CN113512544B - 一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了来源于微生物Deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶作为亲本，利用基因突变技术，第37位的精氨酸替换成赖氨酸和第164位的甘氨酸替换成亮氨酸，得到双突变体R37K/G164L。在温度为60℃时，测得野生酶的半衰期为46.27min,突变体酶R37K/G164L的半衰期为185.83min，两点突变体R37K/G164L在60℃的半衰期为野生酶半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高。这一发现对于研究更多热稳定性甘露糖异构酶具有重要的研究价值。

Description

一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体，属于酶工程及基因工程技术领域。
背景技术
D-甘露糖是D-葡萄糖在C-2位的差向异构体，也是D-果糖的醛糖异构体。其甜度相当于蔗糖甜度的60％，并且甜度不会随浓度的增加而增加。此外，D-甘露糖热值为3.75kcal/g，低于其他糖类。自然界中D-甘露糖天然存在于甘露聚糖、半纤维素和纤维素中。D-甘露糖具有的这些重要的生理功能，使其可作为膳食补充剂对人体健康做出贡献。D-甘露糖已被证明是合成维生素、抗肿瘤药和免疫刺激剂的重要前体。此外，D-甘露糖也被认为是工业生产功能性甜味剂D-甘露糖醇的最佳原料。因此，D-甘露糖在食品和医疗工业中得到广泛应用，近年来引起人们的广泛关注。
目前，D-甘露糖的生产方法主要是天然提取法和化学合成法。例如，利用微波辅助结合硫酸处理法从脱蛋白的棕榈仁中提取D-甘露糖，当底物与溶剂的质量体积比为1：49.6时，在148℃条件下连续处理约10min，D-甘露糖的回收率达到92.11％。在98℃、pH 2.0条件下，55％浓度的D-葡萄糖加入钼酸铵催化剂反应约150min后，可获得32.6％的D-甘露糖。然而，天然提取法由于被提取植物细胞壁中较高的结晶度和聚合作用，使用酸水解和热水解从含甘露聚糖的材料中提取D-甘露糖又需要高温等严格的条件，大大提高了提取成本。另外，D-甘露糖的化学合成涉及复杂的反应，该反应通常在高温和强酸性环境下进行，并且需要用到一种或几种催化剂的参与，在制造过程中增加了副产物和有害污染物的产生。
生物转化法因其温和的反应条件和较少的有害副产物，越来越受到广泛的关注。目前，以D-果糖或D-葡萄糖为底物，可以使用4种类型的酶来生产D-甘露糖：包括D-来苏糖异构酶(D-lyxose isomerase,D-LIase,EC 5.3.1.15)、D-甘露糖异构酶(D-mannoseisomerase，D-MIase,EC 5.3.1.7)、纤维二糖2-差向异构酶(cellobiose 2-epimerase,Cease,EC 5.1.3.11)和D-甘露糖2-差向异构酶(D-mannose 2-epimerase，D-MEase，EC5.1.3)。其中，D-来苏糖异构酶D-LIase和D-甘露糖异构酶D-MIase可以催化D-果糖异构化为D-甘露糖。此外，尽管D-甘露糖2-差向异构酶D-MEase和纤维二糖2-差向异构酶CEase可以催化D-葡萄糖向D-甘露糖的差向异构化，但是该过程产生了较多的副产物D-果糖。
虽然用来生产D-甘露糖的酶很多，但甘露糖异构酶相对于其它生产甘露糖的酶比酶活是最高的，并且生产过程中没有出现其它的副产物。发明人课题组研究发现，来源于微生物Deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶从D-果糖转化为D-甘露糖的比酶活为322.3±0.4U/mg；该甘露糖异构酶从D-甘露糖转化为D-果糖的比酶活为764.1±3.9U/mg；在同类甘露糖异构酶中，其比酶活处于较高的位置，但该甘露糖异构酶热稳定不好；并且，现有技术当中，甘露糖异构酶的热稳定性普遍不好；例如，公开于“Pseudomonasgeniculata D-甘露糖异构酶的热稳定性改造及发酵优化”论文中的来源于Pseudomonasgeniculate的甘露糖异构酶在高于50℃的条件下，酶的活性降低的很快，很难满足工业生产的需求，因此迫切需要提供一种热稳定性高的甘露糖异构酶。
发明内容
为了解决现有技术当中甘露糖异构酶的热稳定性低的技术问题，本发明提供了一种甘露糖异构酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸和/或第164位的甘氨酸突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述甘露糖异构酶来源于微生物Deltaproteobacteria bacterium，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为R37K；其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
或所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第164位的甘氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为G164L；其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
或所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸，同时将第164位的甘氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为R37K/G164L；其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了一种编码上述甘露糖异构酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET-22b(+)为表达载体。
本发明还提供了含有上述基因，或上述重组载体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞以细菌或真菌为宿主细胞。
本发明还提供上述突变体的制备方法，其具体步骤为：
(1)利用来源于Deltaproteobacteria bacterium的Deba-WT酶的蛋白质序列同源建模确定突变位点；
(2)设计突变体的定点突变引物，以携带Deba-WT酶基因的载体pET-22b(+)-WT为模板进行定点突变构建突变质粒；
(3)将突变质粒-转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；
(4)离心菌体，重悬后超声破碎，镍离子亲和层析纯化得到突变体酶。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述甘露糖异构酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET-22b(+)为表达载体。
本发明还提供了一提高甘露糖异构酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸和/或第164位的甘氨酸突变。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第164位的甘氨酸突变为亮氨酸；
或将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸，同时将第164位的甘氨酸突变为亮氨酸。
本发明还提供了一种制备D-甘露糖的方法，所述方法为，将上述甘露糖异构酶突变体，或将上述重组大肠杆菌或其发酵上清液添加至含有D-果糖的反应体系中，进行反应。
在本发明的一种实施方式中，所述甘露糖异构酶突变体的添加量为10U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述底物D-果糖的终浓度为50mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的反应条件为：温度为55℃，pH为7.0，甘露糖异构酶浓度为10U/mL，缓冲溶液为50mM PIPES,反应时间为15min，反应体系为1mL，底物D-果糖终浓度为50mg/mL。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述质粒或细胞，或上述重组大肠杆菌在制备D-甘露糖或含有D-甘露糖的产品中的应用。
已报道的来源于Pseudomonas geniculate的甘露糖异构酶在50℃下测得其半衰期为4h，但是当温度高于50℃时，其酶活数据迅速下降，不利于工业应用；而本专利中来源于Deltaproteobacteria bacterium的甘露糖异构酶Deba-WT在60℃条件下半衰期为46.27min，其两点突变R37K/G164L在60℃条件下半衰期可达到185.83min,即突变体的半衰期提高了4倍，并且在半衰期提高4倍的基础上，两点突变体R37K/G164L的比酶活(为327.29U/mg)和Deba-WT的比酶活(331.19U/mg)相比没有发生较大的改变，可见，本发明的突变体R37K/G164L更加有利于大规模的工业生产。
有益效果
(1)本发明提供一种甘露糖异构酶Deba突变体R37K、G164L、R37K/G164L，其中突变体R37K/G164L的热稳定性提高最多，与野生酶Deba-WT相比，突变体酶R37K/G164L的最适催化条件没有发生改变，但酶在60℃保温40min后残余酶活提高了42.3％；保温80min后的残余酶活提高了107.3％；保温120min后残余酶活提高了234.4％。并且，突变体酶R37K/G164L在65℃保温20min后残余酶活与原始酶相比提高了87.9％，保温40min后的残余酶活于原始酶相比提高了274.4％。
(2)本发明的突变体的半衰期与野生型相比，得到了很大的提高：在温度为60℃时，测得野生酶Deba-WT的半衰期为46.27min，突变体酶R37K/G164L的半衰期为185.83min，突变体R37K/G164L在60℃的半衰期为野生酶Deba-WT半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高，这一发现对于甘露糖异构酶的工业化应用具有重要的价值。
附图说明
图1：在60℃保温下野生酶Deba-WT和突变体酶R37K/G164L热稳定性比较。
图2：在65℃保温下野生酶Deba-WT和突变体酶R37K/G164L热稳定性比较。
图3：在60℃保温下野生酶Deba-WT和突变体酶R37K/G164L半衰期比较。
图4：甘露糖异构酶纯酶液的琼脂糖-凝胶电泳图；其中，A：Marker；B：WT的纯酶液；C：含有R37K的纯酶液；D：含有A76V的纯酶液；E：含有N89M的纯酶液；F：含有N109F的纯酶液；G：含有S125Y的纯酶液；H：含有G164L的纯酶液；I：含有S178M的纯酶液；J：含有N230D的纯酶液；K：含有E234D的纯酶液；L：含有I239L的纯酶液。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB固体培养基：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L，琼脂糖15g/L，培养基的pH为7.0。
LB液体培养基：酵母提取物5g/L；胰蛋白胨10g/L；氯化钠10g/L，培养基的pH为7.0。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
甘露糖异构酶酶活测定方法：
反应体系为1mL，包括800μL D-果糖PIPES溶液(62.5mg/mL)，100μL酶液(0.1mg/mL)和100μL最适金属镁离子(10mM/L)，在55℃条件下反应15min，加入100μL盐酸(1.5mol/L)终止反应。
1U总酶活定义为在pH 7.0，55℃条件下反应，每分钟消耗1μg底物所需要的酶量。使用HPLC检测甘露糖的合成量，计算酶活。
比酶活：为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用U/mg蛋白质表示。
比酶活计算公式：[底物浓度(mol/L)×相对酶活(％)×0.01×反应体系(L)]/[反应时间(min)×加酶量(mg)]×1000000。
实施例1：甘露糖异构酶突变体的制备方法
具体步骤如下：
(1)重组质粒pET-22b(+)-WT构建：
根据Deltaproteobacteria bacterium(NCBI登录号：VBKQ01000206.1)，合成甘露糖异构酶的基因片段Deba-WT(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，并连接至pET-22b(+)的酶切位点NdeI和XhoI之间，获得重组质粒pET-22b(+)-WT。
(2)含有甘露糖异构酶突变体的重组质粒的构建：
以pET-22b(+)-WT质粒为模板，分别设计并合成突变体A76V、S125Y、N89M、G164L、N109F、S178M、I239L、E230D、N234D、R37K、R37K/G164L的突变引物序列，对甘露糖异构酶进行定点突变，分别测序确认甘露糖异构酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，制备得到得到单突变甘露糖异构酶合成酶。其中阳性的点为R37K和G164L，其他突变均为负突变。再将两个阳性单点突变叠加形成两点突变R37K/G164L。
其中双突变R37K/G164L是以pET-22b(+)-R37K重组载体为模板，以表1的引物为突变引物进行定点突变制备得到的。所涉及的引物序列如表1所示：
表1突变引物序列
PCR反应体系的组成如表2所示，以带有甘露糖异构酶目的基因的克隆载体pET-22b(+)-WT为模版。
表2：PCR反应体系
10×PCR Buffer 5μL
dNTP(2mmol/L) 4μL
正向突变引物(10μM) 1μL
反向突变引物(10μM) 1μL
pET-22b(+)-Deba-WT 0.5μL
Taq Plus DNA polymerase(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 将体系补足50μL
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；随后95℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸3.5min，进行26个循环；最后72℃保温5min。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化。
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR扩增产物经限制性内切酶NdeI和XhoI酶切后连接至载体pET-22b(+)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，后提取突变质粒，将突变质转化至宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正确的突变。制备得到能够表达突变体R37K、G164L、R37K/G164L、A76V、S125Y、N89M、G164L、N109F、S178M、I239L、E230D、N234D的重组菌株：
E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-R37K、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-G164L、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-R37K/G164L、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-A76V、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-S125Y、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-N89M、E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-N109F、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-S178M、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-I239L、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-E230D、E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-N234D。
对照菌株：将步骤(1)制备得到的pET-22b(+)-WT重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，制备得到E.coli BL21(DE3)/pET-22b(+)-WT。
实施例2：甘露糖异构酶突变体的表达纯化方法及酶活检测
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1中制备得到的重组菌株，挑取阳性转化子在LB液体培养基中37℃、200rpm摇瓶培养12h，分别制备得到种子液，分别将制备得到的种子液按照2％(v/v)的接种量接入LB液体培养基中，在37℃，200rpm条件下，培养3～4h至OD值为0.6～0.8，降温至28℃，加入IPTG终浓度为0.6mM，诱导6h，分别制备得到发酵液。
(2)分别将制备得到的发酵液于4℃、l0000 rpm离心20min，取菌体。分别将菌体置于离心管中，并向离心管中加入20mL缓冲液(50mM Tris，200mM NaCl，HCl调节pH至7)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2s，共计20min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，上清液即为粗酶液，用0.45μm微孔滤膜过滤备用；即分别得到：含有WT的粗酶液、含有R37K的粗酶液、含有G164L的粗酶液、含有R37K/G164L的粗酶液、含有A76V的粗酶液、含有S125Y的粗酶液、含有N89M的粗酶液、含有N109F的粗酶液、含有S178M的粗酶液、含有I239L的粗酶液、含有E230D的粗酶液、含有N234D的粗酶液。
(3)准备镍离子亲和层析柱，首先，在室温下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用缓冲液A(500mmol/L NaCl，50mM PIPES，pH 7.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的缓冲液A的pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用缓冲液B(500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，50mM PIPES，pH 7.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，50mM PIPES，pH 7.0)洗脱。
收集吸收峰的洗脱液，分别得到含有WT的纯酶液、含有R37K的纯酶液、含有G164L的纯酶液、含有R37K/G164L的纯酶液、含有A76V的纯酶液、含有S125Y的纯酶液、含有N89M的纯酶液、含有N109F的纯酶液、含有S178M的纯酶液、含有I239L的纯酶液、含有E230D的纯酶液、含有N234D的纯酶液，获得目的蛋白；对上述纯酶液进行琼脂糖-凝胶电泳分析，结果如图4所示，结果显示，甘露糖异构酶均得到了表达。
分别测定制备得到的纯酶液的比酶活，结果如表3所示：
表3不同突变体及野生酶的比酶活
由表3可知，与野生酶相比单点突变体的比酶活不同程度的下降，其中，E234D完全没有了比酶活；突变体R37K、N89M、S125Y、S178M、N234D有小幅度的下降，而两点突变R37K/G164L的比酶活与野生型相比差异不大。
在工业生产中酶活的下降不利于生产，故而在选择热稳定改变的突变体的同时也需要考虑酶本身的酶活。以上的实验数据与已经报道的文献描述相匹配，一般情况下热稳定性改造会不同程度造成比酶活的损失。
实施例3：甘露糖异构酶突变体热稳定性的检测
具体步骤如下：
(1)55℃条件下的残余酶活的检测
分别将实施列2制备得到的含有WT的纯酶液、含有R37K的纯酶液、含有G164L的纯酶液、含有R37K/G164L的纯酶液、含有A76V的纯酶液、含有S125Y的纯酶液、含有N89M的纯酶液、含有N109F的纯酶液、含有S178M的纯酶液、含有I239L的纯酶液、含有E230D的纯酶液、含有N234D的纯酶液在55℃条件下保温2h后测定残余酶活，将55℃下保温0时的初始酶活定为100％，结果如表4所示：
表4甘露糖异构酶野生型及突变体在55℃条件下的残余酶活
结果显示：将野生酶和突变体酶在55℃的条件下保温2h后，测得野生酶和突变体酶的残余酶活如上表所述，其中单点突变R37K和G164L的残余酶活是高于野生型，即阳性的突变点，而其它单点突变残余酶活均小于野生型，均为负突变。将筛选到的两个阳性单点突变体R37K和G164L进行叠加，得到两点突变R37K/G164L，在55℃条件下，R37K/G164L的比酶活可达287.27U/mg，残余酶活为91.93％；因此后续实验采用双突变，检测在60℃和65℃条件下的残余酶活。
(2)60℃和65℃条件下的残余酶活检测
将实施例2制备得到的含有WT的纯酶液、含有R37K/G164L的纯酶液在60℃和65℃下分别保温一段时间后，分别在不同的时间测定其剩余酶活，将60℃和65℃下保温0时的初始酶活定为100％；结果如表5～6及图1～3所示；并且计算出甘露糖异构酶野生型及突变体在60℃条件下的半衰期，如表7所示。
表5：甘露糖异构酶野生型及突变体在60℃条件下的残余酶活
结果显示：在60℃的条件下，与野生酶WT相比两点突变体R37K/G164L保温40min后残余酶活提高了42.3％，保温80min后残余酶活提高了107.3％，保温120min后残余酶活提高了234.4％，说明两点突变体R37K/G164L的热稳定性好于野生酶WT。
表6：甘露糖异构酶野生型及突变体在65℃条件下的残余酶活
结果显示：在65℃的条件下，与野生酶WT相比两点突变体R37K/G164L保温20min后残余酶活提高了87.9％，保温40min后残余酶活提高了274.4％，保温60min后残余酶活提高了360.7％，说明在65℃的条件下，两点突变体R37K/G164L的热稳定性高于野生酶WT。
表7：甘露糖异构酶野生型及突变体在60℃条件下的半衰期
结果显示：在温度为60℃时，测得野生酶Deba-WT的半衰期为46.27min，突变体酶R37K/G164L的半衰期为185.83min，两点突变体R37K/G164L在60℃的半衰期为野生酶Deba-WT半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高，有望为进一步的工业化生产奠定了基础。
结果显示，与野生酶Deba-WT相比，所述Deba-WT的突变体酶R37K/G164L的最适催化条件没有发生改变，而酶在60℃保温40min后残余酶活提高了42.3％；保温80min后的残余酶活分别提高了107.3％；保温120min后残余酶活提高了234.4％。
与野生酶Deba-WT相比，所述Deba-WT的突变体酶R37K/G164L在65℃保温20min后残余酶活提高了87.9％，保温40min后的残余酶活提高了274.4％。
在温度为60℃时，测得野生酶Deba-WT的半衰期为46.27min,突变体酶R37K/G164L的半衰期为185.83min，两点突变体R37K/G164L在60℃的半衰期为野生酶Deba-WT半衰期的4倍，突变体酶相对于野生酶热稳定性明显的提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体
<130> BAA210904A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
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130 135 140
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<210> 2
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gcgatggcgg cgcgccactt cggttccgac gattaccgga aggctgcccg tcacgggatt 240
gccttcctgc gcgagcgaca cagaaacccg gagacgggcg gatacgtctg gttgctccgc 300
ggcgacgagg cgatcgaggc gacgaaccac tgctacggcc tcgccttcgt gctgctcgcc 360
tacgcgcacg cgtcgatggc cggaatcgac gaggcgcggc cctggatcgg ggaagccttc 420
cagttgatgg aggaccactt ctggtccgag cgctacgggt tgtacgcaga cgaagccagc 480
gcagactggg gccggctctc gccgtaccgg ggacagaacg cgaacatgca cagctgcgag 540
gcgatgctcg ctgcctacga tgcgaccggc gagcgtcgtt acctcgagcg ggcagagacc 600
ttggcgcgga acatcaccgt gcgccaggca gacctggcgc agggtctcat ctgggagcat 660
taccattccg attggtcggt ggattgggag tacaacaaga acgaccggac caacatcttc 720
cggccgtggg gctttcagcc cggccatctc accgagtggg ccaagctgct gctgatcctg 780
gatcgccatc gcgcccggct acggacgggc ggcgattggc tcgtgccccg cgcgtgtcag 840
ctgttcgacg cggcagtggc caaggcctgg gacgccgagt acggcgggct ccactacggc 900
tttgcgccgg acggcgccat ctgcgacagc gacaagtact tctgggtgca ggcggaatca 960
ctcgccgcag ccgcgctcct cgccgcccgc accgggctgg aaaagtactg ggactggtac 1020
gatcgaatct ggagctacag ctggcaatgg ttggtcgatc accagtacgg cgcctggtat 1080
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gactaccaca ccatgggcgc ctgctacgaa gtgctcaacg tcgtttcgga atga 1194
<210> 3
<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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100 105 110
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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<210> 4
<211> 397
<212> PRT
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<400> 4
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1 5 10 15
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100 105 110
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<211> 397
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
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370 375 380
Met Gly Ala Cys Tyr Glu Val Leu Asn Val Val Ser Glu
385 390 395

Claims (8)

1.一种甘露糖异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸得到的；
或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的甘露糖异构酶的第164位的甘氨酸突变为亮氨酸得到的；
或，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸，同时将第164位的甘氨酸突变为亮氨酸得到的。
2.编码权利要求1所述甘露糖异构酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的质粒或细胞。
4.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了权利要求1所述的甘露糖异构酶突变体。
5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET-22b(+)为表达载体。
6.一种提高甘露糖异构酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸；
或，将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的甘露糖异构酶的第164位的甘氨酸突变为亮氨酸；
或，将氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示的甘露糖异构酶的第37位的精氨酸突变为赖氨酸，同时将第164位的甘氨酸突变为亮氨酸。
7.一种制备D-甘露糖的方法，其特征在于，将权利要求1所述的突变体，或将权利要求4或5所述的重组大肠杆菌添加至含有D-果糖的反应体系中，进行反应。
8.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的质粒或细胞，或权利要求4或5所述的重组大肠杆菌在制备D-甘露糖或含有D-甘露糖的产品中的应用。
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