CN113308456B - 一种热稳定性增强的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体 - Google Patents

一种热稳定性增强的d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种热稳定性增强的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了以来源于微生物Thermoclostridium caenicola的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶作为亲本，将107位的甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro，155位的苯丙氨酸Phe突变为酪氨酸Tyr，162位的天冬氨酸Asp突变为苏氨酸Thr，70位的丙氨酸Ala突变为脯氨酸Pro，获得单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P，热力学和动力学稳定性得到了提高，在工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的应用价值。

Description

一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体
技术领域
本发明涉及一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术
2002年，国际稀少糖协会(ISRS)提出了稀少糖的定义：在自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物。稀少糖由于其能量值低且具有降血糖、降血脂、益生元、免疫调节等多种生理功能，已成为当前研究的热点内容。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是目前研究最热的稀少糖，已经被美国FDA确认为普遍公认安全(GRAS)，在医药和食品等领域具有巨大的应用价值和市场前景。D-阿洛酮糖甜度约为蔗糖的70％，但能量值却只有蔗糖的10％，具有较高的溶解度和较低的血糖反应，是理想蔗糖替代品。2019年，FDA宣布允许食品制造商在营养标签的总糖和添加糖计数中可以不计入D-阿洛酮糖(FDA-2019-D-0725)。此外D-阿洛酮糖具有多种独特的营养学和生理学功能，包括：低能量，可预防肥胖；可作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂，起到降低血糖的作用；降低血脂，减少脂肪合成酶活性，控制腹腔内脂肪堆积以及抗氧化活性、神经保护等。同时，在食品体系中添加D-阿洛酮糖可以起到提高凝胶性的作用，并且能与食品体系中的蛋白质发生美拉德反应产生良好的化学风味。D-阿洛酮糖可通过化学法合成，但存在许多弊端，例如会产生严重的化学污染，形成不必要的副产物，反应步骤繁琐，反应条件苛刻等。相比于化学合成，具有生态友好性和高度特异性的酶法生物转化是更具优势的D-阿洛酮糖生产策略。
酮糖3-差向异构酶能以唯一底物D-果糖作为原料，通过C-3差向异构化反应，一步法直接生成D-阿洛酮糖，是目前最有可能实现工业化的D-阿洛酮糖制备用酶。然而已鉴定的野生型酶的热稳定性普遍较低，为满足工业化应用的需求，不同属性的酮糖3-差向异构酶的定向挖掘与热稳定性分析以及基于融合标签、定向进化和理性设计的酮糖3-差向异构酶热稳定性分子改造等研究已被广泛开展。随着生物信息学和计算生物学的发展，基于计算机辅助的酶热稳定性分子改造已成为研究热点。根据已有的酮糖3-差向异构酶的晶体结构进行同源建模，借助计算机辅助预测蛋白质折叠自由能变化，理性选取影响热稳定性的突变“热点”，利用定点突变的方法对Thermoclostridium caenicola DAEase进行热稳定性改造，通过加强结构整体刚性、形成亚基间氢键以及优化表面电荷分布，获得热稳定性增强的突变体。
发明内容
[技术问题]
目前，已经报道的D-阿洛酮糖3-差向异构酶有23个，且大多数在60℃下的半衰期低于2h，而工业生产需要较高的温度进行反应。本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶。
[技术方案]
为了解决上述存在的技术问题，本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Thermoclostridium caenicola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)进行分子改造。
本发明的第一个目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生酶的基础上，将107位的甘氨酸突变为脯氨酸，155位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，162位的天冬氨酸突变为苏氨酸或70位的丙氨酸突变为脯氨酸。
在一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的野生酶的基础上，将107位的甘氨酸突变为脯氨酸，155位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，162位的天冬氨酸突变为苏氨酸和70位的丙氨酸突变为脯氨酸。
本发明的第二个目的是提供编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的第三个目的是提供表达所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体或含有核苷酸序列如SEQ ID No.3所示基因的载体。
本发明的第四个目的是提供含有上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体或上述载体的基因工程菌。
在一种实施方式中，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括DH5α或BL21(DE3)。
在一种实施方式中，所述的基因工程菌以pET-22b(+)为表达载体。
本发明第五个目的是提供一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性的方法，所述方法为，对氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行改造，将第107位的甘氨酸突变为脯氨酸，第155位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第162位的天冬氨酸突变为苏氨酸和第70位的丙氨酸突变为脯氨酸。
本发明还提供所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体或所述基因工程菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。
本发明还提供所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体或所述基因工程菌在食品、药物制备方面的应用。
有益效果：
获得单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P，热稳定性和动力学稳定性得到了提高：单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P在60℃的t1/2值由野生酶的0.28h分别增加到11.36h、7.07h、0.64h、0.54h，Tm值由野生酶的67.23℃分别上升为72.93℃、72.60℃、68.69℃、67.97℃，单点突变体酶G107P、F155Y、A70P最适温度上升为70℃，与野生酶相比提高了5℃；四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P在60℃下孵育24h后仍能维持86％的残余酶活，65℃时t1/2值是11.75h，Tm值由野生酶的67.23℃上升为79.48℃。四点突变体酶的最适温度上升为75℃，与野生酶相比提高了10℃。
附图说明
图1组合突变对DAEase解折叠温度(Tm)的影响。
具体实施方式
DAEase酶活测定方法：以50g/L的D-果糖为底物，加入0.5μmol/L的纯酶，1mmol/LCoCl2，在65℃，pH 7.5条件下酶反应5min，煮沸10min灭活。反应结束后，将产物离心过膜，稀释到一定浓度后使用HPLC进行检测。
酶活定义(U)：标准反应条件下，单位时间(min)催化合成1μmol D-阿洛酮糖所需的酶量。
实施例1:Thermoclostridium caenicola DAEase酶突变体的制备方法
(1)构建野生型重组质粒pET22b-thca-dae
在核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的野生酶DAEase的5’端和3’端分别引入Nde I和Xho I两个限制性酶切位点，在DAEase的终止密码子前插入6×His标签(CACCACCACCACCACCACTAA)后，委托生物工程(上海)股份有限公司合成相应序列。将序列与载体pET-22b(+)连接，获得野生型重组质粒pET22b-thca-dae。
(2)突变质粒的构建：
以步骤(1)中构建的野生型重组质粒pET22b-thca-dae为模板，设计定点突变的突变引物，经PCR，分别引入单点突变G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变G107P/F155Y/D162T/A70P，构建突变质粒pET-22b(+)-G107P、pET-22b(+)-F155Y、pET-22b(+)-D162T、pET-22b(+)-A70P和pET-22b(+)-G107P/F155Y/D162T/A70P。
测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-22b(+)-G107P、pET-22b(+)-F155Y、pET-22b(+)-D162T、pET-22b(+)-A70P和pET-22b(+)-G107P/F155Y/D162T/A70P构建成功。四点突变后的目的片段DAEase的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
突变引物如下所示，下划线为突变点：
表1突变引物
Figure BDA0003054539510000041
PCR扩增：反应体系参照表2，总体积为20μL：
表2 PCR反应体系
Figure BDA0003054539510000042
反应程序为：95℃，2min(预变性)；95℃，15s(变性)；56℃，15s(退火)；72℃，3min15s(延伸)；循环30次；72℃，5min(终延伸)；4℃，∞(保存)。
取2uL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小是否正确，验证无误后，向PCR产物中加入1μL的Q.cut Dpn I和2μL的Q.cut Buffer(10×)，于37℃进行1h酶切反应。酶切反应结束后，使用PCR快速纯化试剂盒纯化酶切后的PCR产物，将5μL纯化后的PCR产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。然后挑取阳性克隆子进行质粒抽提和DNA测序，得到正确的突变质粒pET-22b(+)-G107P、pET-22b(+)-F155Y、pET-22b(+)-D162T、pET-22b(+)-A70P和pET-22b(+)-G107P/F155Y/D162T/A70P。
实施例2:Thermoclostridium caenicola DAEase的突变体酶的表达纯化方法
(1)将实施例1中的测序验证正确的突变质粒pET-22b(+)-G107P、pET-22b(+)-F155Y、pET-22b(+)-D162T、pET-22b(+)-A70P和pET-22b(+)-G107P/F155Y/D162T/A70P和野生型重组质粒pET22b-thca-dae分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃、200rpm摇培过夜，获得种子液；将种子液以体积比2％接入LB培养基37℃培养3-4h至OD600值为0.6～0.8，降温至28℃，加入终浓度为1.0mM的IPTG诱导6h，获得发酵液。
(2)将发酵液于4℃、8000rpm离心20min，取菌体。向菌体中加入20mL缓冲液(50mMTris，200mM NaCl，调节pH至7.5)，充分重悬菌体。在冰浴条件下，对重悬后的菌体进行超声破碎，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2s，共计15min。破碎后的菌体在4℃条件下，8000rpm离心10min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
(3)在4℃环境下利用恒流泵，泵入6～12倍柱体积的去离子水冲洗镍离子亲和层析柱，然后用低盐浓度的缓冲液(500mmol/L NaCl，50mM Tris，调节pH至7.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与低盐浓度缓冲液pH值一致时，将步骤(2)中的过滤后的粗酶液加入到平衡后的镍离子亲和层析柱中。先用含有低浓度咪唑的缓冲液(500mmol/L NaCl，50mmol/L咪唑，50mM Tris，调节pH至7.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，50mM Tris，调节pH至7.0)洗脱，收集吸收峰的洗脱液。
(4)透析：将步骤(3)得到的洗脱液转移至截留分子量为10kDa的透析袋中，用透析夹夹紧后放入透析缓冲液A(10mM的EDTA·2Na，50mM的Tris，调节pH至7.0)中，置于4℃的层析柜，透析18h，每次6h更换一次新鲜的透析缓冲液A，以除去洗脱液中的咪唑以及其他金属离子。再将透析袋转移至透析缓冲液B(50mM的Tris，调节pH至7.0)中，同样透析18h，每次6h更换一次新鲜的透析缓冲液B。透析结束后，收集透析袋中的纯酶液至10mL EP管中，于4℃冰箱保存，备用。测定纯酶液酶活，纯化后的野生酶、单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P达到电泳纯。
实施例3：酶学性质研究
1.最适温度
将实施例2中的野生酶和突变体酶分别在pH 7.5不同温度(40-80℃)下进行酶反应，结果如表3所示，单点突变体酶G107P、F155Y、A70P的最适温度为70℃，与野生酶相比提高了5℃，四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P的最适温度上升为75℃，与野生酶相比提高了10℃。
表3最适反应条件下野生酶和突变体酶的反应最适温度比较
Figure BDA0003054539510000061
2.热力学稳定性实验
通过Nano DSC测定解折叠温度(Tm)来表征野生酶及突变体酶的热力学稳定性。具体操作步骤如下：
(1)基线扫描：对透析液B(50mM的Tris，调节pH至7.0)进行10min的脱气处理后，加入样品池和参比池，反复吹吸去除气泡后，进行基线扫描。设置运行程序为：温度扫描范围20-100℃，压力3atm，升温速率1℃/min，重复次数5次。
(2)样品扫描：将实施例2中获得的野生酶或突变体酶稀释至1mg/mL后进行10min的脱气处理，将样品池中的透析液完全吸出，加入脱气后的野生酶或突变体酶，反复吹吸去除气泡后，进行样品扫描。设置运行程序为：温度扫描范围30-90℃，压力3atm，升温速率1℃/min。
(3)结果处理：利用NanoAnalyze软件对运行结果进行处理，使用Two-StateScaled模型进行数据拟合，获得野生酶及突变体酶的Tm值(图1，表4)。
3.动力学稳定性实验
采用半衰期(t1/2)来表征实施例2获得的野生酶及突变体酶的动力学稳定性。为了测定野生酶或突变体酶的t1/2，将野生酶和突变体酶置于60和65℃下进行恒温孵育。每隔一定的时间，取出经不同条件孵育的野生酶或突变体酶，按以下条件进行酶反应，测定野生酶或突变体酶的残余酶活力。
(1)酶反应标准体系：50g/L的D-果糖，终浓度为1mM的Co2+，0.5μM的重组酶，50mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)。酶反应总体积为1mL。
(2)酶反应标准条件：将野生酶和突变体酶置于60和65℃下，分别进行恒温孵育，准确计时5min后立即将野生酶和突变体酶置于沸水中煮沸10min，进行灭酶处理，结束酶反应。
(3)酶活测定方法：酶反应结束后，12000r/min离心5min，并吸取300-400μL上清液，经0.22μm水系滤膜除杂后，加至液相小管，待检测。实验中采用高效液相色谱法测定酶反应产物的含量，进而计算重组酶活力。色谱柱型号：Sugar-Pak I；柱温：85℃；检测器：示差折光检测器；流动相：含50mg/L EDTA·Ca的超纯水；流速：0.4mL/min；进样量：10μL。
按以下方程计算失活速率常数：
Ln(Et/E0)＝-kd×t，式中t为时间(h)，kd为失活速率常数(h-1)，Et/E0为相对酶活(％)。
再按以下方程计算t1/2值
t1/2＝Ln2/kd
结果如表4所示，实施例2中获得的单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P的热稳定性和动力学稳定性均得到大幅度改善。单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P在60℃的t1/2值由野生酶的0.28h分别增加到11.36h、7.07h、0.64h、0.54h，Tm值由野生酶的67.23℃分别上升为72.93℃、72.60℃、68.69℃、67.97℃。四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P在60℃下孵育24h后仍能维持86％的残余酶活，65℃时t1/2值是11.75h，Tm值由野生酶的67.23℃上升为79.48℃。Thermoclostridium caenicola DAEase的单点突变体酶G107P、F155Y、D162T、A70P和四点突变体酶G107P/F155Y/D162T/A70P热稳定性和动力学稳定性得到显著增强，更加适用于工业化生产的要求。
表4野生酶和突变体酶的t1/2和Tm值比较
Figure BDA0003054539510000071
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶突变体
<130> BAA210497A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaatacg gcatctttta cgcctattgg gaaaaagaat ggaagggcga tttcatcacc 60
tatatcgaga aggtcaaaaa actgggcttt gacatcctgg aggtgggctg cggcgatttt 120
cacaaacagc ccgactccta tttccatacc ctccgggatg cggccaggga atacgatatt 180
atcctgacgg gtggttatgg cccccgggct gagcacaacc tctgctctcc ggataccgcc 240
gttgtggaaa acgcactggc tttctacagc gatatcttca gaaaaatgga gattgcaggc 300
atacgttcca tcggcggtgg gctttatgcc tactggcctg tagattacag cagggagccg 360
gacaaggcag gcgacctgga gcgaagcatt aagaacatgc gcaggctggc ggacatcgcc 420
gaaaggcatg gcatcaccct gaacatggag gtgcttaacc gctttgaggg ctatctgatc 480
aacgatacca acgaaggcct tgcctatatc cgcgccgtgg acaagccaaa tgtcaagctg 540
atgctggata ccttccacat gaacatcgaa gaggattcgt tcaccgagcc catcctccag 600
gccgggaaat acctgggcca tgtccacgtg ggcgagccca acaggaagcc gccccgcgag 660
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gtggtcatgg agccctttgt gaccatgggc ggccaggtgg gaaaagatat ctgcgtctgg 780
cgcgacttgt cccagggagc tacggaagag gatctggaca gggacgctga aaaatccctg 840
gcgttcctca aaggcatgtt tgaagcatga 870
<210> 2
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Tyr Gly Ile Phe Tyr Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Trp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Phe Ile Thr Tyr Ile Glu Lys Val Lys Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Val Gly Cys Gly Asp Phe His Lys Gln Pro Asp Ser Tyr Phe
35 40 45
His Thr Leu Arg Asp Ala Ala Arg Glu Tyr Asp Ile Ile Leu Thr Gly
50 55 60
Gly Tyr Gly Pro Arg Ala Glu His Asn Leu Cys Ser Pro Asp Thr Ala
65 70 75 80
Val Val Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser Asp Ile Phe Arg Lys Met
85 90 95
Glu Ile Ala Gly Ile Arg Ser Ile Gly Gly Gly Leu Tyr Ala Tyr Trp
100 105 110
Pro Val Asp Tyr Ser Arg Glu Pro Asp Lys Ala Gly Asp Leu Glu Arg
115 120 125
Ser Ile Lys Asn Met Arg Arg Leu Ala Asp Ile Ala Glu Arg His Gly
130 135 140
Ile Thr Leu Asn Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Gly Tyr Leu Ile
145 150 155 160
Asn Asp Thr Asn Glu Gly Leu Ala Tyr Ile Arg Ala Val Asp Lys Pro
165 170 175
Asn Val Lys Leu Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Thr Glu Pro Ile Leu Gln Ala Gly Lys Tyr Leu Gly His Val
195 200 205
His Val Gly Glu Pro Asn Arg Lys Pro Pro Arg Glu Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Trp Gly Glu Ile Gly Lys Ala Leu Arg Gln Ile Gly Tyr Asp Gly Pro
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Thr Met Gly Gly Gln Val Gly Lys Asp
245 250 255
Ile Cys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gln Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu
260 265 270
Asp Arg Asp Ala Glu Lys Ser Leu Ala Phe Leu Lys Gly Met Phe Glu
275 280 285
Ala
<210> 3
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaaatacg gcatctttta cgcctattgg gaaaaagaat ggaagggcga tttcatcacc 60
tatatcgaga aggtcaaaaa actgggcttt gacatcctgg aggtgggctg cggcgatttt 120
cacaaacagc ccgactccta tttccatacc ctccgggatg cggccaggga atacgatatt 180
atcctgacgg gtggttatgg cccccggccg gagcacaacc tctgctctcc ggataccgcc 240
gttgtggaaa acgcactggc tttctacagc gatatcttca gaaaaatgga gattgcaggc 300
atacgttcca tcggcggtcc gctttatgcc tactggcctg tagattacag cagggagccg 360
gacaaggcag gcgacctgga gcgaagcatt aagaacatgc gcaggctggc ggacatcgcc 420
gaaaggcatg gcatcaccct gaacatggag gtgcttaacc gctatgaggg ctatctgatc 480
aacaccacca acgaaggcct tgcctatatc cgcgccgtgg acaagccaaa tgtcaagctg 540
atgctggata ccttccacat gaacatcgaa gaggattcgt tcaccgagcc catcctccag 600
gccgggaaat acctgggcca tgtccacgtg ggcgagccca acaggaagcc gccccgcgag 660
ggcagaattc cctgggggga gatcggaaag gccctgcgcc agataggcta tgatggcccg 720
gtggtcatgg agccctttgt gaccatgggc ggccaggtgg gaaaagatat ctgcgtctgg 780
cgcgacttgt cccagggagc tacggaagag gatctggaca gggacgctga aaaatccctg 840
gcgttcctca aaggcatgtt tgaagcatga 870
<210> 4
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Lys Tyr Gly Ile Phe Tyr Ala Tyr Trp Glu Lys Glu Trp Lys Gly
1 5 10 15
Asp Phe Ile Thr Tyr Ile Glu Lys Val Lys Lys Leu Gly Phe Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Val Gly Cys Gly Asp Phe His Lys Gln Pro Asp Ser Tyr Phe
35 40 45
His Thr Leu Arg Asp Ala Ala Arg Glu Tyr Asp Ile Ile Leu Thr Gly
50 55 60
Gly Tyr Gly Pro Arg Pro Glu His Asn Leu Cys Ser Pro Asp Thr Ala
65 70 75 80
Val Val Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser Asp Ile Phe Arg Lys Met
85 90 95
Glu Ile Ala Gly Ile Arg Ser Ile Gly Gly Pro Leu Tyr Ala Tyr Trp
100 105 110
Pro Val Asp Tyr Ser Arg Glu Pro Asp Lys Ala Gly Asp Leu Glu Arg
115 120 125
Ser Ile Lys Asn Met Arg Arg Leu Ala Asp Ile Ala Glu Arg His Gly
130 135 140
Ile Thr Leu Asn Met Glu Val Leu Asn Arg Tyr Glu Gly Tyr Leu Ile
145 150 155 160
Asn Thr Thr Asn Glu Gly Leu Ala Tyr Ile Arg Ala Val Asp Lys Pro
165 170 175
Asn Val Lys Leu Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Asp
180 185 190
Ser Phe Thr Glu Pro Ile Leu Gln Ala Gly Lys Tyr Leu Gly His Val
195 200 205
His Val Gly Glu Pro Asn Arg Lys Pro Pro Arg Glu Gly Arg Ile Pro
210 215 220
Trp Gly Glu Ile Gly Lys Ala Leu Arg Gln Ile Gly Tyr Asp Gly Pro
225 230 235 240
Val Val Met Glu Pro Phe Val Thr Met Gly Gly Gln Val Gly Lys Asp
245 250 255
Ile Cys Val Trp Arg Asp Leu Ser Gln Gly Ala Thr Glu Glu Asp Leu
260 265 270
Asp Arg Asp Ala Glu Lys Ser Leu Ala Phe Leu Lys Gly Met Phe Glu
275 280 285
Ala

Claims (10)

1.一种热稳定性增强的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.编码权利要求1所述D-阿洛酮糖 3-差向异构酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.含有权利要求3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)为表达载体。
7.如权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括DH5α或BL21(DE3）。
8.一种提高D-阿洛酮糖 3-差向异构酶热稳定性的方法，其特征在于，对氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶进行改造，将第107位的甘氨酸突变为脯氨酸，第155位的苯丙氨酸突变为酪氨酸，第162位的天冬氨酸突变为苏氨酸和第70位的丙氨酸突变为脯氨酸。
9.权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体或权利要求5~7任一所述的基因工程菌在制备D-阿洛酮糖中的应用。
10.权利要求1所述的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶突变体或权利要求5~7任一所述的基因工程菌在食品、药物制备方面的应用。
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