CN110438112B - 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 - Google Patents
一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110438112B CN110438112B CN201910757830.1A CN201910757830A CN110438112B CN 110438112 B CN110438112 B CN 110438112B CN 201910757830 A CN201910757830 A CN 201910757830A CN 110438112 B CN110438112 B CN 110438112B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- psicose
- leu
- dpe
- mutant
- epimerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108030002106 D-psicose 3-epimerases Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N D-psicose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C(=O)CO BJHIKXHVCXFQLS-PUFIMZNGSA-N 0.000 claims abstract description 46
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 12
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000006345 epimerization reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 68
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 68
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- 102220516903 Estrogen-related receptor gamma_I39A_mutation Human genes 0.000 description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 39
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 29
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 23
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 8
- 101710114330 D-psicose 3-epimerase Proteins 0.000 description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 6
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 5
- DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DECCMEWNXSNSDO-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- NKJBKNVQHBZUIX-ACZMJKKPSA-N Ala-Gln-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NKJBKNVQHBZUIX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N Ala-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HHRAXZAYZFFRAM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N Ala-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 ZBLQIYPCUWZSRZ-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 4
- XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- AAWLEICNDUHIJM-MBLNEYKQSA-N Ala-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O AAWLEICNDUHIJM-MBLNEYKQSA-N 0.000 description 4
- ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N Ala-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZJLORAAXDAJLDC-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 4
- 241000269331 Ambystoma Species 0.000 description 4
- OGSQONVYSTZIJB-WDSOQIARSA-N Arg-Leu-Trp Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O OGSQONVYSTZIJB-WDSOQIARSA-N 0.000 description 4
- XRNXPIGJPQHCPC-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)C(O)=O XRNXPIGJPQHCPC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 4
- UGJLILSJKSBVIR-ZFWWWQNUSA-N Arg-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 UGJLILSJKSBVIR-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 4
- ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N Asn-Glu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ULRPXVNMIIYDDJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N Asn-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BZMWJLLUAKSIMH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- CTQIOCMSIJATNX-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CTQIOCMSIJATNX-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- OFQPMRDJVWLMNJ-CIUDSAMLSA-N Asn-His-Cys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OFQPMRDJVWLMNJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ala-Val Chemical compound N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O RGKKALNPOYURGE-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XAJRHVUUVUPFQL-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- TXCCRYAZQBUCOV-CIUDSAMLSA-N Cys-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O TXCCRYAZQBUCOV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N Cys-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O WTXCNOPZMQRTNN-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 4
- IZJLAQMWJHCHTN-BPUTZDHNSA-N Cys-Trp-Arg Chemical compound N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(=N)N)C(=O)O IZJLAQMWJHCHTN-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 4
- SHERTACNJPYHAR-ACZMJKKPSA-N Gln-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O SHERTACNJPYHAR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- CYTSBCIIEHUPDU-ACZMJKKPSA-N Gln-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CYTSBCIIEHUPDU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- RRBLZNIIMHSHQF-FXQIFTODSA-N Gln-Gln-Cys Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N RRBLZNIIMHSHQF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N Gln-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- YPMDZWPZFOZYFG-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YPMDZWPZFOZYFG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Ala Chemical compound C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O AVZHGSCDKIQZPQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N Glu-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O CUPSDFQZTVVTSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- SYAYROHMAIHWFB-KBIXCLLPSA-N Glu-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SYAYROHMAIHWFB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 4
- ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN ZQIMMEYPEXIYBB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- SIYTVHWNKGIGMD-HOTGVXAUSA-N Gly-His-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)NC(=O)CN SIYTVHWNKGIGMD-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 4
- AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N Gly-Ile-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 4
- LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN LLZXNUUIBOALNY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- IXHQLZIWBCQBLQ-STQMWFEESA-N Gly-Pro-Phe Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IXHQLZIWBCQBLQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 4
- OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OHUKZZYSJBKFRR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 4
- MREVELMMFOLESM-HOCLYGCPSA-N Gly-Trp-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MREVELMMFOLESM-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 4
- RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N Gly-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 RIYIFUFFFBIOEU-KBPBESRZSA-N 0.000 description 4
- FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N Gly-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N 0.000 description 4
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UQTKYYNHMVAOAA-HJPIBITLSA-N His-Ile-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N UQTKYYNHMVAOAA-HJPIBITLSA-N 0.000 description 4
- FLXCRBXJRJSDHX-AVGNSLFASA-N His-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FLXCRBXJRJSDHX-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N Ile-Asp-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 4
- IDMNOFVUXYYZPF-DKIMLUQUSA-N Ile-Lys-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N IDMNOFVUXYYZPF-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 4
- GRZSCTXVCDUIPO-SRVKXCTJSA-N Leu-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GRZSCTXVCDUIPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N Leu-Asn-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- LOLUPZNNADDTAA-AVGNSLFASA-N Leu-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LOLUPZNNADDTAA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- CIVKXGPFXDIQBV-WDCWCFNPSA-N Leu-Gln-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CIVKXGPFXDIQBV-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 4
- HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N Leu-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HYIFFZAQXPUEAU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O QMKFDEUJGYNFMC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N Leu-Thr-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ODRREERHVHMIPT-OEAJRASXSA-N 0.000 description 4
- GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N Leu-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GZRABTMNWJXFMH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 4
- JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N Lys-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JGAMUXDWYSXYLM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N Lys-Asp-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N FLCMXEFCTLXBTL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N Lys-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UQRZFMQQXXJTTF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- ALEVUGKHINJNIF-QEJZJMRPSA-N Lys-Phe-Ala Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ALEVUGKHINJNIF-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 4
- JPYPRVHMKRFTAT-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N JPYPRVHMKRFTAT-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- YRNRVKTYDSLKMD-KKUMJFAQSA-N Lys-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YRNRVKTYDSLKMD-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- QXEVZBXTDTVPCP-GMOBBJLQSA-N Met-Asn-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCSC)N QXEVZBXTDTVPCP-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 4
- PNDCUTDWYVKBHX-IHRRRGAJSA-N Met-Asp-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PNDCUTDWYVKBHX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N Met-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCSC FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 4
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NEHSHYOUIWBYSA-DCPHZVHLSA-N Phe-Ala-Trp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=CC=C3)N NEHSHYOUIWBYSA-DCPHZVHLSA-N 0.000 description 4
- CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N Phe-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- MPFGIYLYWUCSJG-AVGNSLFASA-N Phe-Glu-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 MPFGIYLYWUCSJG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N Phe-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 SMFGCTXUBWEPKM-KBPBESRZSA-N 0.000 description 4
- DNAXXTQSTKOHFO-QEJZJMRPSA-N Phe-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DNAXXTQSTKOHFO-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 4
- GURGCNUWVSDYTP-SRVKXCTJSA-N Pro-Leu-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GURGCNUWVSDYTP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- GDUZTEQRAOXYJS-SRVKXCTJSA-N Ser-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GDUZTEQRAOXYJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 4
- NMZXJDSKEGFDLJ-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O NMZXJDSKEGFDLJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N Thr-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 4
- XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N Thr-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N XTCNBOBTROGWMW-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 4
- HSQXHRIRJSFDOH-URLPEUOOSA-N Thr-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HSQXHRIRJSFDOH-URLPEUOOSA-N 0.000 description 4
- KAJRRNHOVMZYBL-IRIUXVKKSA-N Thr-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O KAJRRNHOVMZYBL-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 4
- OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N Thr-Val-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OGOYMQWIWHGTGH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 4
- CTDPLKMBVALCGN-JSGCOSHPSA-N Tyr-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O CTDPLKMBVALCGN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 4
- LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N Tyr-Phe-Asp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LMKKMCGTDANZTR-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 4
- NVJCMGGZHOJNBU-UFYCRDLUSA-N Tyr-Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N NVJCMGGZHOJNBU-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 4
- ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N Val-Ala-Pro Natural products CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZLFHAAGHGQBQQN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N Val-Glu-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 4
- SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N Val-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N SDUBQHUJJWQTEU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 4
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 4
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 4
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 4
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 4
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 4
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 4
- 108010038745 tryptophylglycine Proteins 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 3
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 3
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 101150056503 dpe gene Proteins 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 3
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N D-tagatose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-OEXCPVAWSA-N 0.000 description 2
- UBHUJPVCJHPSEU-GRLWGSQLSA-N Ile-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)N UBHUJPVCJHPSEU-GRLWGSQLSA-N 0.000 description 2
- 241000205573 Jeffersonia Species 0.000 description 2
- KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N Leu-Phe-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 KTOIECMYZZGVSI-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N Phe-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O LLGTYVHITPVGKR-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- UXODSMTVPWXHBT-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N UXODSMTVPWXHBT-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 108010083708 leucyl-aspartyl-valine Proteins 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100083746 Caenorhabditis elegans pmk-3 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-IANNHFEVSA-N D-sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKDRXBCSQODPBY-IANNHFEVSA-N 0.000 description 1
- 101710109941 D-tagatose 3-epimerase Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 101710141886 Ketose 3-epimerase Proteins 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 206010033307 Overweight Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000015793 Treponema primitia Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 calcium ion hydrocarbon Chemical class 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 208000012839 conversion disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000003520 lipogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 235000020845 low-calorie diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013615 non-nutritive sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/02—Monosaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体及其应用。该D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述发生突变的氨基酸的突变位点为第39位的I突变为A，可选的突变位点还包括如下任意一个：第158位的Q突变为S，第186位的L突变为V；或者所述D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列。具有上述突变位点的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构催化生产D‑阿洛酮糖的效率大幅度提高。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用。
背景技术
在立体化学中，含有多个手性碳原子的立体异构体，除了一个手性碳原子的构型不相同，其余的构型都相同的非对映体，叫做差向异构体，也称作差向立体异构体、表异构物。在天然和人工合成的糖类、医药中间体以及其它化工产品中差向异构体是很常见的。例如D-核糖、D-阿拉伯糖和D-木糖都是差向异构体。在一定条件下，由一种差向异构体转变成另外一种差向异构体的变化过程叫作差向异构化。因此，差向异构化一般是差向异构体之间的一种可逆转化，形成两种差向异构体的平衡混合物。这种平衡是动态的，平衡条件是能在溶剂、酸、碱等协助下，经过一个中间态或过渡态完成的，其结果仅仅是一个手性中心构型的翻转，并没有发生手性中心的数变和手性中心的位迁。所有的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化反应体系里最终是D-阿洛酮糖和D-果糖两种混合物达到平衡态，平衡比率为33:67，所以D-阿洛酮糖转化率最高只能达到33%。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-Psicose-3-Epimerase，简写为DPEase) 属于差向异构酶类，可以催化多种酮糖C3位羟基的差向异构，如催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖，是生产稀有糖的很好的生物催化剂。
随着城市化进程加快、环境污染日益严重、人们生活方式的改变及人口老龄化，肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病的发病率在全球范围急剧上升。糖尿病、超重/肥胖等代谢性疾病已经成为全球性危机，而过多食用糖类、造成能量过剩成为引起肥胖和糖尿病的一个重要原因。因此，新型低热量甜味剂逐渐成为食品、保健和医疗领域的研究热点之一。D-阿洛酮糖是近年发现的一种新型功能性稀少糖，其甜度相当于蔗糖的70% ,但能量只有蔗糖的0.3%，可以用作低卡路里减肥食品的甜味剂。它还示出重要的生理机能，例如活性氧种类清除活性和神经保护作用，它也可以用作肝脂肪生成酶和肠α-糖苷酶的抑制剂，用于减少体内脂肪累积。此外，D-阿洛酮糖还能够改善食品风味、外观等，延长食品的保存期限。2011年美国FDA批准D-阿洛酮糖为GRAS物质。因此，D-阿洛酮糖这种健康安全的低热量功能性甜味剂已获得越来越多学者的关注，成为最具市场竞争力的新型甜味剂之一。
蛋白定向进化技术自上世纪70年代被开发以后，在生物、制药、蛋白结构与功能研究等领域得到了极大的应用。定向进化成为改造蛋白质分子的一种有效的新策略，不仅对研究蛋白质的结构和功能的关系具有非常重要的意义，而且可快速产生工业上有巨大应用价值的新酶，极大地推动了酶工程在制药、食品、环保等领域的快速发展。
由于D-阿洛酮糖是一种较为稀有的天然单糖，从自然界中分离提取产量低，成本高，难以满足人们作为低热量健康甜味剂的需要，也不适宜工业化大生产的要求，因此为了应用于食品工业，需要有高效的D-阿洛酮糖生产方法。生物法制备D-阿洛酮糖最为有效的方法是寻找能使果糖转变为D-阿洛酮糖的酶。2006年，韩国世宗大学Oh 团队从根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens 中得到的 DTEase对D-阿洛酮糖具有较强的特异性，因此被命名为DPEase。利用大肠杆菌表达该dpe基因，以700 g/L D-果糖为底物，在50 ℃、pH 8.0、添加Mn2+的条件下反应100 min 后，D-阿洛酮糖浓度达到230 g/L，转化效率为32.9%[1]31。Mu等[2]34从解纤维梭菌Clostridium cellulolyticum H10 (ATCC 35319) 中克隆得到的木糖异构酶结构域TIM barrel 蛋白编码基因可在大肠杆菌体内表达。经镍亲合层析纯化和酶活检测证明该酶具有DPEase 活性，且其最适温度为55 ℃，最适pH 为8.0，反应转化率最高可达32%。此外，该酶在60℃高温条件下，加入Co2+后半衰期可达6.8 h。Jia 等[3]36对鲍氏梭菌ATCC BAA-613 进行全细胞反应，确定该菌株具有催化D-果糖差向异构生成D-阿洛酮糖的能力，同时将DPEase 基因转入枯草芽孢杆菌WB800 中表达，无需外源添加诱导剂即可产生DPEase。当反应进行18 h 时，酶活可达6.8 U/mL，其最适pH 为7.0，最适温度为55 ℃。Zhang 等[4]40利用Desmosporasp.来源的DPE，以500 g/L 的D-果糖为底物，可获得142.5 g/L 的D-阿洛酮糖。Treponema primitia 来源的DPEase 在最适条件 (pH 8.0，70 ℃) 下，利用同样的底物浓度 (500 g/L)，D-阿洛酮糖的产量为137.5 g/L[5]41。安信惠等[6]47公布了一种使用粘着剑菌Ensifer adhaerens 菌株SYG29 生产D-阿洛酮糖的方法。利用该细胞、细胞培养物或细胞裂解物，其最适pH 为7.0–9.0，在60 ℃条件下细胞细胞活性半衰期为7.6 h，添加Mn2+和Co2+转化活性相对较高。在70 ℃反应6 h 后，最大D-阿洛酮糖的转化率约为26%。其他菌株如伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp. MR1[7]42和普氏梭杆菌Flavonifractor plautii [8]43也被报道具有DPEase 活性。国内关于D-阿洛酮糖的研究工作起步较晚，主要进行了菌种筛选、酶基因克隆和酶的固定化研究等。由于酶的高度选择性、特异性以及反应温和和环境友好等特点，使得生物催化方法较化学合成方法制备D-阿洛酮糖具有较明显的优势。针对D-阿洛酮糖的生物合成需解决以下3个方面的关键问题：第一，目前报道的酮糖3-差向异构酶产生菌多不是GRAS，可能存在安全隐患，因此需要将相关的酶转入GRAS 宿主并实现高效表达。目前，本申请的发明人利用枯草芽孢杆菌表达系统，可实现外源DPEase 基因的高效表达。第二，生物合成过程多涉及两种糖之间差向异构化的化学平衡问题，因而可能会面临产率较低的问题。第三，现有的差向异构酶在最适反应条件下热稳定性较低。因此，利用蛋白定向进化技术对野生型DPE进行基因改造，改善酶的反应活性和热稳定性，将是生物法制备D-阿洛酮糖产业的关键。
参考文献
[1] Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, et al. Characterization of anAgrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase that converts D-fructose toD-psicose. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(2): 981–985.
[2] Mu WM, Chu FF, Xing QC, et al. Cloning, expression, andcharacterization of a D-psicose 3-epimerase from Clostridium cellulolyticumH10. J Agric Food Chem, 2011, 59(14): 7785–7792.
[3] Jia M, Mu WM, Zhang T, et al. Expression of D-Psicose 3-epimerasein Bacillus subtilis. J Food Sci Biotechnol, 2014, 33(11): 1129–1135.
[4] Zhang WL, Fang D, Zhang T, et al. Characterization of a metal-dependent D-psicose 3-epimerase from a novel strain, Desmospora sp. 8437. JAgric Food Chem, 2013, 61(47): 11468–11476.
[5] Zhang WL, Zhang T, Jiang B, et al. Biochemical characterizationof a D-psicose 3-epimerase from Treponema primitia ZAS-1 and its applicationon enzymatic production of D-psicose. J Sci Food Agric, 2016, 96(1): 49–56.
[6] 安信惠, 金慧贞, 韩恩珍, 等. 剑菌属菌株和使用其生产阿洛酮糖的方法:中国, CN105849261A. 2016-08-10.
[7] 吴会广, 余允东, 祝俊, 等. 一种来源于伯克霍尔德氏菌的DPE及其应用:中国, CN106119235A. 2016-11-16.
[8] 金泰均, 金玟秀, 金泰龙, 等. 阿洛酮糖差向异构酶和使用它生产阿洛酮糖的方法: 中国, CN106164265A.2016-11-23.
发明内容
本发明利用定点突变对一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行定向改造，提高其在催化生产D-阿洛酮糖中的热稳定性及催化效率。
为实现上述目的及其他相关目的，根据本发明的一个方面，提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体,该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述发生突变的氨基酸的突变位点为第39位的I突变为A，可选的突变位点还包括如下任意一个：第158位的Q突变为S，第186位的L突变为V；或者所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列。
进一步地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶是来自集胞藻属（Synechocystis）的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶。
更进一步地，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体，含有如下氨基酸序列：
(1) SEQ ID No：2所示的氨基酸序列：突变位点为I39A；
(2) SEQ ID No：3所示的氨基酸序列：突变位点为Q158S+L186V：
(2) SEQ ID No：4所示的氨基酸序列：突变位点为I39A+Q158S+L186V：
或者D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的氨基酸序列为与SEQ ID No：2、3或4所示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列。
根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子，DNA分子编码上述任一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。
进一步地DNA分子序列为SEQ ID No：6、7或8所示的序列；或者DNA分子的序列为与SEQ ID No：6、7或8具有95%以上同源性的序列。
本发明的又一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒含有上述任一种DNA分子。
本发明中所使用的术语"质粒"包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d (+)、pET-14b (+)、pET-15b (+)、pET-16b (+)、pET-17b (+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+) 、pET-25b (+)、pET-26b(+)、pET-27b(+) 、pET-28a(+)、pET-29a(+) ，pQE2 、pQE9 、pQE30 、pQE3 1、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-l、pGEX-6p-l、pGEX-6p-2、pBV220、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pBR322、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是 pET-22b (+)。同时，为了在枯草芽自杆菌中表达，优选地，可以使用的重组质粒选自pWB980、pHT43、pBE2、pMUTIN4、pUB110、pE194、pMA5、pMK3、pMK4、pHT304、pHY300PLK、pBest502、pDG1363、pSG1154、pAX01、pSAS144、pDL、pDG148-stu、pDG641、pUCX05-bgaB、pHT01、pUB110、pTZ4、pC194、φ1 或φ105。更优选，上述重组质粒是 pMA5。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为"含有"，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
根据本发明的另一个方面，提供了一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。
进一步地，所述宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌（E.coli）或枯草芽孢杆菌（B. subtilis）。更优选地，所述枯草芽孢杆菌宿主细胞选自BS168、WB600、WB800、WB700、WB800N、1012、FZB42或1A747。
本发明还涉及D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的生产方法，以来源于集胞藻属（Synechocystis）的具有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性的基因作为模板（氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，GeneBank登录号为：WP_010872273.1），设计核苷酸引物，通过PCR方法扩增获得该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。然后，将所获得的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体基因插入到适合的表达质粒中，从而产生含有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体基因的重组质粒，并且将所述重组质粒转化到适合的宿主细胞中。将该转化的微生物进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中己知的程序，在适合的营养培养基中发生，该培养基包含碳源和氮源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果突变体酶分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收酶。如果突变体酶不被分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
使用本领域中己知的方法可以检测D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活性，参见以下“DPE酶的活性测定”部分。
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶可以使用本领域己知的方法回收。例如，该酶可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基因收。在一方面，回收包含该酶的发酵液。
在一个替代性方面中，该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶未被回收，而是使用表达该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的本发明的宿主细胞作为该酶来源。
优选的，DPE突变体（突变位点为I39A+Q158S+L186V）和果糖间的反应可利用浓度为10-65%(w/v)，pH5-9 和温度为50-90℃的底物（即果糖溶液）进行。当果糖的浓度在10-65%(w/v)的范围内时，D-阿洛酮糖的产量好，转化率高，且上述范围的pH和温度条件是对突变体酶活性最佳的pH和温度范围。
优选的，DPE突变体（突变位点为I39A+Q158S+L186V）具有优良的热稳定性，在60℃保温12小时后活性仍没有检测到活性下降，在80℃保温12小时后，活性仍然保持在85%以上，在90℃保温8小时后仍然有55%的残余活性。该DPE突变体优良的热稳定性对较高温度条件下生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖而言是优良的性能。
有益效果
本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体与现有技术的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶相比，具有更优良的热稳定性以及更高的催化效率：在60℃保温12小时后活性仍没有检测到活性下降，在80℃保温12小时后，活性仍然保持在85%以上，在90℃保温8小时后仍然有55%的残余活性，且在60℃下测定的半衰期，相比已报道的[2]半衰期最高（9.5h）的DPE酶提高了约5倍；利用枯草芽孢杆菌表达该DPE突变体（突变位点为I39A+Q158S+L186V）基因，以700 g/L D-果糖为底物，在60℃、pH 7.5、添加Co2+的条件下反应90 min 后，D-阿洛酮糖浓度达到231 g/L，转化效率为33%。这两点对较高温度条件下催化果糖生产D-阿洛酮糖是优良的性能。
由此生产的D-阿洛酮糖能够有效地用作食品或药物的添加剂。
附图说明
图1是显示在本发明实施方案条件下pH对于DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶活性影响。
图2是显示在本发明实施方案条件下温度对于DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶活性影响。
图3是显示在本发明实施方案条件下DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的热稳定性。
图4是显示在本发明实施方案条件下野生型DPE及DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体转化果糖生产D-阿洛酮糖的转化率。
具体实施方式
下文中，将参考具体实施例对本发明进行更详细地描述。这些实施例仅仅是为了例证的目的，而非意欲限制本发明的范围。
实施例1：克隆表达
野生型DPE基因是通过商业合成来源于集胞藻属（Synechocystis）中标注为糖磷酸异构酶/差向异构酶的多肽的基因获得的。通过利用限制性内切酶Nde I和BamH I，将获得的野生型DPE酶基因插入到表达质粒pET-22b(+)中，从而产生重组质粒pET-22b-DPE。通过常规转化方法，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将转化得到的含有野生型DPE基因的重组大肠杆菌BL21(DE3) /pET-22b-DPE保藏在-80℃的超低温冰箱中。
实施例2：定点突变
以包含重组质粒pET-22b-DPE的重组大肠杆菌的野生型DPE基因序列（SEQ ID No：5所示序列）为模板，设计突变引物，将DPE第39位异亮氨酸突变为丙氨酸，将第158位谷氨酰胺突变为丝氨酸，第186位亮氨酸突变为缬氨酸，可以得到7种包含不同突变位点的DPE酶突变体的重组表达菌E.coli BL21 (DE3)/pET-22b-DPE(I39A)、E.coli BL21 (DE3)/pET-22b-DPE (Q158S)、E.coli BL21 (DE3)/pET-22b-DPE(L186V)、E.coli BL21 (DE3)/pET-22b-DPE(I39A+Q158S)、E.coli BL21 (DE3)/pET-22b-DPE(I39A+L186V)、E.coli BL21(DE3)/pET-22b-DPE(Q158S+L186V)、E.coli BL21 (DE3)/pET-22b-DPE(I39A+Q158S+L186V)。
引入I39A突变的定点突变引物为：
正向引物5’- GGGATTTGATGGGGCAGAAATTGCCACCCATTA -3’
反向引物5’- GGTGGCAATTTCTGCCCCATCAAATCCCCAC -3’
引入Q158S突变的定点突变引物为：
正向引物5’- CCTGAATCGTTTTTCAGGTTATGCTTTAAATAC -3’
反向引物5’- TAAAGCATAACCTGAAAAACGATTCAGGGGTT -3’
引入L186V突变的定点突变引物为：
正向引物5’- GGCTATTACTGGATGTATTCCACATGAATATTG -3’
反向引物5’- ATTCATGTGGAATACATCCAGTAATAGCCCCAG -3’
实施列3：DPE酶在枯草芽孢杆菌中的表达
将重组质粒pET-22b-DPE、pET-22b-DPE(I39A) 、pET-22b-DPE(Q158S) 、pET-22b-DPE(L186V)、pET-22b-DPE(I39A+Q158S)、pET-22b-DPE(I39A+L186V)、pET-22b-DPE(Q158S+L186V)、pET-22b-DPE(I39A+Q158S+L186V)和质粒pMA5分别用Nde I和BamH I双酶切，回收DPE、突变序列和质粒pMA5，回收得到的序列分别与质粒pMA5连接后，得到重组质粒pMA5-DPE和pMA5-DPE(I39A) 、pMA5-DPE(Q158S) 、pMA5-DPE(L186V)、pMA5-DPE(I39A+Q158S)、pMA5-DPE(I39A+L186V)、pMA5-DPE(Q158S+L186V)、pMA5-DPE (I39A+Q158S+L186V)。
将上述重组质粒分别转入枯草芽孢杆菌WB600，经卡那霉素抗性筛选得到可以分别表达含野生型DPE酶和含突变体DPE酶的重组菌B. subtilis/pMA5-DPE和B. subtilis/pMA5-DPE(I39A)、B. subtilis/pMA5-DPE(Q158S)、B. subtilis/pMA5-DPE(L186V)、B.subtilis/pMA5-DPE(I39A+Q158S)、B. subtilis/pMA5-DPE(I39A+L186V)、B. subtilis/pMA5-DPE(Q158S+ L186V) 、B. subtilis /pMA5-DPE (I39A+Q158S+L186V)。由于pMA5质粒中，多克隆位点上游的HpaII启动子是一种组成型强启动子，无需诱导即可启动外源基因的高效转录。将上述重组菌从平板分别接种到装有5mL液体LB培养基（LB (g/L)：蛋白胨 10，氯化钠10，酵母提取物5）的50mL的摇管中，加入相应抗性，在摇床上37 °C恒温培养12 h，转速200 rpm。再分别取1ml培养液接种至含有抗性的50ml LB中，在摇床上37°C发酵培养24h，转速设定200 rpm。培养结束后，为收获包含粗酶的上清液，低温离心（8000 rpm，10min ,4°C）去掉菌体。发酵液上清用50%的硫酸铵沉淀，然后用20mL 50mM pH7.0的磷酸纳缓冲液溶解沉淀蛋白作为胞外酶液。
实施例4：利用DPE酶生产D-阿洛酮糖
筛选可用于生产高浓度D-阿洛酮糖的DPE酶突变体，反应均在pH7.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，60°C条件下进行，其中所述磷酸钠缓冲溶液分别含有10 U/mL的野生型DPE酶及10U/mL 上述实施例3中发酵得到的DPE突变体，0.4 mM的钴离子和700g/L的果糖。然后在不同反应时间点取样，通过在冰水混合物中骤冷15分钟终止该反应，并测量样品中D-阿洛酮糖的浓度。果糖和D-阿洛酮糖的浓度是利用高效液相色谱法测量的，该高效液相色谱法使用 BP-100钙离子碳氢化合物柱和RI检测器，柱温80°C，流动相为超纯水，流速0.5 mL/min。不同反应时间的D-阿洛酮糖产量显示在下表1中。
表1
结果显示，反应60分钟，野生型DPE酶体系产生了105 g/L的D-阿洛酮糖，转化率约为15%，而DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体体系产生了231g/L的D-阿洛酮糖，在所有突变体酶中转化率最高达到了33%，相比野生型DPE转化率提高了2.2倍。由此表明，突变体DPE（I39A+Q158S+L186V）的反应催化活性要显著高于野生型DPE酶，这在工业生产中可大大降低酶的用量以及缩短反应时间，因而降低生产成本。
实施例5：DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的纯化
为了纯化筛选出的催化活性最高的DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶。采用GE公司的AKTA prime层析系统，使用1 mL的HisTrap HP镍柱亲和层析。层析柱用pH 8.0，0.5 MNaCl，20 mM咪唑，20 mM磷酸钠缓冲(缓冲液A)预平衡，洗脱缓冲液为pH 8.0，0.5 M NaCl，0.5 M咪唑，20 mM磷酸缓冲(缓冲液B)，采用0 %－100 %缓冲B梯度洗脱，总洗脱时间为30min，将收集的活性蛋白装入透析袋，4°C下透析16 h，每隔8 h更换一次透析缓冲。透析结束后进行冷冻干燥，得到冻干粉用于测定蛋白浓度和活性。
实施例6：DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的酶活测定
在目前的试验实施例中，为了测量DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶酶活性，将冻干酶粉用缓冲液溶解成后与含有10%果糖的50mM一定pH磷酸钠缓冲溶液混合，在一定温度条件下反应60分钟，再在冰水混合物中骤冷15分钟，以终止该反应。所述含有果糖的磷酸钠缓冲溶液是通过将果糖溶解的磷酸钠缓冲溶液中，以达到浓度60-70%(w/v)配制而成的，并且将该含有果糖的磷酸钠缓冲溶液持续地加入到维持在一定温度的生物反应器中。为了实现方便比较其酶活性的目的，将一单位（1U）的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活定义为每分钟生产1摩尔D-阿洛酮糖所需要的阿洛酮糖-3-差向异构酶的量。
实施例7：pH和温度和对DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶活性的影响
为了研究不同pH和温度对DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶活性的影响，按照实施例6所述的酶活测定方法，在不同的温度和pH条件下将果糖作为底物测定对其活性的影响，且比较了在不同温度和pH下的酶活性。
为了研究pH的作用，分别使用50mM柠檬酸钠pH 5~6、50mM 磷酸钠pH7~8、50mMTris-HCl pH7.5 ~ 9、50mM甘氨酸-NaOH pH9 ~ 11 的缓冲溶液，观察表现出最大活性的pH，结果如图1所示。其中所述缓冲溶液中均含有0.5U/mL的DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶和10%(w/v)的果糖，各自反应在60°C、无金属离子加入的条件下进行60分钟，然后在冰水混合物中骤冷15分钟终止反应，并测量其酶活性。
为了研究温度的作用，该反应在50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，温度范围40-90°C中进行了60分钟，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有0.5 U/mL的该DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶和10%(w/v)的果糖，在pH7.5条件下进行反应。通过在冰水混合物中骤冷15分钟来终止该反应，并测量其酶活性。其结果在图2中所说明。
结果显示该DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的最佳pH和温度分别为7.5和90°C。
实施例8：DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的热稳定性
为了研究DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的热稳定性，将该DPE突变体分别置于不同温度条件下保温，在不同时间取样将果糖作为底物测定其残余活性。测量是在将该DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶分别置于50°C、60°C、70°C、80°C和90°C水浴条件下保温后，每隔2小时取样进行的。该DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶反应在50 mM pH7.5的磷酸钠缓冲溶液中，60°C条件下进行60分钟，其中所述磷酸钠缓冲溶液含有0.5 U/mL的DPE突变体和10%(w/v)的果糖，再将该反应溶液在冰水混合物中骤冷15分钟，以终止该反应，然后测量该DPE突变体的活性。
结果（如图3）显示该DPE突变体具有优良的热稳定性，在60°C保温12小时后活性仍没有检测到活性下降，在80°C保温12小时后，活性仍然保持在85%以上，在90°C保温8小时后仍然有55%的残余活性。
DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶半衰期测定：
测定DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的半衰期，分别将纯酶溶液稀释到0.5 mg/mL，液置于60 °C水域保温，每隔一定时间取样，按上述实施例6酶活测定方法，在60°C下，使用50mM pH7.5的磷酸缓冲液溶解果糖，测定残余活力。将相对活力数值取对数后与时间拟合。按照如下公式计算酶在不同温度下的失活速率常数（k D）以及半衰期（t1/2）:
一级失活Arrihenius方程：
Ar=A0exp(-k D·t)
其中，A0为初始酶活力，U/mg of protein；Ar为残余酶活力，U/mg of protein；t为时间，h。
失活半衰期方程：
t1/2 = ln 0.5/(- k D) = 0.693/k D
实验结果如下表2所示，将已报道的不同微生物来源的DPE酶与本发明的DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶酶学性质进行比较，本发明的突变体酶最适pH为7.5接近中性，在催化反应中方便操作，最适反应温度为90°C明显高于其他来源的DPE酶，在60°C下测得酶的半衰期达48.5h，相比已报道的半衰期最高（9.5h）的DPE酶提高了约5倍。
表2 不同微生物来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的比较
实施例9：利用DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶转化果糖生产D-阿洛酮糖的转化率
该野生型DPE酶及DPE（I39A+Q158S+L186V）突变体酶的反应分别在pH7.5 50 mM的磷酸钠缓冲溶液中，温度范围50-90°C条件下进行90min，从而容许该反应充分地进行，其中所述磷酸钠缓冲溶液分别含有该野生型DPE酶及DPE突变体0.05U/mL，0.4 mM的钴离子，和10%(w/v)的果糖。然后，通过在冰水混合物中骤冷15分钟来终止该反应，并测量样品中果糖和D-阿洛酮糖的含量。
结果显示在图4中，90min后该野生型DPE酶转化果糖生产D-阿洛酮糖的转化率在80°C时转化率最高，为30%，50°C时转化率最低，为16%，在60°C时转化率为27%。而该突变体转化果糖生产D-阿洛酮糖的转化率明显高于野生型，在90°C时转化率最高达到33%，50 °C时转化率最低，为20%，而在60°C时转化率为31%。
序列表
<110> 苏州科宁多元醇有限公司
<120> 一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
<141> 2019-08-16
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Ile Ser Ser Pro Lys Ile Lys Phe Gly Val His Thr Phe Ile Trp
1 5 10 15
Lys Lys Glu Phe Leu Gly Asn Glu Glu Tyr Val Phe Gln Asp Ala Lys
20 25 30
Arg Trp Gly Phe Asp Gly Ile Glu Ile Ala Thr His Tyr Phe Asp Gln
35 40 45
Ile Asp Pro Leu Gln Leu Lys Ser Tyr Gly Glu Lys Tyr Gly Val Glu
50 55 60
Leu Thr Phe Cys Thr Ser Leu Pro Arg Gly Leu Ser Leu Thr Thr Lys
65 70 75 80
Asp Glu Asp Cys Trp Arg Glu Ser Ile Ala Tyr Leu Glu Arg Ala Ile
85 90 95
Lys Phe Cys Gln Gln Cys Gly Ile Ile Gln Leu Ser Gly Pro Phe Pro
100 105 110
His Pro Val Gly Tyr Leu Ser Gly Glu Pro Leu Gln Lys Arg Glu Asn
115 120 125
Val Arg Met Gln Glu Ala Phe Lys Leu Val Ala Glu Thr Leu Ile Lys
130 135 140
Thr Asp Leu Lys Phe Ala Val Glu Pro Leu Asn Arg Phe Gln Gly Tyr
145 150 155 160
Ala Leu Asn Thr Val Ala Gln Gly Leu Glu Leu Leu Asp Ala Val Asp
165 170 175
Cys Pro Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asp Leu Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Lys Asp Val Ile Lys Ala Phe Leu Gln Ala Ser Asn His Cys Phe
195 200 205
His Ile His Ala Cys Ala Lys Asp Arg Gly Thr Pro Gly Ser Asp Ser
210 215 220
Phe Ala Trp Gly His Trp Phe Lys Ala Leu Gln Thr Met Asp Tyr Gln
225 230 235 240
Gly Trp Val Thr Ile Glu Ser Phe Asn Phe Glu Asp Lys Glu Leu Ala
245 250 255
Asn Gly Ala Arg Leu Trp Arg Thr Val Ala Pro Ser Asn Glu Ala Leu
260 265 270
Ala Gln Asp Gly Leu Lys Phe Leu Arg Gln Thr Tyr Gln Thr Asn
275 280 285
<210> 2
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Ile Ser Ser Pro Lys Ile Lys Phe Gly Val His Thr Phe Ile Trp
1 5 10 15
Lys Lys Glu Phe Leu Gly Asn Glu Glu Tyr Val Phe Gln Asp Ala Lys
20 25 30
Arg Trp Gly Phe Asp Gly Ala Glu Ile Ala Thr His Tyr Phe Asp Gln
35 40 45
Ile Asp Pro Leu Gln Leu Lys Ser Tyr Gly Glu Lys Tyr Gly Val Glu
50 55 60
Leu Thr Phe Cys Thr Ser Leu Pro Arg Gly Leu Ser Leu Thr Thr Lys
65 70 75 80
Asp Glu Asp Cys Trp Arg Glu Ser Ile Ala Tyr Leu Glu Arg Ala Ile
85 90 95
Lys Phe Cys Gln Gln Cys Gly Ile Ile Gln Leu Ser Gly Pro Phe Pro
100 105 110
His Pro Val Gly Tyr Leu Ser Gly Glu Pro Leu Gln Lys Arg Glu Asn
115 120 125
Val Arg Met Gln Glu Ala Phe Lys Leu Val Ala Glu Thr Leu Ile Lys
130 135 140
Thr Asp Leu Lys Phe Ala Val Glu Pro Leu Asn Arg Phe Gln Gly Tyr
145 150 155 160
Ala Leu Asn Thr Val Ala Gln Gly Leu Glu Leu Leu Asp Ala Val Asp
165 170 175
Cys Pro Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asp Leu Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Lys Asp Val Ile Lys Ala Phe Leu Gln Ala Ser Asn His Cys Phe
195 200 205
His Ile His Ala Cys Ala Lys Asp Arg Gly Thr Pro Gly Ser Asp Ser
210 215 220
Phe Ala Trp Gly His Trp Phe Lys Ala Leu Gln Thr Met Asp Tyr Gln
225 230 235 240
Gly Trp Val Thr Ile Glu Ser Phe Asn Phe Glu Asp Lys Glu Leu Ala
245 250 255
Asn Gly Ala Arg Leu Trp Arg Thr Val Ala Pro Ser Asn Glu Ala Leu
260 265 270
Ala Gln Asp Gly Leu Lys Phe Leu Arg Gln Thr Tyr Gln Thr Asn
275 280 285
<210> 3
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ile Ser Ser Pro Lys Ile Lys Phe Gly Val His Thr Phe Ile Trp
1 5 10 15
Lys Lys Glu Phe Leu Gly Asn Glu Glu Tyr Val Phe Gln Asp Ala Lys
20 25 30
Arg Trp Gly Phe Asp Gly Ile Glu Ile Ala Thr His Tyr Phe Asp Gln
35 40 45
Ile Asp Pro Leu Gln Leu Lys Ser Tyr Gly Glu Lys Tyr Gly Val Glu
50 55 60
Leu Thr Phe Cys Thr Ser Leu Pro Arg Gly Leu Ser Leu Thr Thr Lys
65 70 75 80
Asp Glu Asp Cys Trp Arg Glu Ser Ile Ala Tyr Leu Glu Arg Ala Ile
85 90 95
Lys Phe Cys Gln Gln Cys Gly Ile Ile Gln Leu Ser Gly Pro Phe Pro
100 105 110
His Pro Val Gly Tyr Leu Ser Gly Glu Pro Leu Gln Lys Arg Glu Asn
115 120 125
Val Arg Met Gln Glu Ala Phe Lys Leu Val Ala Glu Thr Leu Ile Lys
130 135 140
Thr Asp Leu Lys Phe Ala Val Glu Pro Leu Asn Arg Phe Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ala Leu Asn Thr Val Ala Gln Gly Leu Glu Leu Leu Asp Ala Val Asp
165 170 175
Cys Pro Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asp Val Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Lys Asp Val Ile Lys Ala Phe Leu Gln Ala Ser Asn His Cys Phe
195 200 205
His Ile His Ala Cys Ala Lys Asp Arg Gly Thr Pro Gly Ser Asp Ser
210 215 220
Phe Ala Trp Gly His Trp Phe Lys Ala Leu Gln Thr Met Asp Tyr Gln
225 230 235 240
Gly Trp Val Thr Ile Glu Ser Phe Asn Phe Glu Asp Lys Glu Leu Ala
245 250 255
Asn Gly Ala Arg Leu Trp Arg Thr Val Ala Pro Ser Asn Glu Ala Leu
260 265 270
Ala Gln Asp Gly Leu Lys Phe Leu Arg Gln Thr Tyr Gln Thr Asn
275 280 285
<210> 4
<211> 287
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ile Ser Ser Pro Lys Ile Lys Phe Gly Val His Thr Phe Ile Trp
1 5 10 15
Lys Lys Glu Phe Leu Gly Asn Glu Glu Tyr Val Phe Gln Asp Ala Lys
20 25 30
Arg Trp Gly Phe Asp Gly Ala Glu Ile Ala Thr His Tyr Phe Asp Gln
35 40 45
Ile Asp Pro Leu Gln Leu Lys Ser Tyr Gly Glu Lys Tyr Gly Val Glu
50 55 60
Leu Thr Phe Cys Thr Ser Leu Pro Arg Gly Leu Ser Leu Thr Thr Lys
65 70 75 80
Asp Glu Asp Cys Trp Arg Glu Ser Ile Ala Tyr Leu Glu Arg Ala Ile
85 90 95
Lys Phe Cys Gln Gln Cys Gly Ile Ile Gln Leu Ser Gly Pro Phe Pro
100 105 110
His Pro Val Gly Tyr Leu Ser Gly Glu Pro Leu Gln Lys Arg Glu Asn
115 120 125
Val Arg Met Gln Glu Ala Phe Lys Leu Val Ala Glu Thr Leu Ile Lys
130 135 140
Thr Asp Leu Lys Phe Ala Val Glu Pro Leu Asn Arg Phe Ser Gly Tyr
145 150 155 160
Ala Leu Asn Thr Val Ala Gln Gly Leu Glu Leu Leu Asp Ala Val Asp
165 170 175
Cys Pro Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asp Val Phe His Met Asn Ile Glu
180 185 190
Glu Lys Asp Val Ile Lys Ala Phe Leu Gln Ala Ser Asn His Cys Phe
195 200 205
His Ile His Ala Cys Ala Lys Asp Arg Gly Thr Pro Gly Ser Asp Ser
210 215 220
Phe Ala Trp Gly His Trp Phe Lys Ala Leu Gln Thr Met Asp Tyr Gln
225 230 235 240
Gly Trp Val Thr Ile Glu Ser Phe Asn Phe Glu Asp Lys Glu Leu Ala
245 250 255
Asn Gly Ala Arg Leu Trp Arg Thr Val Ala Pro Ser Asn Glu Ala Leu
260 265 270
Ala Gln Asp Gly Leu Lys Phe Leu Arg Gln Thr Tyr Gln Thr Asn
275 280 285
<210> 5
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgatttctt cccccaaaat caagtttgga gttcatactt ttatctggaa aaaagaattt 60
cttggtaatg aagaatatgt tttccaagat gctaaaaggt ggggatttga tgggatagaa 120
attgccaccc attatttcga ccaaattgat cccctccaac ttaaaagtta tggcgaaaag 180
tatggtgtag agctaacctt ttgcaccagt ttaccccggg gtttatcctt gactaccaag 240
gatgaagact gctggcggga atccattgct tatctggaaa gggcaattaa attctgtcaa 300
caatgcggca tcattcaact ctctgggccg ttcccccatc ctgtgggtta tctcagtgga 360
gaacctctgc aaaaacggga aaatgttcgc atgcaggagg cctttaagct ggtagcggaa 420
actctgatca aaactgatct gaagtttgct gtggaacccc tgaatcgttt tcaaggttat 480
gctttaaata ctgtagctca aggcttagaa ttgctcgatg cagtggattg tcctcaactg 540
gggctattac tggatttatt ccacatgaat attgaagaaa aggatgtaat caaagctttt 600
ttacaagcga gcaatcattg ttttcatatc catgcctgtg ccaaagaccg gggcactccc 660
ggcagtgatt cctttgcttg gggccattgg tttaaagcct tacaaaccat ggattaccaa 720
ggttgggtca ccattgaaag ttttaatttt gaggataagg aattggctaa tggagcccgc 780
ttgtggcgca cggtggctcc cagtaatgaa gcccttgccc aagatggact gaaatttttg 840
cgacaaactt atcaaactaa c 861
<210> 6
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgatttctt cccccaaaat caagtttgga gttcatactt ttatctggaa aaaagaattt 60
cttggtaatg aagaatatgt tttccaagat gctaaaaggt ggggatttga tggggcagaa 120
attgccaccc attatttcga ccaaattgat cccctccaac ttaaaagtta tggcgaaaag 180
tatggtgtag agctaacctt ttgcaccagt ttaccccggg gtttatcctt gactaccaag 240
gatgaagact gctggcggga atccattgct tatctggaaa gggcaattaa attctgtcaa 300
caatgcggca tcattcaact ctctgggccg ttcccccatc ctgtgggtta tctcagtgga 360
gaacctctgc aaaaacggga aaatgttcgc atgcaggagg cctttaagct ggtagcggaa 420
actctgatca aaactgatct gaagtttgct gtggaacccc tgaatcgttt tcaaggttat 480
gctttaaata ctgtagctca aggcttagaa ttgctcgatg cagtggattg tcctcaactg 540
gggctattac tggatttatt ccacatgaat attgaagaaa aggatgtaat caaagctttt 600
ttacaagcga gcaatcattg ttttcatatc catgcctgtg ccaaagaccg gggcactccc 660
ggcagtgatt cctttgcttg gggccattgg tttaaagcct tacaaaccat ggattaccaa 720
ggttgggtca ccattgaaag ttttaatttt gaggataagg aattggctaa tggagcccgc 780
ttgtggcgca cggtggctcc cagtaatgaa gcccttgccc aagatggact gaaatttttg 840
cgacaaactt atcaaactaa c 861
<210> 7
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgatttctt cccccaaaat caagtttgga gttcatactt ttatctggaa aaaagaattt 60
cttggtaatg aagaatatgt tttccaagat gctaaaaggt ggggatttga tgggatagaa 120
attgccaccc attatttcga ccaaattgat cccctccaac ttaaaagtta tggcgaaaag 180
tatggtgtag agctaacctt ttgcaccagt ttaccccggg gtttatcctt gactaccaag 240
gatgaagact gctggcggga atccattgct tatctggaaa gggcaattaa attctgtcaa 300
caatgcggca tcattcaact ctctgggccg ttcccccatc ctgtgggtta tctcagtgga 360
gaacctctgc aaaaacggga aaatgttcgc atgcaggagg cctttaagct ggtagcggaa 420
actctgatca aaactgatct gaagtttgct gtggaacccc tgaatcgttt ttcaggttat 480
gctttaaata ctgtagctca aggcttagaa ttgctcgatg cagtggattg tcctcaactg 540
gggctattac tggatgtatt ccacatgaat attgaagaaa aggatgtaat caaagctttt 600
ttacaagcga gcaatcattg ttttcatatc catgcctgtg ccaaagaccg gggcactccc 660
ggcagtgatt cctttgcttg gggccattgg tttaaagcct tacaaaccat ggattaccaa 720
ggttgggtca ccattgaaag ttttaatttt gaggataagg aattggctaa tggagcccgc 780
ttgtggcgca cggtggctcc cagtaatgaa gcccttgccc aagatggact gaaatttttg 840
cgacaaactt atcaaactaa c 861
<210> 8
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgatttctt cccccaaaat caagtttgga gttcatactt ttatctggaa aaaagaattt 60
cttggtaatg aagaatatgt tttccaagat gctaaaaggt ggggatttga tggggcagaa 120
attgccaccc attatttcga ccaaattgat cccctccaac ttaaaagtta tggcgaaaag 180
tatggtgtag agctaacctt ttgcaccagt ttaccccggg gtttatcctt gactaccaag 240
gatgaagact gctggcggga atccattgct tatctggaaa gggcaattaa attctgtcaa 300
caatgcggca tcattcaact ctctgggccg ttcccccatc ctgtgggtta tctcagtgga 360
gaacctctgc aaaaacggga aaatgttcgc atgcaggagg cctttaagct ggtagcggaa 420
actctgatca aaactgatct gaagtttgct gtggaacccc tgaatcgttt ttcaggttat 480
gctttaaata ctgtagctca aggcttagaa ttgctcgatg cagtggattg tcctcaactg 540
gggctattac tggatgtatt ccacatgaat attgaagaaa aggatgtaat caaagctttt 600
ttacaagcga gcaatcattg ttttcatatc catgcctgtg ccaaagaccg gggcactccc 660
ggcagtgatt cctttgcttg gggccattgg tttaaagcct tacaaaccat ggattaccaa 720
ggttgggtca ccattgaaag ttttaatttt gaggataagg aattggctaa tggagcccgc 780
ttgtggcgca cggtggctcc cagtaatgaa gcccttgccc aagatggact gaaatttttg 840
cgacaaactt atcaaactaa c 861
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggatttgat ggggcagaaa ttgccaccca tta 33
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggtggcaatt tctgccccat caaatcccca c 31
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cctgaatcgt ttttcaggtt atgctttaaa tac 33
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taaagcataa cctgaaaaac gattcagggg tt 32
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggctattact ggatgtattc cacatgaata ttg 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
attcatgtgg aatacatcca gtaatagccc cag 33
Claims (9)
1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，其特征在于：所述突变体是在序列如SEQID NO：1所示的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶氨基酸序列基础上发生的突变，所述突变为选自以下突变位点中的至少一个:第39位氨基酸从I突变为A，第158位的氨基酸Q突变为S，第186位的氨基酸L突变为V。
2.根据权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，其特征在于：所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No：2、SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示的氨基酸序列。
3.一种DNA分子，其特征在于：所述DNA分子编码权利要求1或2中任一项所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。
4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的序列为SEQ ID No：6、SEQ ID No：7或SEQ ID No：8所示的序列。
5.一种重组质粒，其特征在于：所述重组质粒含有权利要3或4所述的DNA分子。
6.一种重组宿主细胞，其特征在于：含有权利要求5所述的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞包括大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。
8.一种利用含有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DNA分子的重组宿主细胞培养生产D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)、培养权利要求7所述的重组宿主细胞；和
(b)、回收所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。
9.权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体在生产D-阿洛酮糖中的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910757830.1A CN110438112B (zh) | 2019-08-16 | 2019-08-16 | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910757830.1A CN110438112B (zh) | 2019-08-16 | 2019-08-16 | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110438112A CN110438112A (zh) | 2019-11-12 |
| CN110438112B true CN110438112B (zh) | 2021-09-10 |
Family
ID=68435946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910757830.1A Active CN110438112B (zh) | 2019-08-16 | 2019-08-16 | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110438112B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111793616B (zh) * | 2020-08-07 | 2022-04-12 | 天津科技大学 | 一种差向异构酶的突变体及其应用 |
| WO2023015283A1 (en) * | 2021-08-06 | 2023-02-09 | Celgene Corporation | Compositions and methods for selective degradation of engineered proteins |
| WO2023171643A1 (ja) * | 2022-03-07 | 2023-09-14 | 国立大学法人香川大学 | 乾燥に耐えうる酵素である固定化酵素の乾燥体、その製造方法および保存方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148311A (zh) * | 2016-09-12 | 2016-11-23 | 上海立足生物科技有限公司 | 一种d‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体及其应用 |
| CN108018278A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-05-11 | 江南大学 | 一种催化效率提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体 |
-
2019
- 2019-08-16 CN CN201910757830.1A patent/CN110438112B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148311A (zh) * | 2016-09-12 | 2016-11-23 | 上海立足生物科技有限公司 | 一种d‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶的突变体及其应用 |
| CN108018278A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-05-11 | 江南大学 | 一种催化效率提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Crystal structure of D-psicose 3-epimerase from Agrobacterium tumefaciens and its complex with true substrate D-fructose: a pivotal role of metal in catalysis, an active site for the non-phosphorylated substrate, and its conformational changes;Kwangsoo Kim等;《J Mol Biol》;20060901;第361卷(第5期);全文 * |
| Kwangsoo Kim等.Crystal structure of D-psicose 3-epimerase from Agrobacterium tumefaciens and its complex with true substrate D-fructose: a pivotal role of metal in catalysis, an active site for the non-phosphorylated substrate, and its conformational changes.《J Mol Biol》.2006,第361卷(第5期), * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110438112A (zh) | 2019-11-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110438112B (zh) | 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 | |
| CN111500566B (zh) | 一种海藻糖合成酶突变体及其制备方法和应用 | |
| KR102011718B1 (ko) | 해조류로부터 포도당 및 라미나리올리고당을 생산하는 신규한 베타―글루코시데이즈 | |
| CN110066777B (zh) | 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用 | |
| CN112877307B (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
| JP2022544085A (ja) | プシコース３－エピメラーゼミュータント、それを発現するための遺伝子工学菌、その固定化酵素及び固定化方法 | |
| CN114836405A (zh) | 一种热稳定性提高的琼胶酶突变体及其应用 | |
| CA2619488A1 (en) | Production of l-ribose and other rare sugars | |
| CN113564136A (zh) | L-泛解酸内酯脱氢酶及其突变体、共表达工程菌及应用 | |
| US20030175909A1 (en) | Novel thermostable galactose isomerase and tagatose production thereby | |
| CN114591939B (zh) | 一种高耐热d-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用 | |
| CN114231511B (zh) | 热稳定性提高的双果糖酐水解酶突变体e160f | |
| CN113215125B (zh) | 一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体 | |
| CN106119235B (zh) | 一种来源于伯克霍尔德氏菌的dpe及其应用 | |
| CN113512544B (zh) | 一种热稳定性提高的甘露糖异构酶突变体 | |
| CN112921025B (zh) | 一种差向异构酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 | |
| CN113151240B (zh) | 一种葡萄糖异构酶、突变体及其编码基因与应用 | |
| CN110358745B (zh) | 4-木糖醇脱氢酶突变体及其用途 | |
| CN114836406A (zh) | 一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用 | |
| CN105154457B (zh) | 一种来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶基因及其应用 | |
| CN113122563A (zh) | 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法 | |
| CN116286712B (zh) | 鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用 | |
| CN111057698B (zh) | L-阿拉伯糖异构酶、突变体及其应用 | |
| CN110452899B (zh) | 一种葡萄糖异构酶、突变体及其在制备d-果糖中的应用 | |
| WO2009119538A1 (ja) | エピメラーゼ活性を有する新規ポリペプチド、その製造方法ならびにその利用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 215000, No. 30 Nanguandu Road, Economic Development Zone, Wuzhong District, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee after: Suzhou Koning polyol Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 215000 no.1183 Wuzhong Avenue, Wuzhong Economic Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province Patentee before: Suzhou Koning polyol Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| CP03 | Change of name, title or address |