CN113215125B

CN113215125B - 一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体

Info

Publication number: CN113215125B
Application number: CN202110615300.0A
Authority: CN
Inventors: 沐万孟; 张文立; 倪大伟; 徐炜; 张书琦
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN113215125A

Abstract

本发明公开了一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明将来源于微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶的截断酶作为亲本，构建了四点突变体酶A310E/S346A/I478M/A491S(简称M4)，并进一步截断N‑端33个氨基酸的突变体M4^N‑33。M4^N‑33在55℃的半衰期由原来的不足5min提高到大约10h，熔融温度由原来的55.00℃提高到61.27℃，最适反应温度由原来的55℃提高到60℃，在最适催化条件下的酶活提高了52％。这一发现对于工业化制备微生物菊糖及转糖苷酶的工业化应用有重要的研究价值。

Description

一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体

技术领域

本发明涉及一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

菊糖蔗糖酶(Inulosucrase，EC 2.4.1.10)是一种蔗糖利用酶。当以蔗糖为唯一底物时，该酶可以催化蔗糖的水解反应和转果糖基反应，生成高分子量微生物菊糖。低分子量的植物菊糖食品、医药等领域有着广泛应用。而高分子量微生物菊糖在溶解性、成胶性和贮藏稳定性方面表现出比植物菊糖更优的性质。此外，作为一种转果糖基酶，菊糖蔗糖酶还可以以蔗糖为供体，一些其他糖类为受体，生产新型低聚糖。

Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶的酶活性在同类酶中处于较高水平，而热稳定性不是很突出，55℃保温5min，剩余酶活不足原始酶活的一半，这使该酶的实际工业应用受到了很大的限制。目前，虽然已有2种Inulosucrase的晶体结构得到解析，催化机理和糖链延伸机制也得到了初步解析，然而关于其热稳定性改造的研究依然很少。因此，开发具有良好热稳定性的Inulosucrase对于微生物菊糖的生产具有重要的意义。

发明内容

技术问题：

目前，已经报道的菊糖蔗糖酶为17个，且大多数的热稳定性较差，或者酶活力较低。因此可以对菊糖蔗糖酶进行提高热稳定性和酶活力分子改造。

本发明提供一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶的突变体酶，这一发现对于工业化制备微生物菊糖及转糖苷酶的工业化应用有重要的现实意义。

技术方案：

为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶(Laga-ISΔ138-702)进行分子改造。

本发明的第一个目的是提供一种菊糖蔗糖酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述菊糖蔗糖酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第310位的丙氨酸替换为谷氨酸，将346位丝氨酸替换为丙氨酸，将478位的异亮氨酸替换为蛋氨酸，将491位的丙氨酸替换为丝氨酸，并截断N-端的33个氨基酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述菊糖蔗糖酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pET系列载体。

在一种实施方式中，所述载体包括pET-22b(+)。

本发明的第四个目的是提供表达菊糖蔗糖酶突变体的细胞。

在一种实施方式中，所述细胞包括细菌、真菌或古细菌。

本发明的第五个目的是提供表达所述菊糖蔗糖酶突变体的基因工程菌。

在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)为载体。

本发明的第六个目的是提供一种制备微生物菊糖的方法，所述方法是以所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，以蔗糖为底物制备微生物菊糖。

本发明的第七个目的是提供所述菊糖蔗糖酶突变体或基因工程菌在制备菊糖或含有菊糖的产品中的应用。

本发明还提供所述的突变体或所述的基因工程菌生产的菊糖在医药生产、食品领域的应用。

有益效果：

突变体M4^N-33在55℃的半衰期由原来的不足5min提高到10h左右，熔融温度由原来的55.00℃提高到61.27℃，最适反应温度由原来的55℃提高到60℃，在最适催化条件下的酶活提高了52％，有利于工业生产的应用。

附图说明

图1组合突变对突变体熔融温度的影响。

图2四点突变对(A)65℃和(B)70℃下的半衰期、(C)熔融温度和(D)最适温度的影响。

具体实施方式

实施例1：菊糖蔗糖酶三维结构的分析及突变体质粒的构建

(1)突变点的确定。

来源于微生物Lactobacillus gasseri DSM 20604的菊糖蔗糖酶(Laga-ISΔ138-702)在NCBI数据库的编号为ACZ67286.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。对Laga-ISΔ138-702进行同源建模，结合多序列比对、折叠自由能、分子动力学模拟，理性设计单点突变，并筛选出4个熔融温度提高至少1℃的单点突变(如图1所示)，并将其组合叠加为4点突变M4，进一步截断N-端的33个氨基酸，构建突变体M4^N-33。以进一步增强其热稳定性提高其酶活力。

(2)质粒的构建。

1)构建原始质粒pET-22b(+)-Laga-ISΔ138-702，合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的菊糖蔗糖酶(Laga-ISΔ138-702)，并插入到载体pET-22b(+)的多克隆位点，测序验证，得到原始质粒pET-22b(+)-Laga-ISΔ138-702。

2)构建突变质粒pET-22b(+)-M4^N-33

设计定点突变的突变引物(表2)，以携带Laga-ISΔ138-702基因的原始质粒pET-22b(+)-Laga-ISΔ138-702为模板进行四轮单点突变，将步骤(1)中菊糖蔗糖酶(Laga-ISΔ138-702)的第310位的丙氨酸替换为谷氨酸，将346位丝氨酸替换为丙氨酸，将478位的异亮氨酸替换为蛋氨酸，将491位的丙氨酸替换为丝氨酸，并截断N-端的33个氨基酸，构建得到突变质粒pET-22b(+)-M4^N-33。每轮突变经PCR及模板消化反应两个步骤，测序验证结果正确后进行下一轮突变。突变体酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

表1 PCR反应体系

PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min 40s，32个循环，4℃保存。

表2引物序列表

表3模板消化反应体系

反应条件：37℃，反应90min。

实施例2：工程菌株的构建及突变体酶的表达、纯化

(1)工程菌株的构建。

将实施例1中得到的突变质粒pET-22b(+)-M4^N-33和原始质粒pET-22b(+)-Laga-ISΔ138-702分别转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，于37℃培养12h，分别得到长有重组工程菌E.coli BL21/pET-22b(+)-M4^N-33和E.coli BL21/pET-22b(+)-Laga-ISΔ138-702的平板。

(2)突变体酶的表达。

挑取步骤(1)中平板上的单菌落到4mL含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃培养12h后得到种子液，将种子液转接入200mL含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃培养2～3h，至OD₆₀₀值为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导蛋白表达，于28℃培养6～8h，获得发酵液。将发酵液于4℃、8000rpm离心15min，收集菌体。

(3)突变体酶的纯化。

向步骤(2)中获得的菌体中加入20mL破碎缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，200mmol/LNaCl，pH 7.0)，充分重悬菌体，然后进行超声破碎，破碎后于4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，即粗酶液。使用镍离子亲和层析柱对粗酶液进行纯化。首先，使用平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，pH 7.0)平衡柱子；然后，将得到的粗酶液加入到柱子中；接着，用含有低浓度咪唑的缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/LNaCl，50mmol/L咪唑，pH 7.0)冲洗杂蛋白；最后，用含有高浓度咪唑的缓冲液(50mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH 7.0)洗脱，得到突变体酶M4^N-33和亲本酶Laga-ISΔ138-702。

实施例3：突变体酶M4^N-33的性质测定

菊糖蔗糖酶利用蔗糖合成微生物菊糖涉及两步反应：第一步，蔗糖裂解为葡萄糖和酶-果糖基中间物。第二步，如果水作为酶-果糖基中间物的果糖基受体，则发生水解反应，生成游离果糖；如果另一分子蔗糖或反应生成的各种聚合度的菊糖去攻击酶-果糖基中间物，则发生聚合反应，生成菊糖。由于第一步的反应会脱落一分子的葡萄糖，因此文献中一般常用葡萄糖的生成量计算菊糖蔗糖酶的酶活。

菊糖蔗糖酶的酶活测定方法：1mL的反应体系，包括终浓度300g/L的蔗糖、终浓度50mmol/L的pH 5.5的醋酸盐缓冲液和10μg/mL的纯酶，在55℃条件下反应20min。向反应体系中加入终浓度为100mmol/L的NaOH冰浴20min终止反应，加入终浓度为100mmol/L的HCl中和体系。1U菊糖蔗糖酶的酶活定义为：以300g/L的蔗糖为底物时，在pH 5.5，55℃下反应，每分钟生成1μmol葡萄糖所需要的酶量。

半衰期测定方法：在55℃下对酶保温一段时间后，取出适量的酶，测定酶的残余酶活，以不进行保温得的酶活定义为100％。

熔融温度测定方法：使用微量差示扫描量热仪进行测定。

最适温度测定方法：在pH 5.5，不同温度下反应20min，向反应体系中加入终浓度为100mmol/L的NaOH冰浴20min终止反应，加入终浓度为100mmol/L的HCl中和体系。

结果表明：M4^N-33熔融温度由原来的55.00℃提高到61.27℃(图1)，在55℃的半衰期由原来的不到5min提高到约为10h(图2A)，在最适pH不变的情况下(图2B)，最适反应温度由原来的55℃提高到60℃(图2C)，在最适催化条件下的酶活相比亲本酶Laga-ISΔ138-702提高了52％(图2D)。

实施例4：突变体酶M4^N-33的应用

以600g/L的蔗糖为底物，向1mL的反应体系里(pH 5.5)加入5U/mL的实施例2获得的突变体酶M4^N-33，于35℃反应10h。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种热稳定性和酶活提高的菊糖蔗糖酶突变体

<130> BAA210782A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcggtaa aacaagatga aaaagcagct actgcagtta aagcaaatac tgaagtaaaa 60

gctaacgaaa cttctacaaa atcagcttca aaagataaca aagctgaatt aaagggccaa 120

attaaagata ttgttaaaga atctggtgtg gataccagta aattaactga tgatcaaatt 180

aatgaattaa ataagattag cttttctaaa gaagcaaaga gcggtactca attaacttac 240

agcgatttta agaaaattgc taaaacttta attgaacaag atgctcgtta tgctgttcct 300

ttctttaatg caagtaaaat taagaacatg ccagcagcaa aaactcttga tgctcaaaca 360

ggaaaagtag aagacttaga aatttgggat tcatggccag ttcaagatgc caaaactggt 420

tatgtttcta actggaatgg ttatcaatta gtaattggaa tgatgggagt tccaaatact 480

aatgacaatc acatttatct tctttacaac aagtacggtg acaataactt taataattgg 540

aagaatgctg gtcctatttt tggcttaggt actccagtta ttcaacaatg gtctggttca 600

gcaactttaa ataaagatgg ttcaatccaa ctttactaca ctaaggttga tacaagtgat 660

aacaacacta accatcaaaa gattgcaagc gcaactgttt acttaaatct tgaaaagaat 720

caagataaga tttctattgc acacgtagat aatgatcaca tcgtttttga aggtgatgga 780

tatcattacc aaacttacaa tcaatggaag aagaccaaca agggtgcaga taatattgca 840

atgcgtgatg cacacgtaat tgacgataag gatggtaatc gttatcttgt ttttgaggca 900

agtactggaa cagaaaatta tcaaggtgct gaccaaattt atcaatggtt aaattatggt 960

ggtactaaca aagataattt gggtgatttc ctacaaatct tgtctaactc tgatattaaa 1020

gatagagcaa agtggtctaa cgctgcaatc ggtattatta agttaaacaa tgatactaag 1080

aatcctggtg ttgagaaggt ttacacacca cttattagtg ctccaatggt aagtgatgaa 1140

attgaacgtc ctgatgtagt tcgtttaggc aataaatatt acttatttgc cgctactaga 1200

ttaaaccgtg gaagcaacga tgatgcatgg atggctgcta ataaagcagt tggtgataac 1260

gttgctatga ttggttacgt ttctgataac ttaactcatg gatatgttcc attaaacgaa 1320

tctggagtgg ttttaactgc ttctgttcca gcaaactggc gtactgcaac ttactcatac 1380

tatgcagtac cagtagaagg aagagatgat cagttattga ttacttccta tatcactaac 1440

cgtggtgaag ttgctggaaa gggtatgcac gcaacttggg caccaagttt cttgttacaa 1500

attaatccag ataatactac tactgtttta gctaagatga ctaaccaagg tgactggatt 1560

tgggatgatt ctagcgaaaa cgctgatatg atgggtgtac ttgaaaagga tgctccaaat 1620

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aacttaaagc cacatcaaca ccaccaccac caccac 1716

<210> 2

<211> 572

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Val Lys Gln Asp Glu Lys Ala Ala Thr Ala Val Lys Ala Asn

1 5 10 15

Thr Glu Val Lys Ala Asn Glu Thr Ser Thr Lys Ser Ala Ser Lys Asp

20 25 30

Asn Lys Ala Glu Leu Lys Gly Gln Ile Lys Asp Ile Val Lys Glu Ser

35 40 45

Gly Val Asp Thr Ser Lys Leu Thr Asp Asp Gln Ile Asn Glu Leu Asn

50 55 60

Lys Ile Ser Phe Ser Lys Glu Ala Lys Ser Gly Thr Gln Leu Thr Tyr

65 70 75 80

Ser Asp Phe Lys Lys Ile Ala Lys Thr Leu Ile Glu Gln Asp Ala Arg

85 90 95

Tyr Ala Val Pro Phe Phe Asn Ala Ser Lys Ile Lys Asn Met Pro Ala

100 105 110

Ala Lys Thr Leu Asp Ala Gln Thr Gly Lys Val Glu Asp Leu Glu Ile

115 120 125

Trp Asp Ser Trp Pro Val Gln Asp Ala Lys Thr Gly Tyr Val Ser Asn

130 135 140

Trp Asn Gly Tyr Gln Leu Val Ile Gly Met Met Gly Val Pro Asn Thr

145 150 155 160

Asn Asp Asn His Ile Tyr Leu Leu Tyr Asn Lys Tyr Gly Asp Asn Asn

165 170 175

Phe Asn Asn Trp Lys Asn Ala Gly Pro Ile Phe Gly Leu Gly Thr Pro

180 185 190

Val Ile Gln Gln Trp Ser Gly Ser Ala Thr Leu Asn Lys Asp Gly Ser

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Ile Gln Leu Tyr Tyr Thr Lys Val Asp Thr Ser Asp Asn Asn Thr Asn

210 215 220

His Gln Lys Ile Ala Ser Ala Thr Val Tyr Leu Asn Leu Glu Lys Asn

225 230 235 240

Gln Asp Lys Ile Ser Ile Ala His Val Asp Asn Asp His Ile Val Phe

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Asp Lys Asp Gly Asn Arg Tyr Leu Val Phe Glu Ala Ser Thr Gly Thr

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340 345 350

Ile Lys Leu Asn Asn Asp Thr Lys Asn Pro Gly Val Glu Lys Val Tyr

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Asp Val Val Arg Leu Gly Asn Lys Tyr Tyr Leu Phe Ala Ala Thr Arg

385 390 395 400

Leu Asn Arg Gly Ser Asn Asp Asp Ala Trp Met Ala Ala Asn Lys Ala

405 410 415

Val Gly Asp Asn Val Ala Met Ile Gly Tyr Val Ser Asp Asn Leu Thr

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His Gly Tyr Val Pro Leu Asn Glu Ser Gly Val Val Leu Thr Ala Ser

435 440 445

Val Pro Ala Asn Trp Arg Thr Ala Thr Tyr Ser Tyr Tyr Ala Val Pro

450 455 460

Val Glu Gly Arg Asp Asp Gln Leu Leu Ile Thr Ser Tyr Ile Thr Asn

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Arg Gly Glu Val Ala Gly Lys Gly Met His Ala Thr Trp Ala Pro Ser

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Phe Leu Leu Gln Ile Asn Pro Asp Asn Thr Thr Thr Val Leu Ala Lys

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Met Thr Asn Gln Gly Asp Trp Ile Trp Asp Asp Ser Ser Glu Asn Ala

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Asp Met Met Gly Val Leu Glu Lys Asp Ala Pro Asn Ser Ala Ala Leu

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Pro Gly Glu Trp Gly Lys Pro Val Asp Trp Asp Leu Ile Gly Gly Tyr

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565 570

<210> 3

<211> 1617

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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agcggtactc aattaactta cagcgatttt aagaaaattg ctaaaacttt aattgaacaa 180

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actaaggttg atacaagtga taacaacact aaccatcaaa agattgcaag cgcaactgtt 600

tacttaaatc ttgaaaagaa tcaagataag atttctattg cacacgtaga taatgatcac 660

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tatcaatggt taaattatgg tggtactaac aaagataatt tgggtgattt cctacaaatc 900

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<213> 人工序列

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530 535

Claims

1.一种菊糖蔗糖酶突变体M4^N-33，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.编码权利要求1所述菊糖蔗糖酶突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体包括但不限于pET系列载体。

5.表达权利要求1所述菊糖蔗糖酶突变体的细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，包括细菌、真菌或古细菌。

7.一种基因工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述菊糖蔗糖酶突变体。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)为表达载体。

9.一种制备微生物菊糖的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述菊糖蔗糖酶突变体或权利要求7或8所述的基因工程菌为催化剂，以蔗糖为底物制备微生物菊糖。

10.权利要求1所述菊糖蔗糖酶突变体或权利要求7或8所述的基因工程菌在制备菊糖或含有菊糖的产品中的应用。