子。
真菌α-淀粉酶变体的制备
抽提上述阳性重组子中的质粒DNA，使用限制性核酸内切酶EcoRI和NotI进行双酶切并与同等双酶切的表达型质粒载体pET-28a(+)相连接，利用化学转化法将连接产物导入受体菌E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pET-Roamy，抽提该重组质粒并导入表达宿主菌E.coli BL21感受态细胞，获得携带α-淀粉酶变体编码基因的重组大肠杆菌。上述重组大肠杆菌经发酵培养和低温诱导表达后获得发酵细胞液。离心收集上述细胞液中的细胞并采用超声波破碎法进行破碎，细胞破碎液中α-淀粉酶经过硫酸铵沉淀、透析及亲和层析等步骤得以纯化，即得到含有α-淀粉酶变体的酶液，进一步测定α-淀粉酶活力及淀粉酶解产物。
具体实施例如下：
实施例1
亲本真菌α-淀粉酶基因克隆
采用常规DNA克隆技术(萨姆布鲁克J,弗里奇E F.分子克隆实验指南(第二版).金冬雁,黎孟枫,侯云德,等译.北京:科学出版社,1998)，提取根霉属，具体为米根霉F0071总RNA，利用反转录技术克隆得到亲本α-淀粉酶编码基因的cDNA，将该cDNA序列连接入pMD18-simple载体，于16℃下反应4h后通过氯化钙转化法导入E.coli JM109感受态细胞，使用抗性LB平板筛选阳性转化子并获得重组质粒。抽提重组质粒并委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成目的基因的序列测定，测定得到亲本米根霉α-淀粉酶编码基因序列为SEQ IDNO.1。
将亲本米根霉α-淀粉酶编码基因序列(SEQ ID NO.1)导入生物信息学分析软件DNAMAN进行蛋白质翻译分析获得其所编码多肽链的氨基酸序列SEQ ID NO.2。利用生物信息分析软件SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线分析多肽链序列SEQ ID NO.2，显示该多肽的-20～0区为蛋白质信号肽区，后1～442区为成熟肽区。
实施例2
变体R333H的构建
以序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述亲本米根霉α-淀粉酶信息为基础，通过引物设计将Y的密码子替换为L密码子，使用市售的定点突变试剂盒，按照生产厂商(上海碧云天生物技术有限公司)提供的使用说明进行突变，以构建如序列SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示米根霉α-淀粉酶的变体。
亲本米根霉α-淀粉酶编码基因已在重组质粒pET-Roamy中，以重组质粒pET-Roamy为模板，使用Pfu DNA聚合酶及引物1(SEQ ID NO.3)和引物2(SEQ ID NO.4)进行PCR扩增。
引物1：5ˊ-GTAACGATCCAAACAACCACGAGGTCTTATGGACC-3ˊ
引物2：5ˊ-GGTCCATAAGACCTCGTGGTTGTTTGGATCGTTAC-3ˊ
PCR产物使用甲基化酶DpnI消化后倒入E.coli DH5α超级感受态细胞(按上海碧云天生物技术有限公司提供的试剂和方法制备)。抽提阳性转化子中的重组质粒并测序，验证已导入突变。
进一步将导入突变的重组质粒导入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达，测定α-淀粉酶变体的淀粉酶活力及淀粉水解产物。
实施例3
变体R333H+Y80L的构建
变体R333H+Y80L表示在亲本米根霉α-淀粉酶中同时含有R333H突变和Y80L突变。
以实施例2中获得的含有变体R333H的重组质粒为模板，使用引物3(SEQ ID NO.5)和引物4(SEQ ID NO.6)，参照变体R333H构建过程，在变体R333H中进一步引入Y80L突变，获得变体R333H+Y80L。
引物3：5ˊ-GGAGGTTACCATGGCTTGTGGGCTTCTGACTTTTC-3ˊ
引物4：5ˊ-GAAAAGTCAGAAGCCCACAAGCCATGGTAACCTCC-3ˊ
变体R333H+Y80L经测序正确后在E.coli BL21(DE3)得到异源表达，测定变体R333H+Y80L的淀粉酶活力及淀粉水解产物，如下表所示：
表中G1～G7分别表示葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖；ND表示在所使用的检测条件下没有检测到相应物质。
如表所示，结果表明与亲本α-淀粉酶(Roamy)相比，变体R333H和R333H+Y80L的淀粉水解产物中麦芽糖含量分别提高了3％和5％，而其它副产物如葡萄糖、麦芽三糖和麦芽四糖的浓度均有所下降，所得变体在高麦芽糖浆的工业化生产中应更具有应用优势。
上面对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (6)
1.一种具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体，其特征在于,所述α-淀粉酶变体在对应于SEQ ID NO：2所示区域R333H、R333H+Y80L位置取代，所述变体具有α-淀粉酶活性，所述真菌α-淀粉酶得自丝状真菌，所述丝状真菌为根霉属的米根霉。
2.根据权利要求1所述具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体的制备方法，其特征在于,所述制备方法包括如下步骤：
a、以编码SEQ ID NO：2所示亲本真菌α-淀粉酶成熟蛋白质的DNA序列模板，依据原氨基酸和替换氨基酸对应的遗传密码的差别设计引物，通过PCR扩增方法对所述DNA序列引入突变，达到对亲本真菌α-淀粉酶的定点突变；感受态细胞采用氯化钙法制得；
b、将得到的PCR产物经克隆、转化、抽提质粒、重组表达质粒载体导入受体菌感受态细胞和抽提所述导入受体菌感受态细胞得到的重组质粒并导入表达宿主感受态细胞，获得携带α-淀粉酶变体编码基因的重组宿主细胞；
c、将重组宿主细胞经发酵培养和低温诱导表达获得发酵细胞液；
d、离心收集发酵细胞液中的细胞，并经过超声破碎、硫酸铵沉淀、透析及亲和层析得到。
3.根据权利要求2所述具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体的制备方法，其特征在于,所述宿主细胞为革兰氏阴性细菌。
4.根据权利要求2所述具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体的制备方法，其特征在于,发酵培养指摇瓶发酵培养，所述重组大肠杆菌在LB培养基中培养，培养温度为28～37℃，在恒温摇床中培养时转速为200rpm。
5.根据权利要求2所述具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体的制备方法，其特征在于,所述变体为R333H，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求2所述具有高麦芽糖生成率的真菌α-淀粉酶变体的制备方法，其特征在于,所述变体为R333H+Y80L，所述引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
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