CN113373135B - 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用 - Google Patents

一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提及了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的突变体及其应用。将来源于Clostridium cellulolyticum的野生型DPEase通过定向进化获得一系列发酵酶活提高的突变体，本发明得到DPEase突变体H56Q的发酵酶活是野生型的1.61倍；并且突变体H56Q在55℃的半衰期较野生型的半衰期延长了87.5％，热稳定性得到提高，具有良好的工业应用潜力。

Description

一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用，属于酶的蛋白质工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体。最初人们从抗菌素阿洛酮糖腺苷中分离得到D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖为白色无味晶体，易溶于水，其口感类似于蔗糖，其甜度是传统甜味剂蔗糖的70％，但几乎不提供热量，被美国食品导航网评价为最具潜力的蔗糖替代品。D-阿洛酮糖已被美国食品药物管理局(FDA)认定为食品安全级GRAS。D-阿洛酮糖能够增强胰岛素耐受性，抑制餐后血糖升高，预防糖尿病；减少脂肪堆积，清除活性氧自由基，增加细胞内谷胱甘肽的水平并且在神经保护和相关疾病的治疗中发挥着重要的作用，所以其在食品、营养保健、生物医疗等多个领域具有极高的应用潜力。
D-阿洛酮糖在自然界少量存在，只在甘蔗糖蜜、水果干、小麦和鼠刺属植物中少量存在。目前，制备D-阿洛酮糖有化学合成法制备和生物酶法制备两种途径。化学制备方法存在一些弊端，例如易形成副产物，易造成环境污染等。相对来说，生物酶法更为环保，并且产物D-阿洛酮糖的后续分离纯化也更加简便。因此，目前国内外生产D-阿洛酮糖主要还是应用生物酶法进行制备。
根据Izumoring稀少糖转化策略，酮糖3-差向异构酶的可逆催化可以实现D-果糖与D-阿洛酮糖，D-塔格糖与D-山梨糖之间的相互转化。酮糖3-差向异构酶根据底物特异性的不同，可分为D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase，DTEase)以及D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase，DPEase)。DPEase的最适底物通常为D-阿洛酮糖，可催化D-果糖C3位上的羟基的差向异构将其转化为D-阿洛酮糖，是生产D-阿洛酮糖的常用酶种，但DPEase野生酶热稳定性较差，受限于大规模工业应用，因此如何有效提高DPEase热稳定性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是通过蛋白质定向进化技术对Clostridium cellulolyticum来源的DPEase进行分子改造，获得发酵酶活及热稳定性提高的突变体。
本发明提供了一种热稳定性提高的DPEase突变体，是以来源于Clostridiumcellulolyticum的DPEase为亲本氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将亲本氨基酸的第56位的组氨酸突变成谷氨酰胺获得单突变体酶，并命名为H56Q。
在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体酶H56Q的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
本发明提供一种编码所述突变体酶H56Q的基因。
本发明提供一种携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1或pCDFDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。
本发明提供一种携带编码所述突变体酶的基因的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞为重组原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法为将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。
本发明提供一种制备D-阿洛酮糖的方法，所述方法为以D-果糖为底物，加入突变体H56Q，进行反应一段时间即得到D-阿洛酮糖。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为以1～1000g·L-1的D-果糖为底物，加入1～500U纯化后的突变体H56Q，在55～65℃反应3～5h。
本发明还要求保护所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在食品、营养保健、生物医疗领域制备D-阿洛酮糖或其衍生产品中的应用。
本发明的有益效果：本发明得到DPEase突变体H56Q的发酵酶活为237.4U·mL-1，是野生型147.6U·mL-1的1.61倍。并且突变体H56Q的最适温度为65℃，比野生型DPEase的最适温度提高5℃，其在55℃的半衰期从野生型的80min延长到150min，较野生型的半衰期延长了87.5％，热稳定性得到提高，具有良好的工业应用潜力。
附图说明
图1是C.cellulolyticum DPEase的最适反应温度图。
图2是C.cellulolyticum DPEase突变体H56Q的最适反应温度图。
图3是C.cellulolyticum DPEase野生型与突变体H56Q在55℃下的热稳定性图。
具体实施方式
50mM PBS缓冲液(pH 7.4)：0.5M NaH2PO4 19mL，0.5M Na2HPO4 81mL，NaCl 29.3g，加适量水定容到1000mL。
LB培养基：在1L去离子水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl，用1mol/LNaOH调节pH至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4mL/L，磷酸盐溶液：KH2PO4 0.017mol/L，H2KPO4 0.017mol/L，磷酸盐溶液与其他组分在121℃下分开灭菌20min。
实施例1：DPEase突变体文库的建立
以本实验室前期构建的含有C.cellulolyticum的来源的dpe基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)的质粒pET-24a(+)-dpe(从基因合成公司合成，两端酶切位点分别为NdeI和HindIII)为模板，以F1、R1为引物对dpe基因进行扩增，通过Megaprimer PCR ofWhole Plasmid(MEGAWHOP)将其连接到质粒pET-20b(+)-His6上，构建重组表达载体pET-20b(+)-dpe-His6。
MEGAWHOP具体步骤：
反应体系：2×Super Pfx Master Mix 25μL，50ng Template，500ng megaprimer，ddH2O补齐至50μL。
反应程序：72℃5min；98℃2min；25个循环(98℃30s，55.5℃30s，72℃5min)；72℃延伸10min，并于8℃下保温。
以pET-20b(+)-dpe-His6为模板，以F1、R1为引物对dpe基因进行易错PCR，其产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，验证正确后，将易错PCR产物进行胶回收作为megaprimer，通过MEGAWHOP将其连接至载体pET-20b(+)上，构建得到DPEase易错PCR突变体基因文库。
引物序列如下：
F1：5′-GAAGGAGATATACATATGAAACATGGCATC-3′(划线部分为Nde I酶切位点)SEQID NO.4；
R1：5′-GTGGTGGTGCTCGAGGCTATGTTTATGAC-3′(划线部分为Xho I酶切位点)SEQ IDNO.5。
易错PCR体系：5×Ps buffer 10μL，dNTP mix 4μL，Template 0.5μL，10μMForward primer1μL，10μM Reverse primer 1μL，PrimeSTAR 0.5μL，ddH2O补齐至50μL。
PCR扩增程序为：94℃预热变性4min；然后进行25个循环(98℃，10s；55.5℃，30s；72℃，1min)；最后72℃延伸10min后于8℃保温。
MEGAWHOP产物用1％的琼脂糖凝胶电泳验证，验证正确后经Dpn I处理2h(50μL的PCR产物加入1μL的Dpn I)，将处理产物转化至E.coli BL21(DE3)Gold感受态细胞中(具体转化步骤参见Stratagene公司BL21-Gold(DE3)说明书)，并涂布含100μg·mL-1氨苄的LB平板上于37℃、750r·min-1下的培养12h，使平板上长出单克隆。
实施例2：DPEase突变体的96孔板表达
种子培养：从实施例1中的LB氨苄抗性平板上挑选单克隆接种到每孔含有160μLLB液体培养基的96孔平底浅孔板中(Amp，30μg·mL-1)，置于培养箱中在37℃、750r·min-1下的培养12h。
96孔板表达：将96孔板种子液转接每孔装有160μL LB培养基的96孔锥底浅孔板中(Amp，100μg·mL-1)，先在37℃、750r·min-1下的模块式培养箱中培养4h，加终浓度为0.4mMIPTG后转移至25℃、750r·min-1继续表达24h。
实施例3：KpRD的摇瓶表达
摇瓶表达的KpRD蛋白将被用于实施例4的高通量筛选中。
将重组质粒pET-24a(+)-kpRD(核糖醇2-脱氢酶，ChemBioChem,2015,16(4),592–601)转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞(具体转化步骤参见Stratagene公司BL21(DE3)说明书)，涂布于LB抗性(Kan，30μg·mL-1)平板，在37℃下培养10-16h，待其长出单菌落；从平板上挑取单菌落至10mL的LB液体培养基中(Kan，30μg·mL-1)，在37℃、200r·min-1下培养8-10h得到种子液；取种子液转入200mL的TB培养基中，调节TB培养基的初始OD600为0.1；在37℃、200r·min-1下培养至OD600达到0.5-0.6，加入终浓度为1mmol·L-1IPTG后转移至25℃、200r·min-1摇床中表达24h。表达的KpRD在NADH存在的情况下，可以特异性的氧化D-阿洛酮糖，并伴随着NADH的消耗。NADH在OD340nm处有吸收值，因此通过检测340nm处吸光值的降低值，可检测NADH的消耗，继而与D-阿洛酮糖的含量偶联起来。
实施例4：DPEase突变体的高通量筛选
本研究采用Andreas Bosshart(ChemBioChem,2015,16(4),592–601)等建立的一种高通量筛选方法进行易错PCR突变文库的筛选，方法略有改动。具体操作步骤如下：
从LB抗性平板上挑取单克隆接种至每孔含有100μL LB液体培养基(Amp，100μg·mL-1)的平底96浅孔板中，每个转化子接到一个孔中，同时接空白对照(A1，D6，H12)和野生型(A2，D7，H11)，37℃、750r·min-1振荡培养10-12h。无菌条件下，将上步培养液转接至另一每孔加200μL LB液体培养基(Amp，30μg·mL-1)的平底96浅孔板中，37℃、750r·min-1振荡培养10-12h。原先的菌液加入100μL 30％甘油振荡后于-80℃保菌。
无菌条件下，将上述96孔板种子液转接至每孔加入200μL LB培养基(Amp，100μg·mL-1)的锥底96浅孔板中进行表达产酶，37℃、750r·min-1振荡培养4h后转移至25℃、750r·min-1发酵24h，4000r·min-1离心20min后去上清，菌体于-20℃保存。-20℃保存的菌体每孔加入200μL的20mM HEPES缓冲液，pH 8.0，0.1mM Co2+，以及16μL的Bacterialprotein extraction reagent，在37℃，750r·min-1下处理2.5h，4000r·min-1离心20min后于4℃保藏。
准备每孔加入100μL 240mM D-果糖溶液(缓冲液为20mM HEPES，pH 8.0，0.1mMCo2+)的平底96浅孔板，然后每孔加入适量的粗酶提取液，在750r·min-1，65℃下反应1h。
将适量KpRD表达后E.coli菌体(实施例3)用20mM HEPES缓冲液，pH 8.0，0.1mMCo2+重悬，超声破壁后得到KpRD蛋白，再加入1mM的NADH制得反应液。上述反应完成后，每孔迅速加入120μL的反应液，立即用酶标仪测定340nm处的吸光值。对数据进行处理分析后，将酶活高于野生型的突变体通过酶活的测定进行复筛。
实施例5：突变体的摇瓶表达及酶活测定
种子培养：按照1‰的接种量，从甘油管中吸取10μL重组菌液到10mL的LB液体培养基中(Amp，100μg·mL-1)，在37℃、200r·min-1下培养12h。
摇瓶表达：取种子液转入50mL的LB培养基中，初始OD600为0.1，在37℃、200r·min-1下培养至OD600达到0.5-0.6，加0.1mM IPTG，转移至25℃、200r·min-1摇床中表达24h。
酶活测定：以20mM HEPES，pH 8.0，0.1mM Co2+为缓冲液配置50g·L-1D-果糖作为底物溶液，取800μL底物溶液置于试管中，于55℃水浴锅中预热10min，加入200μL适当稀释的超声破碎后的菌体上清液，迅速振荡均匀后准确反应10min，立即沸水浴10min终止反应。将样品离心后用0.22μm滤膜过滤，经高效液相色谱(HPLC)检测D-阿洛酮糖的含量。
HPLC条件如下：Agilent 1200HPLC色谱仪，ShodexTM Asahipak NH2P-50 4E色谱柱，柱温设定在35℃，Agilent示差检测器，Agilent自动进样器，流动相75％乙腈，有机膜抽滤后超声5min，色谱分析时流动相流速为0.8mL·min-1。根据标准品峰面积和D-阿洛酮糖的吸收峰面积计算D-阿洛酮糖产量。
酶活力单位定义：在pH 8.0，55℃下，每分钟产生1μmol的D-阿洛酮糖即为一个酶活力单位(U)。
选取发酵酶活最高的突变体对其进行测序，根据测序结果，得到的突变体是将野生型突变体氨基酸的第56位的组氨酸突变成谷氨酰胺获得单突变体酶(H56Q)。
表1野生型DPEase及突变体发酵酶活
Figure BDA0002391018040000051
实施例6：DPEase的分离纯化
将DPEase通过Ni2+层析柱进行纯化。具体步骤如下：
用缓冲液1即50mM PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤和重悬菌体后，用20％酒精将高压匀质机清洗消毒三次，再用去离子水洗三次后，利用高压匀质机对菌体进行破壁处理，压力在800-900bar之间。将细胞破碎液在4℃、5000rpm下离心15min，收集上清液，将上清液用0.22μm的滤膜过滤处理。
预先使用至少10倍柱体积缓冲液1冲洗Ni2+层析柱，然后将已过滤的粗酶液上样，重复挂柱三次。分别用40mL 10mM咪唑溶液(取0.68g咪唑加入1000mL缓冲液1中)、20mL50mM咪唑溶液(取1.36g咪唑加入1000mL缓冲液1中)、10mL 100mM咪唑溶液(取6.81g咪唑加入1000mL缓冲液1中)洗脱杂蛋白，然后用4mL 200mM咪唑溶液(取13.61g咪唑加入1000mL缓冲液1中)洗脱目的蛋白，最后用缓冲液2(500mM咪唑溶液，取34.04g咪唑加入1000mL缓冲液1中)充分洗脱残余蛋白。
在4℃下，用20mM HEPES缓冲液，pH 8.0，对纯化后的蛋白样品进行透析，一共两次，每次透析6-8h。
实施例7：DPEase酶学性质的探究
(1)DPEase酶活力的测定:以20mM HEPES，pH 8.0，0.1mM Co2+为缓冲液配置50g·L-1D-果糖作为底物溶液，取800μL底物溶液置于试管中，于55℃水浴锅中预热10min，然后加入终浓度0.2μM纯化后的酶，迅速振荡均匀后准确反应10min，立即沸水浴10min终止反应。将样品离心后用0.22μm滤膜过滤，经高效液相色谱(HPLC)检测D-阿洛酮糖的含量。
(2)酶活力单位定义：在pH 8.0，55℃下，每分钟产生1μmol的D-阿洛酮糖即为一个酶活力单位(U)。
(3)温度对DPEase酶活的影响:
以20mM HEPES，pH 8.0，0.1mM Co2+为缓冲液配置50g·L-1D-果糖作为底物溶液，取800μL底物溶液置于试管中，分别在不同温度(45-75℃)下预热10min，然后分别加入终浓度为0.2μmol·L-1的纯酶，迅速振荡均匀后准确反应10min，立即沸水浴10min终止反应。将样品离心后用0.22μm滤膜过滤，经高效液相色谱(HPLC)检测D-阿洛酮糖的浓度。野生型DPEase的最适温度为60℃，突变体H56Q的最适温度为65℃，较野生型提高了5℃。
分别将酶液置于55℃和60℃进行温育，固定时间间隔取样，并立即在55℃下按照上述方法测定酶活，将未温育处理的酶液所测得的酶活记为相对酶活100％。绘制相对酶活与时间的关系曲线(如图3)，根据曲线得到DPEase野生型及其突变体H56Q在该温度下的半衰期。在55℃下野生型半衰期为80min，突变体H56Q为150min；在60℃下野生型为70min，突变体H56Q半衰期为100min。突变体H56Q的热稳定性更好，具有工业应用潜力。
表2野生型DPEase及其突变体H56Q的热稳定性
Figure BDA0002391018040000071
实施例8：H56Q在制备D-阿洛酮糖中的应用
以10mL300g·L-1的D-果糖为底物，加入90U纯化后的突变体H56Q，在60℃反应4h。反应后利用HPLC检测方法(具体方法参照实施例5)，测定D-阿洛酮糖的含量为87g·L-1。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 293
<212> PRT
<213> Clostridium cellulolyticum
<400> 1
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile
35 40 45
Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala His Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val
50 55 60
Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp
65 70 75 80
Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu
85 90 95
Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg
115 120 125
Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly
130 135 140
Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile
145 150 155 160
Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu
260 265 270
Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu
275 280 285
Cys His Lys His Ser
290
<210> 2
<211> 879
<212> DNA
<213> Clostridium cellulolyticum
<400> 2
atgaaacatg gcatctatta tgcctattgg gaacaggaat gggaagcaga ttacaaatat 60
tatattgaaa aagtggccaa attaggcttt gacattttag aaattgcagc ctctccgtta 120
ccgttttata gtgatattca gatcaatgag ctgaaagcct gcgcacatgg caatggtatc 180
acactgacgg ttggtcatgg tccgagcgcc gaacagaatc tgtctagtcc agatccggat 240
atacgcaaaa atgccaaagc gttttatacg gatctgctga aacgtctgta caaactggat 300
gttcatttga ttggcggtgc cctgtattct tattggccga tcgattatac caaaaccatc 360
gataaaaaag gcgattggga acgtagcgtg gaatcagtgc gcgaagttgc caaagttgcg 420
gaagcatgtg gcgtggattt ttgcttagaa gttctgaatc gctttgaaaa ttacctgatc 480
aatacagctc aggaaggtgt ggattttgtt aaacaggttg atcataacaa tgttaaagtg 540
atgctggata cctttcacat gaatatcgaa gaagatagca tcggtggtgc cattcgtacc 600
gccggtagct atctgggcca tctgcatacg ggcgaatgca atcgtaaagt tccaggtcgc 660
ggtcgcattc cttgggttga aatcggcgaa gccctggccg acattggcta taatggctca 720
gttgtgatgg aaccgtttgt tcgtatgggc ggcaccgtgg gtagtaatat caaagtgtgg 780
cgtgacatct ctaatggtgc agatgaaaaa atgctggatc gcgaagcaca ggcagcctta 840
gatttttcac gctatgtgtt agaatgtcat aaacatagc 879
<210> 3
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Lys His Gly Ile Tyr Tyr Ala Tyr Trp Glu Gln Glu Trp Glu Ala
1 5 10 15
Asp Tyr Lys Tyr Tyr Ile Glu Lys Val Ala Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Ile Ala Ala Ser Pro Leu Pro Phe Tyr Ser Asp Ile Gln Ile
35 40 45
Asn Glu Leu Lys Ala Cys Ala Gln Gly Asn Gly Ile Thr Leu Thr Val
50 55 60
Gly His Gly Pro Ser Ala Glu Gln Asn Leu Ser Ser Pro Asp Pro Asp
65 70 75 80
Ile Arg Lys Asn Ala Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Leu Leu Lys Arg Leu
85 90 95
Tyr Lys Leu Asp Val His Leu Ile Gly Gly Ala Leu Tyr Ser Tyr Trp
100 105 110
Pro Ile Asp Tyr Thr Lys Thr Ile Asp Lys Lys Gly Asp Trp Glu Arg
115 120 125
Ser Val Glu Ser Val Arg Glu Val Ala Lys Val Ala Glu Ala Cys Gly
130 135 140
Val Asp Phe Cys Leu Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Asn Tyr Leu Ile
145 150 155 160
Asn Thr Ala Gln Glu Gly Val Asp Phe Val Lys Gln Val Asp His Asn
165 170 175
Asn Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Ile Gly Gly Ala Ile Arg Thr Ala Gly Ser Tyr Leu Gly His Leu
195 200 205
His Thr Gly Glu Cys Asn Arg Lys Val Pro Gly Arg Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Trp Val Glu Ile Gly Glu Ala Leu Ala Asp Ile Gly Tyr Asn Gly Ser
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Arg Met Gly Gly Thr Val Gly Ser Asn
245 250 255
Ile Lys Val Trp Arg Asp Ile Ser Asn Gly Ala Asp Glu Lys Met Leu
260 265 270
Asp Arg Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Phe Ser Arg Tyr Val Leu Glu
275 280 285
Cys His Lys His Ser
290
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaaggagata tacatatgaa acatggcatc 30
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtggtggtgc tcgaggctat gtttatgac 29

Claims (9)

1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体以序列如SEQ IDNO.1所示的氨基酸为亲本，将亲本的第56位由组氨酸突变成谷氨酰胺。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。
5.表达权利要求1所述突变体或权利要求2所述基因的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为原核细胞或真核细胞。
7.一种制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，以D-果糖为底物，加入权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体进行反应，得到D-阿洛酮糖。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述D-果糖的浓度为1～2000g·L-1，在55～70℃反应3～6h。
9.权利要求1所述的突变体、编码权利要求1所述突变体的基因、权利要求3或4所述表达载体或权利要求5～6所述任一宿主细胞在食品、营养保健领域中的应用。
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