CN112680426B - 一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶突变体，属于酶工程领域。本发明将来源于微生物Calidithermus timidus DSM 17022的淀粉蔗糖酶(简称CT‑ASase)作为亲本，构建了四点突变体酶L382P/S414N/P618I/H631K(简称M45)。M45在65℃的半衰期由原来的23.58h提高到43.72h，在70℃的半衰期由原来的71min提高到110min，熔融温度由原来的74.29℃提高到76.44℃，最适反应温度由原来的55℃提高到60℃。这一发现对于工业化制备纯直链淀粉及转糖苷酶的工业化应用有重要的研究价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶突变体，属于酶工程领域。
背景技术
淀粉蔗糖酶(ASase，EC 2.4.1.4)是一种蔗糖利用酶，在食品、医疗、轻工业等有广泛的应用。当以蔗糖为唯一底物时，该酶可以催化聚合反应，生成仅以α-1,4键连接的直链淀粉。直链淀粉可用作低脂食品中的脂肪替代品，并可用于生产可降解薄膜、生物活性物质的缓释材料、淀粉基免疫微粒等。此外，该酶还可与其他酶(如环糊精糖基转移酶、麦芽低聚糖合成酶、糖原分支酶等)偶联生产环糊精、麦芽低聚糖、超支化葡聚糖等，这些物质均为功能性碳水化合物。当体系中同时存在糖基供体底物蔗糖和另外的糖基受体底物时，淀粉蔗糖酶具有转糖基能力，且可识别50种以上物质作为糖基受体。它可以将葡萄糖基由供体蔗糖，转移到受体底物上，可用于熊果苷、儿茶素苷、黄酮衍生物和抗性膳食纤维等的合成。
对于淀粉蔗糖酶来说，因其大部分应用都与淀粉体系或淀粉利用酶关联，而淀粉体系溶解度较差，需要较高温度反应，同时淀粉利用酶的最适温度又普遍较高，因此淀粉蔗糖酶的热稳定性就尤为重要。然而，作为一种用途广泛的多功能酶，已被报道发现的大多数淀粉蔗糖酶都表现出较差的热稳定性(如表1所示)，大部分酶的熔融温度都低于50℃，表明其在50℃下都极易失活，大部分酶的最适温度也低于50℃，这表明其很难与最适温度普遍较高的淀粉利用酶进行联用。并且，目前关于改造淀粉蔗糖酶热稳定性的研究较少，仅有针对来自N.polysaccharea的淀粉蔗糖酶进行改造工作，且成效甚微(如表2所示)，这使该类酶的实际工业应用受到了很大的限制。因此，开发具有良好热稳定性的淀粉蔗糖酶具有重要的意义。
表1不同菌种来源的淀粉蔗糖酶的热稳定性比较
表中“-”为数据未报道。
表2目前已报道的淀粉蔗糖酶的热稳定性分子改造
发明内容
目前，已经报道的淀粉蔗糖酶在20个以内，且大多数表现出较差的热稳定性，而淀粉体系溶解度较差，需要较高温度反应，因此开发具有良好热稳定性的淀粉蔗糖酶具有重要的意义。本发明提供一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶的突变体酶，这一发现对于工业化制备直链淀粉及转糖苷酶的工业化应用有重要的现实意义。
为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Calidithermus timidus DSM 17022的淀粉蔗糖酶(CT-ASase)进行分子改造。
本发明的第一个目的是提供一种淀粉蔗糖酶突变体，所述突变体含有SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶突变体是在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的基础上，将第382位的亮氨酸替换为脯氨酸，将414位丝氨酸替换为天冬酰胺，将618位的脯氨酸替换为异亮氨酸，将631位的组氨酸替换为赖氨酸。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
本发明的第三个目的是提供表达所述淀粉蔗糖酶突变体或含有SEQ ID NO:3所述基因的载体。
本发明的第四个目的是提供含有所述淀粉蔗糖酶突变体或载体的微生物细胞。
在一种实施方式中，所述微生物细胞是以大肠杆菌为宿主的基因工程菌。
在一种实施方式中，所述微生物细胞是以pET-22b(+)为表达载体。
在一个实施方式中，所述宿主大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供一种制备直链淀粉的方法，所述方法是以所述淀粉蔗糖酶突变体或所述细胞为催化剂，以蔗糖为底物制备直链淀粉。
在一种实施方式中，所述方法是以磷酸钠缓冲液作为缓冲体系。
本发明第六个目的是提供所述的突变体或所述的基因工程菌或所述细胞在医药生产、食品领域的应用。
有益效果：
淀粉蔗糖酶突变体M45在65℃的半衰期较野生酶的23.58h提高到43.72h，在70℃的半衰期较野生酶的71min提高到110min，熔融温度较野生酶的74.29℃提高到76.44℃，最适温度较野生酶的55℃提高到60℃。
附图说明
图1组合突变对CT-ASase熔融温度的影响；
图2四点突变对(A)65℃和(B)70℃下的半衰期、(C)熔融温度和(D)最适温度的影响。
具体实施方式
实施例1：淀粉蔗糖酶三维结构的分析及突变体质粒的构建
(1)突变点的确定
来源于微生物Calidithermus timidus DSM 17022的淀粉蔗糖酶(CT-ASase)在NCBI数据库的编号为WP_018466847.1。对CT-ASase进行三维建模，结合共识序列、折叠自由能、多聚体结合界面，理性设计单点突变，并筛选出4个熔融温度提高的单点突变(如图1所示)，并将其组合叠加为4点突变M45(L382P/S414N/P618I/H631K)，以进一步增强其热稳定性。
(2)突变体的构建
设计定点突变的突变引物，以携带CT-ASase基因的载体pET-22b(+)-CT-ASase(Tian Y,Xu W,Guang C,et al.Thermostable Amylosucrase from Calidithermustimidus DSM 17022:Insight into Its Characteristics and TetramericConformation[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2019,67(35).)为模板进行四轮单点突变，构建突变质粒pET-22b(+)-M45。每轮突变经PCR及模板消化反应两个步骤，测序验证结果正确后进行下一轮突变。突变体酶的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
PCR反应体系如下：
表3突变PCR反应体系
PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸3min 45s，32个循环，4℃保存。
引物如下，下划线为突变碱基：
表4 PCR引物表
模板消化反应体系如下：
表5模板消化反应体系
反应条件：37℃，反应90min。
实施例2：工程菌株的构建及突变体酶的表达、纯化
(1)工程菌株的构建
将实施例1中得到的突变体M45的质粒pET-22b(+)-M45转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，于37℃培养12h后，得到重组工程菌E.coli BL21/pET-22b(+)-M45。
(2)突变体酶的表达
挑取单菌落到4mL含有50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基，于37℃培养12h，后转接入200mL含有50μg/mL氨节青霉素的LB液体培养基，于37℃培养2～3h，至OD600值为0.6～0.8，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，于28℃培养6～8h，诱导蛋白的表达。将发酵液于4℃、8000rpm离心15min，收集菌体。
(3)突变体酶的纯化
加入20mL破碎缓冲液(50mmol/L PBS，200mmol/L NaCl，pH 7.0)，充分重悬菌体，然后进行超声破碎，破碎后于4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，即粗酶液。使用镍离子亲和层析柱对粗酶液进行纯化。首先，使用平衡缓冲液(50mmol/L PBS，500mmol/L NaCl，pH7.0)平衡柱子；然后，将得到的粗酶液加入到柱子中；接着，用含有低浓度咪唑的缓冲液(50mmol/L PBS，500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，pH 7.0)冲洗杂蛋白；最后，用含有高浓度咪唑的缓冲液(50mmol/L PBS，500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，pH 7.0)洗脱，得到目的蛋白。
实施例3：突变体酶的性质测定
淀粉蔗糖酶利用蔗糖合成直链淀粉涉及两步反应：第一步，蔗糖裂解为果糖和酶-葡萄糖基中间物。第二步，如果游离的葡萄糖或葡聚糖去攻击酶-葡萄糖基中间物，则发生聚合反应，生成直链淀粉，如果水去攻击酶-葡萄糖基中间物，则发生水解反应，生成游离葡萄糖。由于第一步的反应会脱落一分子的果糖，因此文献中一般常用果糖的生成量计算淀粉蔗糖酶的酶活。
淀粉蔗糖酶的酶活测定方法：0.5mL的反应体系，包括终浓度100mmol/L的蔗糖、终浓度50mmol/L的pH 7.0的磷酸缓冲液和10μg/mL纯酶，在55℃条件下反应30min，95℃水浴30min终止反应。1U淀粉蔗糖酶的酶活定义为：在pH 7.0，55℃下反应，每分钟生成1μmol果糖所需要的酶量。
(1)半衰期测定：pH在65℃和70℃下分别对野生酶与突变体M45保温一段时间后，取出适量的酶，测定酶的残余酶活，以65℃和70℃下保温0h的酶活为100％，计算半衰期。用ln2/kd的t1/2公式计算半衰期＝t1/2。通过计算动力学稳定性线性拟合函数斜率的负值，得到了kd(衰减常数)。图2(A)所示，突变体酶M45在65℃的半衰期较野生酶的23.58h提高到43.72h，图2(B)所示在70℃的半衰期较野生酶的71min提高到110min。
(2)最适温度测定：在pH 7.0，将野生酶与突变体M45分别在不同温度下反应30min，95℃水浴30min终止反应。测定酶活，以本实施过程中检测到的最高酶活力为100％，确定酶的最适温度。图2(C)所示最适温度较野生酶的55℃提高到60℃。
(3)熔融温度测定：使用微量差示扫描量热仪进行测定。图2(D)所示熔融温度由原来的74.29℃提高到76.44℃。
实施例4：利用突变体酶M45制备直链淀粉的方法
取实施例2中制备得到的淀粉蔗糖酶突变体的酶液，按照0.4U/L的加酶量，加入0.1～1mol/L蔗糖溶液中，蔗糖用pH 7.0的0.05mol/L磷酸盐缓冲液配置，于35～65℃下反应24～48h。通过高效离子色谱法测定反应体系中可溶性直链淀粉的链长，通过凝胶排阻色谱法测定反应体系中不溶性直链淀粉的分子量。
对比例1：
取实施例1中构建成功的其他突变体与最终筛选得到的M45进行比较，实施方式同实施例3所述。结果如下表所示，与野生酶相比，单点突变的熔融温度一般提高1℃左右，而四点突变体M45的熔融温度能提高2℃以上；从65℃下的半衰期来看，单点突变的半衰期最多提高5h，而四点突变体M45的半衰期提高了约20h。由此可见，与野生酶或其他突变体酶相比，该四点突变体M45的热稳定性明显更具有优势，这有利于运输与保存，也将大大拓宽该酶在高温下的应用潜力，如合成直链淀粉、或与一系列的淀粉利用酶进行一锅法合成功能性碳水化合物等。
表6不同突变体最适温度与半衰期的测定结果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶突变体
<130> BAA201602A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1998
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgttctcca ccccgctccc tgccgaactg cgccctttgc tcgaacgcct gctgaccctg 60
gcccaagatg agctctcagg cggcgacctc gaaaccttca gtctgcgcct ggagcgctac 120
ctacccgacc tccacgccgg cctgacagcg gtataccccg acgcggaggg gctgctcgaa 180
cggctgctgc ccatcctcac cgccgcccac caggcccgca gcgccgatct caggcgcctc 240
gacgccaagc gcctgctggc ccccgactgg ttccagcgcc cagagatgat cgcctacgtg 300
gcctacaccg agcgcttcgc cgggacgctg aggggcgttg aggagcggat cgactacctc 360
gaagagctcg gcgtgcgcta cctccacctc atgcccttcc tcaagccgcg ccccgccccc 420
cacgacggcg gctacgcggt gatggactac cgcgcggtgc gcgaagacct gggcaccatg 480
gccgacctcg aagccctcac cgccaagctg cgcgcgcggg gcatcgcgct gtgctgcgac 540
ctggtcttga accacgtggc ccaggagcac gagtgggcgc tgcgggcccg caggggcgag 600
gcgaagtatc agcgctactt ccacatgttc cccgaccgca ccctccccga cgagtacgag 660
aagaccctgc ccgaggtctt ccccgacttc gctccgggca acttcacctt cgacgaggag 720
agcggccagt gggtctggac caccttcaac cgctggcaat gggacctcaa ctgggccaat 780
cccgaggtct tcctcgaatt cgccgacctc atcctctggc tcgccaaccg cggcgtggag 840
gtcttccgcc tcgacgccat cgccttcatc tggaagcgcc tgggcaccaa ctgccagaac 900
cagcccgagg tgcacgccat cacccaggcc ctgcgtgccg tggcccgcat cgtggccccg 960
gcggtgctgt tcaaggccga ggccatcgtg gcccccgacg acctgatcca ctacctgggt 1020
cagggtcctc acttcggcct gctcagcgat accgcctacc acaacagcct gatggtgcag 1080
atctggtcga gtctggcctc gcgcgacgtg cggctgatga gcgaggccct gcgccgcttc 1140
cccctcaagc ccaccaacac cgcctggtgc acctacttgc gctgccacga cgacatcggc 1200
tgggccatcg ccgacgagga cgcggcgcgg gtggggctct ccggcgaggc tcaccgccgc 1260
ttcctctccg actactactc cgggcgcttc cccgcctcct tcagccgggg gctggtcttc 1320
caggaaaacc cccgcaccgg cgaccggcgc atctcgggct cggcagccag cctggcgggc 1380
ctcgaacagg ccctggagcg gggagacccc catcagcttc acctcagcct cgaacgcctg 1440
ctgttgggcc acgccgtggt gctgggcttc ggtgggattc ccctgttgta catgggcgat 1500
gagctggccc tgctcaacga ccattcctac ctcgaagagc ccgagcacgc cgaggataac 1560
cgctgggtcc accgcccgca catggactgg gaaaaggctg cccgcgccaa agccgacccc 1620
acctcgccgg aaggccgcat gtaccacggc ctgcgacacc tcatccgcgt gcgccgcacc 1680
accccccact tccacgccgc cctcgaagcg cagatcctcg aaccgcgcaa cccccacgtc 1740
ttcggctacg tgcgccgcca cccgctgggc aacctggtgg cgctgtacaa cttcagcgaa 1800
gaggtccagt actaccccgc cgaggtgctc tggcagcagg ggctcggcct gcctttcgac 1860
cgcatcagcg gccagctcgt gcccatcgag caccacctgg tgcggctgga accctatgcc 1920
cggctgtgga tcacggatga gagtgatcga caccaccacc accaccacta actcgagcac 1980
caccaccacc accactga 1998
<210> 2
<211> 656
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Phe Ser Thr Pro Leu Pro Ala Glu Leu Arg Pro Leu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Leu Leu Thr Leu Ala Gln Asp Glu Leu Ser Gly Gly Asp Leu Glu Thr
20 25 30
Phe Ser Leu Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Pro Asp Leu His Ala Gly Leu
35 40 45
Thr Ala Val Tyr Pro Asp Ala Glu Gly Leu Leu Glu Arg Leu Leu Pro
50 55 60
Ile Leu Thr Ala Ala His Gln Ala Arg Ser Ala Asp Leu Arg Arg Leu
65 70 75 80
Asp Ala Lys Arg Leu Leu Ala Pro Asp Trp Phe Gln Arg Pro Glu Met
85 90 95
Ile Ala Tyr Val Ala Tyr Thr Glu Arg Phe Ala Gly Thr Leu Arg Gly
100 105 110
Val Glu Glu Arg Ile Asp Tyr Leu Glu Glu Leu Gly Val Arg Tyr Leu
115 120 125
His Leu Met Pro Phe Leu Lys Pro Arg Pro Ala Pro His Asp Gly Gly
130 135 140
Tyr Ala Val Met Asp Tyr Arg Ala Val Arg Glu Asp Leu Gly Thr Met
145 150 155 160
Ala Asp Leu Glu Ala Leu Thr Ala Lys Leu Arg Ala Arg Gly Ile Ala
165 170 175
Leu Cys Cys Asp Leu Val Leu Asn His Val Ala Gln Glu His Glu Trp
180 185 190
Ala Leu Arg Ala Arg Arg Gly Glu Ala Lys Tyr Gln Arg Tyr Phe His
195 200 205
Met Phe Pro Asp Arg Thr Leu Pro Asp Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Pro
210 215 220
Glu Val Phe Pro Asp Phe Ala Pro Gly Asn Phe Thr Phe Asp Glu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gln Trp Val Trp Thr Thr Phe Asn Arg Trp Gln Trp Asp Leu
245 250 255
Asn Trp Ala Asn Pro Glu Val Phe Leu Glu Phe Ala Asp Leu Ile Leu
260 265 270
Trp Leu Ala Asn Arg Gly Val Glu Val Phe Arg Leu Asp Ala Ile Ala
275 280 285
Phe Ile Trp Lys Arg Leu Gly Thr Asn Cys Gln Asn Gln Pro Glu Val
290 295 300
His Ala Ile Thr Gln Ala Leu Arg Ala Val Ala Arg Ile Val Ala Pro
305 310 315 320
Ala Val Leu Phe Lys Ala Glu Ala Ile Val Ala Pro Asp Asp Leu Ile
325 330 335
His Tyr Leu Gly Gln Gly Pro His Phe Gly Leu Leu Ser Asp Thr Ala
340 345 350
Tyr His Asn Ser Leu Met Val Gln Ile Trp Ser Ser Leu Ala Ser Arg
355 360 365
Asp Val Arg Leu Met Ser Glu Ala Leu Arg Arg Phe Pro Leu Lys Pro
370 375 380
Thr Asn Thr Ala Trp Cys Thr Tyr Leu Arg Cys His Asp Asp Ile Gly
385 390 395 400
Trp Ala Ile Ala Asp Glu Asp Ala Ala Arg Val Gly Leu Ser Gly Glu
405 410 415
Ala His Arg Arg Phe Leu Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Arg Phe Pro Ala
420 425 430
Ser Phe Ser Arg Gly Leu Val Phe Gln Glu Asn Pro Arg Thr Gly Asp
435 440 445
Arg Arg Ile Ser Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ala Gly Leu Glu Gln Ala
450 455 460
Leu Glu Arg Gly Asp Pro His Gln Leu His Leu Ser Leu Glu Arg Leu
465 470 475 480
Leu Leu Gly His Ala Val Val Leu Gly Phe Gly Gly Ile Pro Leu Leu
485 490 495
Tyr Met Gly Asp Glu Leu Ala Leu Leu Asn Asp His Ser Tyr Leu Glu
500 505 510
Glu Pro Glu His Ala Glu Asp Asn Arg Trp Val His Arg Pro His Met
515 520 525
Asp Trp Glu Lys Ala Ala Arg Ala Lys Ala Asp Pro Thr Ser Pro Glu
530 535 540
Gly Arg Met Tyr His Gly Leu Arg His Leu Ile Arg Val Arg Arg Thr
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Thr Pro His Phe His Ala Ala Leu Glu Ala Gln Ile Leu Glu Pro Arg
565 570 575
Asn Pro His Val Phe Gly Tyr Val Arg Arg His Pro Leu Gly Asn Leu
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Val Ala Leu Tyr Asn Phe Ser Glu Glu Val Gln Tyr Tyr Pro Ala Glu
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Val Leu Trp Gln Gln Gly Leu Gly Leu Pro Phe Asp Arg Ile Ser Gly
610 615 620
Gln Leu Val Pro Ile Glu His His Leu Val Arg Leu Glu Pro Tyr Ala
625 630 635 640
Arg Leu Trp Ile Thr Asp Glu Ser Asp Arg His His His His His His
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<211> 1998
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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Tyr Ala Val Met Asp Tyr Arg Ala Val Arg Glu Asp Leu Gly Thr Met
145 150 155 160
Ala Asp Leu Glu Ala Leu Thr Ala Lys Leu Arg Ala Arg Gly Ile Ala
165 170 175
Leu Cys Cys Asp Leu Val Leu Asn His Val Ala Gln Glu His Glu Trp
180 185 190
Ala Leu Arg Ala Arg Arg Gly Glu Ala Lys Tyr Gln Arg Tyr Phe His
195 200 205
Met Phe Pro Asp Arg Thr Leu Pro Asp Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Pro
210 215 220
Glu Val Phe Pro Asp Phe Ala Pro Gly Asn Phe Thr Phe Asp Glu Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gln Trp Val Trp Thr Thr Phe Asn Arg Trp Gln Trp Asp Leu
245 250 255
Asn Trp Ala Asn Pro Glu Val Phe Leu Glu Phe Ala Asp Leu Ile Leu
260 265 270
Trp Leu Ala Asn Arg Gly Val Glu Val Phe Arg Leu Asp Ala Ile Ala
275 280 285
Phe Ile Trp Lys Arg Leu Gly Thr Asn Cys Gln Asn Gln Pro Glu Val
290 295 300
His Ala Ile Thr Gln Ala Leu Arg Ala Val Ala Arg Ile Val Ala Pro
305 310 315 320
Ala Val Leu Phe Lys Ala Glu Ala Ile Val Ala Pro Asp Asp Leu Ile
325 330 335
His Tyr Leu Gly Gln Gly Pro His Phe Gly Leu Leu Ser Asp Thr Ala
340 345 350
Tyr His Asn Ser Leu Met Val Gln Ile Trp Ser Ser Leu Ala Ser Arg
355 360 365
Asp Val Arg Leu Met Ser Glu Ala Leu Arg Arg Phe Pro Pro Lys Pro
370 375 380
Thr Asn Thr Ala Trp Cys Thr Tyr Leu Arg Cys His Asp Asp Ile Gly
385 390 395 400
Trp Ala Ile Ala Asp Glu Asp Ala Ala Arg Val Gly Leu Asn Gly Glu
405 410 415
Ala His Arg Arg Phe Leu Ser Asp Tyr Tyr Ser Gly Arg Phe Pro Ala
420 425 430
Ser Phe Ser Arg Gly Leu Val Phe Gln Glu Asn Pro Arg Thr Gly Asp
435 440 445
Arg Arg Ile Ser Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ala Gly Leu Glu Gln Ala
450 455 460
Leu Glu Arg Gly Asp Pro His Gln Leu His Leu Ser Leu Glu Arg Leu
465 470 475 480
Leu Leu Gly His Ala Val Val Leu Gly Phe Gly Gly Ile Pro Leu Leu
485 490 495
Tyr Met Gly Asp Glu Leu Ala Leu Leu Asn Asp His Ser Tyr Leu Glu
500 505 510
Glu Pro Glu His Ala Glu Asp Asn Arg Trp Val His Arg Pro His Met
515 520 525
Asp Trp Glu Lys Ala Ala Arg Ala Lys Ala Asp Pro Thr Ser Pro Glu
530 535 540
Gly Arg Met Tyr His Gly Leu Arg His Leu Ile Arg Val Arg Arg Thr
545 550 555 560
Thr Pro His Phe His Ala Ala Leu Glu Ala Gln Ile Leu Glu Pro Arg
565 570 575
Asn Pro His Val Phe Gly Tyr Val Arg Arg His Pro Leu Gly Asn Leu
580 585 590
Val Ala Leu Tyr Asn Phe Ser Glu Glu Val Gln Tyr Tyr Pro Ala Glu
595 600 605
Val Leu Trp Gln Gln Gly Leu Gly Leu Ile Phe Asp Arg Ile Ser Gly
610 615 620
Gln Leu Val Pro Ile Glu Lys His Leu Val Arg Leu Glu Pro Tyr Ala
625 630 635 640
Arg Leu Trp Ile Thr Asp Glu Ser Asp Arg His His His His His His
645 650 655
Claims (10)
1.一种淀粉蔗糖酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.编码权利要求1所述淀粉蔗糖酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述基因，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID No.3。
4.一种载体，其特征在于，表达权利要求1所述的淀粉蔗糖酶突变体或含有权利要求3所述基因。
5.一种微生物细胞，其特征在于，含有权利要求1所述淀粉蔗糖酶突变体或权利要求4所述载体。
6.如权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，是以大肠杆菌为宿主的基因工程菌。
7.如权利要求6所述的微生物细胞，其特征在于，所述基因工程菌以pET-22b(+)质粒为表达载体。
8.一种制备直链淀粉的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1所述淀粉蔗糖酶突变体或权利要求5所述微生物细胞为催化剂，以蔗糖为底物制备直链淀粉。
9.根据权利要求8所述的制备直链淀粉的方法，其特征在于，以磷酸钠缓冲液作为缓冲体系。
10.权利要求1所述的淀粉蔗糖酶突变体或权利要求5所述的微生物细胞在医药生产、食品领域的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202011580654.8A CN112680426B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶突变体 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN202011580654.8A CN112680426B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种热稳定性提高的淀粉蔗糖酶突变体 |
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Citations (2)
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| CN109402081A (zh) * | 2018-11-27 | 2019-03-01 | 江南大学 | 一种淀粉蔗糖酶突变体及其制备方法与应用 |
-
2020
- 2020-12-28 CN CN202011580654.8A patent/CN112680426B/zh active Active
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Non-Patent Citations (4)
| Title |
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| Thermostable Amylosucrase from Calidithermus timidus DSM 17022: Insight into Its Characteristics and Tetrameric Conformation;Tian Y等;《J Agric Food Chem》;20190904;第67卷(第35期);第9868-9876页 * |
| 定点饱和突变提高β-(2,6)果聚蔗糖酶热稳定性的研究;徐炜等;《第十二届中国酶工程学术研讨会论文摘要集》;20191231;第121页 * |
| 登录号WP_018466847.1;无;《NCBI_GenPept》;20200803;序列信息 * |
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