CN103849612A - 一种d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用 - Google Patents

一种d-阿洛酮糖 3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用 Download PDF

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    • C12N9/90—Isomerases (5.)
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Abstract

一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明公开了由来源于梭状芽孢杆菌（Clostridiumbolteae）ATCCBAA-613的D-阿洛酮糖3-差向异构酶（简称DPE酶）作为亲本，利用基因突变技术，将其68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分别替换为异亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，获得突变体酶Y68I/G109P，其热稳定性和催化活性均得到提高，具有重要的工业应用价值。

Description

一种D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用
技术领域
本发明公开一种D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用，属于酶的基因工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（DPE酶）属于D-塔格糖 3-差向异构酶（简称DTE）家族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。DPE酶可分别催化D-果糖和D-山梨糖生成D-阿洛酮糖和D-塔格糖。目前，DPE酶用于催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。
随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要经济价值和实际意义的当务之急。D-阿洛酮糖是一种稀有糖，具有多种营养和生理特性。D-阿洛酮糖可被用作低热量的甜味剂。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品，允许用于食品和膳食补充剂中。另外D-阿洛酮糖具有保护胰腺β-胰岛细胞，减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。
虽然D-阿洛酮糖的需求量在日益增加，但其在自然界中含量极少且极难获得。生物法制备D-阿洛酮糖是近年来的一个研究热点。良好的生物催化剂的开发对工业应用至关重要。耐热酶具有多种优点，如转化率高，反应速度快，污染少，底物粘度低等。因此，开发具有良好热稳定性的DPE酶对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。
由于来源于野生菌株未经改造的DPE酶在热稳定性、催化活性等方面存在一定的局限性，限制了其应用范围。本实验室开发的梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶可以有效促进D-果糖与D-阿洛酮糖之间的转化（Min Jia, et al. 2013, Applied Microbiology and Biotechnology, DOI 10.1007/s00253-013-4924-8）。但为获得更适合的生物催化剂，通过定点突变的方法，对DPE酶进行分子改造，进一步提高其催化活性和热稳定性，以期得到酶学性质更适合工业应用的DPE酶。
发明内容
本发明提供一种D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的68位和109位双突变体酶及其应用，对D-阿洛酮糖的生产有重要的意义。
本发明的技术方案：一种功能改善的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶DPE的突变体酶Y68I/G109P，将来源于梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶进行突变所得的突变体酶；将原来DPE基因中的68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分别替换为异亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，命名为Y68I/G109P。
与野生型DPE酶相比，所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的热稳定性获得提高，以在55℃下的半衰期t50来表示热稳定性，DPE的突变体酶Y68I/G109P的半衰期为78.3min，是野生型DPE酶的1.8倍；所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的催化活性获得提高，与野生菌相比，其K m 值降低，k cat/K m得到提高；
  K m，mM Kcat，s-1 k cat/K m，s-1 mM-1
野生菌 54.45 56.10 1.031
Y68I/G109P 49.12 60.34  1.228。
一种重组表达质粒，其中含有所述DPE的突变体酶Y68I/G109P基因。
一种表达宿主，其被含有所述DPE的突变体酶Y68I/G109P基因的重组表达质粒转化。
所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的应用，在化学、食品和制药领域中的应用。
将DPE酶的底物结合区域内的68位的Tyr和109位的Gly分别替换为Ile和Pro，提高了DPE酶的热稳定性和催化活性。
所述梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）ATCC BAA-613的DPE酶基因在GenBank的编号为CLOBOL_00069，基因全长876个核苷酸（见序列表中 SEQ ID No：1），编码291个氨基酸（见序列表中 SEQ ID No：2）。
所述DPE酶突变体是将其68位的Tyr和109位的Gly分别替换为Ile和Pro，命名为Y68I/G109P（见序列表中 SEQ ID No：4），Y68I/G109P的核苷酸序列见（SEQ ID No：3）。
本发明还提供DPE酶的突变体酶的制备方法，其具体步骤为：
1）在梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶模拟结构的基础上确定突变位点；
2）设计定点突变的突变引物，以携带DPE酶基因的载体为模板进行定点突变构建突变质粒pet22b(+)-Y68I；
3）设计定点突变的突变引物，以pet22b(+)-Y68I为模板进行定点突变构建突变质粒pet22b(+)-Y68I/G109P；
4）将突变质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后的阳性单克隆进行发酵培养；
5）离心菌体，重悬后超声破碎，Ni2+柱纯化得到突变体Y68I/G109P。
本发明的有益效果：本发明提供一种有较高催化活性的、功能改善的DPE酶的突变体酶Y68I/G109P，其半衰期为78.3min，是野生型DPE酶的1.8倍， K m 值降低至49.12mM，k cat/K m提高到1.228 s-1 mM-1，。该突变体酶在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。
附图说明
图1 梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE的突变体酶纯化SDS-PAGE电泳图。泳道M：标准分子量蛋白；泳道1：菌体破碎上清；泳道2：平衡液洗脱；泳道3：低咪唑洗脱；泳道4：突变体Y68I/G109P。
图2梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶在55℃下的热稳定性
■：梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶；●：DPE的突变体酶Y68I/G109P；
图3 D-阿洛酮糖生物转化曲线
■：梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶；●：DPE的突变体酶Y68I/G109P。
具体实施方式
实施例1：DPE酶定点突变分析及突变体制备方法
通过对DPE酶3D空间结构进行分析，发现G109位于活性位点的β回转区域，通过改变109位氨基酸的疏水性，可改变酶分子的稳定性。因此将疏水性较弱的甘氨酸Gly替换为疏水性较强的脯氨酸Pro，以增加其热稳定性。Y68位于活性口袋中，通过改变68位的氨基酸，可改变疏水口袋的形状，从而改变酶活力。研究发现，将68位的酪氨酸Tyr替换为异亮氨酸Ile，可增加其催化活性。
利用快速PCR定点突变的方法构建pet22b(+)-Y68I/G109P突变质粒；
pet22b(+)-Y68I/G109P突变质粒的构建以pet22b(+)-cb-dpe质粒为模板，利用Y68I的突变引物通过一次PCR得到大小为6.4kbp左右的产物，将PCR产物经DpnI处理后，再利用G109P的突变引物进行二次PCR，得到的PCR产物经DpnI处理后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选转化子测序验证。
测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pet22b(+)-Y68I/G109P构建成功。
突变引物如下所示：（下划线为突变点）
Y68I 1：5’-GTTCTAACAG CTGGTATTGG ACCTACTAAA-3’
Y68I 2：5’-ACCAGCTGTT AGAACAAGCC CTTTTTCTTT-3’
G109P 1：5’-CATATCCTGG GAGGGCCATT ATATTCCTAC-3’
G109P 2：5’-CCCTCCCAGG ATATGGATAT CCATTAACTG-3’
所用引物由上海生工生物有限公司合成提供。
PCR扩增体系如下：
组分                                        体积(μL) 
5×PrimeSTARTMGC Buffer                      4 
dNTPs (各2.5 mM)                             1.6
正向引物 (10 μM)                              1
反向引物 (10 μM)                              1
模板DNA                                     1.6
PrimeSTARTM HS DNA Ploymerase（2.5U/μL）     0.2
ddH2O                                        10.6
上述PCR条件为：
98℃预变性10min，然后进行以下循环：98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸6.5min；25个循环；72℃延伸10min，4℃保温。
实施例2：梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）DPE酶突变体的表达纯化方法。
将测序验证后的突变质粒pet22b(+)-Y68I/G109P转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃，200rpm摇培过夜，后接入LB培养基37℃培养3-4h至OD值为0.6-0.8，降温至25℃，加入IPTG终浓度为0.8mM诱导8h。
发酵液于4℃、10000rpm离心20min，取菌体。加入15 mL Binding Buffer（50 mM Na2HPO4，50 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，调节pH至7.4）充分重悬浮菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间1 s，停止时间2s，共计20 min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000 r/min离心30 min，所得即粗酶液。用微孔滤膜过滤，备用。
准备Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和介质填充层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入 Binding Buffer 平衡柱子环境，然后将得到的过膜粗酶液加入到柱子中，利用恒流泵向柱子加入Wash Buffer（50 mM Na2HPO4，50 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，50 mM 咪唑，调节pH至7.4） 洗涤杂蛋白，待基线平稳后，泵入Elution Buffer （50 mM Na2HPO4，50 mM NaH2PO4，500 mM NaCl，500 mM 咪唑，调节pH至7.4）洗脱目的蛋白。收集目的蛋白的洗脱液。将洗脱液放入处理后的透析袋中，采用平衡液透析过夜，得到纯化后的DPE的突变体酶。纯化后DPE的突变体酶Y68I/G109P达到电泳纯。纯化结果如图1所示。
实施例3：DPE酶在55℃下的热稳定性
1、DPE酶活测定方法：1 mL的反应体系中，加入700 μL用100 g/L D-果糖，200 μL稀释酶液，100 μL终浓度为1 mM的Co2+离子。55℃保温5 min，然后煮沸10 min以终止酶反应。
2、将纯化后的DPE酶液置于55℃水浴中保温，定期测定残余酶活。绘制残余酶活与时间的曲线（如图2），根据曲线得到该温度下DPE酶的半衰期。
表1. DPE酶在55℃热稳定性
  t1/2(55℃) (min) t1/2(55℃)提高倍数
野生型DPE 42.9 1
Y68I/G109P 78.3 1.8
通过测定发现，突变体酶Y68I/G109P在55℃的半衰期有较大的提高，由42.9min提高到78.3min，是原来的1.8倍。
实施例4：DPE酶在55℃下的反应动力学常数测定
配制不同底物浓度的D-果糖（10-200 mM）溶液，在55℃、pH 7.0的条件下测定酶活，通过Lineweaver-Burk双倒数法作图，求得回归直线方程，其中直线与X轴的交点为-(Km)-1，与Y轴的交点为(Vm)-1，同时测定纯化后的酶蛋白浓度，以求得k cat 值。
表2. 酶促反应动力学常数K m及催化常数k cat
  K m  (mM) kcat（s-1） k cat/K m (s-1 mM-1)
野生菌DPE 54.45 56.10 1.031
Y68I/G109P 49.12 60.34 1.228
实施例5：D-阿洛酮糖生物转化曲线
利用酶反应器进行酶反应，测定D-阿洛酮糖的生物转化曲线。1L的反应体系中含有750g D-果糖，100mg DPE酶。55℃、pH 7.0的条件下反应，每隔一段时间取样测定D-阿洛酮糖的生成率，绘制D-阿洛酮糖生物转化曲线如图3所示。
<160> 4
 
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                  5                   10                   15
Ala Asp Tyr Lys Lys  Tyr Met Asp Lys Val  Ser Ala Leu Gly Phe
                 20                   25                   30
Asp Val Leu Glu Ile  Ser Cys Ala Ala Leu  Arg Asp Val Tyr Thr
                 35                   40                   45
Thr Lys Glu Gln Leu  Ile Glu Leu Arg Glu  Tyr Ala Lys Glu Lys
                 50                   55                   60
Gly Leu Val Leu Thr  Ala Gly Tyr Gly Pro  Thr Lys Ala Glu Asn
                 65                   70                   75
Leu Cys Ser Glu Asp  Pro Glu Ala Val Arg  Arg Ala Met Thr Phe
                 80                   85                   90
Phe Lys Asp Leu Leu  Pro Lys Leu Gln Leu  Met Asp Ile His Ile
                 95                  100                  105
Leu Gly Gly Gly Leu  Tyr Ser Tyr Trp Pro  Val Asp Phe Thr Ile
                110                  115                  120
Asn Asn Asp Lys Gln  Gly Asp Arg Ala Arg  Ala Val Arg Asn Leu
                125                  130                  135
Arg Glu Leu Ser Lys  Thr Ala Glu Glu Cys  Asp Val Val Leu Gly
                140                  145                  150
Met Glu Val Leu Asn  Arg Tyr Glu Gly Tyr  Ile Leu Asn Thr Cys
                155                  160                  165
Glu Glu Ala Ile Asp  Phe Val Asp Glu Ile  Gly Ser Ser His Val
                170                  175                  180
Lys Ile Met Leu Asp  Thr Phe His Met Asn  Ile Glu Glu Thr Asn
                185                  190                  195
Met Ala Asp Ala Ile  Arg Lys Ala Gly Asp  Arg Leu Gly His Leu
                200                  205                  210
His Leu Gly Glu Gln  Asn Arg Leu Val Pro  Gly Lys Gly Ser Leu
                215                  220                  225
Pro Trp Ala Glu Ile  Gly Gln Ala Leu Arg  Asp Ile Asn Tyr Gln
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Gly Ala Ala Val Met  Glu Pro Phe Val Met  Gln Gly Gly Thr Ile
                245                  250                  255
Gly Ser Glu Ile Lys  Val Trp Arg Asp Met  Val Pro Asp Leu Ser
                260                  265                  270
Glu Glu Ala Leu Asp  Arg Asp Ala Lys Gly  Ala Leu Glu Phe Cys
                275                  280                  285
Arg His Val Phe Gly  Ile
                   290    291
 
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50                   55                   60    
Gly Leu Val Leu Thr  Ala Gly Ile Gly Pro  Thr Lys Ala Glu Asn
                 65                   70                   75
Leu Cys Ser Glu Asp  Pro Glu Ala Val Arg  Arg Ala Met Thr Phe
                 80                   85                   90
Phe Lys Asp Leu Leu  Pro Lys Leu Gln Leu  Met Asp Ile His Ile
                 95                  100                  105
Leu Gly Gly Pro Leu  Tyr Ser Tyr Trp Pro  Val Asp Phe Thr Ile
110                  115                  120    
Asn Asn Asp Lys Gln  Gly Asp Arg Ala Arg  Ala Val Arg Asn Leu
                125                  130                  135
Arg Glu Leu Ser Lys  Thr Ala Glu Glu Cys  Asp Val Val Leu Gly
                140                  145                  150
Met Glu Val Leu Asn  Arg Tyr Glu Gly Tyr  Ile Leu Asn Thr Cys
                155                  160                  165
Glu Glu Ala Ile Asp  Phe Val Asp Glu Ile  Gly Ser Ser His Val
170                  175                  180    
Lys Ile Met Leu Asp  Thr Phe His Met Asn  Ile Glu Glu Thr Asn
                185                  190                  195
Met Ala Asp Ala Ile  Arg Lys Ala Gly Asp  Arg Leu Gly His Leu
                200                  205                  210
His Leu Gly Glu Gln  Asn Arg Leu Val Pro  Gly Lys Gly Ser Leu
                215                  220                  225
Pro Trp Ala Glu Ile  Gly Gln Ala Leu Arg  Asp Ile Asn Tyr Gln
230                  235                  240   
Gly Ala Ala Val Met  Glu Pro Phe Val Met  Gln Gly Gly Thr Ile
                245                  250                  255
Gly Ser Glu Ile Lys  Val Trp Arg Asp Met  Val Pro Asp Leu Ser
                260                  265                  270
Glu Glu Ala Leu Asp  Arg Asp Ala Lys Gly  Ala Leu Glu Phe Cys
                275                  280                  285
Arg His Val Phe Gly  Ile
               290 291
 
Y68I 1：5’-GTTCTAACAG CTGGTATTGG ACCTACTAAA-3’
Y68I 2：5’-ACCAGCTGTT AGAACAAGCC CTTTTTCTTT-3’
 
G109P 1：5’-CATATCCTGG GAGGGCCATT ATATTCCTAC-3’
G109P 2：5’-CCCTCCCAGG ATATGGATAT CCATTAACTG-3’

Claims (5)

1.一种功能改善的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶DPE的突变体酶Y68I/G109P，其特征在于将来源于梭状芽孢杆菌（Clostridium bolteae）ATCC BAA-613的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶进行突变所得的突变体酶；将原来DPE基因中的68位的酪氨酸Tyr和109位的甘氨酸Gly分别替换为异亮氨酸Ile和脯氨酸Pro，命名为Y68I/G109P。
2.根据权利要求1所述的DPE的突变体酶Y68I/G109P，其特征在于与野生型DPE酶相比，所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的热稳定性获得提高，以在55℃下的半衰期t50来表示热稳定性，DPE的突变体酶Y68I/G109P的半衰期为78.3min，是野生型DPE酶的1.8倍；所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的催化活性获得提高，与野生菌相比，其K m 值降低，k cat/K m得到提高；
Figure 2014100018433100001DEST_PATH_IMAGE002
。
3.一种重组表达质粒，其特征在于其中含有权利要求1所述DPE的突变体酶Y68I/G109P基因。
4.一种表达宿主，其特征在于其被权利要求3所述的重组表达质粒转化。
5.权利要求1所述DPE的突变体酶Y68I/G109P的应用，其特征在于在化学、食品和制药领域中的应用。
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