CN103243078B

CN103243078B - 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶a热稳定性的方法

Info

Publication number: CN103243078B
Application number: CN201310208383.7A
Authority: CN
Inventors: 黄和; 张洋; 江凌; 胡燚; 李晓彤; 张红漫
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2033-05-29
Also published as: CN103243078A

Abstract

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。本发明以枯草芽孢杆菌脂肪A为研究对象，首先筛选突变热点区域；再确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点；结合上述两步理性分析，筛选得到的氨基酸位点突变成天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸四种氨基酸残基的任意一种，并以该氨基酸为中心，在4？范围内寻找上述4种氨基酸中带相反电荷的氨基酸残基，从而确定突变位点及突变残基；基于对酶结构与功能关系的认知，再解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构的作用机制；最终，通过枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的热稳定性实验，验证热稳定性改造的热点残基。

Description

一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。

背景技术

酶是一类非常重要的蛋白质，能够在生物体内温和的条件下催化多样的化学反应。目前，脂肪酶作为一类重要的生物催化剂被广泛应用于工业生产。枯草芽孢杆菌脂肪酶A是最小的脂肪酶(19kDa)，并且缺乏大多数脂肪酶特有的盖子结构，因而没有“界面效应”。枯草芽孢杆菌脂肪酶A属于“真酯酶”亚家族I.4，在中性或偏碱性的条件下具有良好的稳定性。但是亚家族I.4脂肪酶对温度极其敏感。枯草芽孢杆菌脂肪酶A的最适合温度为35℃，温度超过40℃时，其酶活急剧下降。

热稳定性是评价工业生物催化剂的一个重要指标，工业上提高反应温度，可以提高转化率、底物可溶性、降低微生物污染的可能性等，因而提高酶的耐温性是酶工业化亟待解决的问题之一。虽然目前已经有大量的关于酶热稳定性改造研究的报道，但是由于多数实验方案集中于定向进化高通量筛选与高性能计算机筛选。前者虽然不需要了解蛋白质结构及其功能的关系，但是高通量筛选方法常常伴随筛选工作量大、过程复杂等不足；后者对计算机运算能力要求严格，往往需要价格昂贵的高性能服务器的支持。

发明内容

本发明的技术目的是针对现有技术的不足，提出一种高效的计算机辅助筛选提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。

如图1所示，本发明的技术目的可通过如下技术方案实现：

一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A（Bacillus subtilis lipase A，PDB：1I6W）热稳定性的方法，包括如下步骤：

1)预测枯草芽孢杆菌脂肪酶A氨基酸突变的热点区域；

2)确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点；

3)结合步骤1)与2)分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点；

4)基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子模拟技术解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪脂肪酶A蛋白结构的作用机制；

5)构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株，并验证突变株的热稳定性，得到热稳定性提高后的枯草芽孢杆菌脂肪酶A。

具体的，步骤1)所述的预测枯草芽孢杆菌脂肪酶A氨基酸突变的热点区域的方法为：利用HotSpot Wizard在线服务器，对超过50种枯草芽孢杆菌脂肪酶家族蛋白一级序列进行静态分析比对，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A每一个残基可突变率及突变结果，筛选突变率高的氨基酸残基位点，同时排除催化活性中心及底物通道周围的功能氨基酸，从而预测氨基酸突变的热点区域。

步骤2)所述的蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点的确定方法是：利用Pymol可视化软件与B-因子(B-factor)来得；利用分子动力学方法，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF(Root Mean Square Fluctuation)，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A柔性较大的区域，并结合Pymol可视化软件，确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点。

步骤3)的分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点方法是结合步骤1)与2)分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点：首先在于步骤2)后，得到的氨基酸位点突变可以选择性突变为成天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)四种氨基酸残基的任意一种；再利用Pymol可视化软件，以该氨基酸为中心，在范围内寻找上述4种氨基酸中带相反电荷的氨基酸残基，从而确定突变位点及突变残基为：Gln60Lys、Gln60Asp、Gln60Glu、Gly111Asp、Ser167Asp、Asn174Glu、Gly175Lys。

步骤4)所述的基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子模拟技术解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪脂肪酶A蛋白结构的作用机制的方法为：所有的模拟和分析都用GROMACS4.5.4进行，力场为GROMOS9643a1，温度为500K，pH=7.0；体系采用周期性立方体盒子，枯草芽孢杆菌脂肪酶A的周围填充水分子1.0nm，加入CL离子中和体系电荷，溶剂模型采用显式模型SPC；模拟首先进行5000步的最速下降法能量最小化(Steepest Descent)；然后进行约束优化，约束枯草芽孢杆菌脂肪酶A，采用压力(Parrinello-Rahman)与温度(V-rescale)，进行100ps的平衡模拟；长程静电相互作用采用PME(ParticleMeshEwald)法，短程作用力的阀值(rlist)为1.0nm、范德华(vdW)相互作用的截断值(rvdw)为1.0nm，库仑相互作用的截断值(rcoμLomb)为1.0nm；最后进行分子动力学模拟，没有约束，模拟时间为7ns，时间步长为2fs；体系中各原子的坐标每1ps收集1次；通过分析均方根偏差RMSD(Root Mean SquareDeviation)、均方根涨落RMSF(Root Mean Square Fluctuation)、回转半径Rg(Radius of Gyration)、溶液可及表面积SAS(Solvent Accessible Surface)、二级结构含量(The content of secondarystructure)、氢键(hydrogen bond)、盐键(salt bond)参数，来解析突变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定的贡献，确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的重要氨基酸位点是Asn174Glu。

步骤5）所述的分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的方法是采用全质粒扩增的方式进行突变：设计引物，引物上分别Asn174Glu，用primSTAR对全质粒进行扩增，突变质粒分别转入DH5α，涂布LB平板，转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中；过夜培养，提取质粒，并转入BL21(DE3)，涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌BL21-pET22b-Lip-A。

其次，验证枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的热稳定性：将突变菌接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，IPTG诱导产酶，离心收集细胞，破碎，上清液用Ni柱纯化。将原始菌与突变株的发酵液在40℃下，保存10min，测定残余活力。

测定酶活：两个空白，两个样品，240μL底物溶液，10μL酶液反应10min，波长405下测定酶活，结果证明本发明得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株产生的枯草芽孢杆菌脂肪酶A在高温下酶活得到明显提高。

本发明的有益效果在于：

本发明以枯草芽孢杆菌脂肪A(PDB:1I6W)为研究对象，首先利用HotSpot Wizard在线服务器来虚拟筛选突变热点区域；再利用Pymol可视化软件与B-因子(B-factor)，来确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点；结合上述两步理性分析，筛选得到的氨基酸位点突变成天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)四种氨基酸残基的任意一种，并利用Pymol可视化软件，以该氨基酸为中心，在4范围内寻找上述4种氨基酸中带相反电荷的氨基酸残基，从而确定突变位点及突变残基；基于对酶结构与功能关系的认知，再通过分子模拟技术解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪脂肪酶A蛋白结构的作用机制；最终，通过枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的热稳定性实验，来验证热稳定改造的热点残基，最终实现了枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性的显著提高。通过Hotspot Wizard与理性分析结合，快速筛选出对蛋白结构起到稳定作用的残基，克服了传统方法定向进化等方法高通量筛选及高性能计算机筛选巨大运算量的缺点，方法简单快捷，是一种高效的提高脂肪酶热稳定性方法。

附图说明

图1本发明枯草芽孢杆菌脂肪酶A筛选热稳定点示意图。

图2本发明中Lip-A及Lip-A^N174E突变体的Cα-RMSD随时间演变图。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明本发明的步骤1）的预测枯草芽孢杆菌脂肪酶A氨基酸突变的热点区域的方法。

以枯草芽孢杆菌脂肪酶A（Bacillus subtilis lipase A，PDB：1I6W）为研究目标，利用HotSpotWizard在线服务器，虚拟筛选突变热点区域，对超过50种枯草芽孢杆菌脂肪酶家族蛋白一级序列进行静态分析比对，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A每一个残基可突变率及突变结果，筛选突变率高的氨基酸残基位点，同时排除催化活性中心及底物通道周围的功能氨基酸，从而预测氨基酸突变的热点区域。

该轮筛选热稳定点以突变率为9的残基进行。如第一轮以突变率为9的残基不能筛选合理突变点，进而第二轮可以研究突变率为7或者8的残基。

最终，本轮筛选的结果是：Ala20、Tyr25、Val27、Ser29、Ser32、Tyr49、Asn50、Val50、Val54、Phe58、Gln60、Ala97、Gly111、Pro118、Gln150、Asn174、Gly175、Gly176。

实施例2

本实施例说明本发明的步骤2）的确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点的方法。

利用Pymol可视化软件与B-因子(B-factor)来确定蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点。

利用PyMOl可视化确定位于蛋白表面氨基酸过程：

PyMOL>load 1I6W.pdb(打开枯草芽孢杆菌脂肪酶A三维结构)；

PyMOL>show surface(蛋白以表面形式表示出来)；

PyMOL>color white(蛋白表面以白色显示)；

PyMOL>select3,resi3(3代表第三位残基，后面残基显示以此方式类推)；

PyMOL>color red,3(将第三位氨基酸以红色表示，判断是否位于蛋白表面)；

PyMOL>color white,3(将第三位氨基酸表位白色)。

重复上述操作，继续判断下一位氨基酸，得到位于蛋白表面的氨基酸：His3、Asn4、Gly13、Ala15、Ser16、Phe17、Asn18、Ala20、Gly21、Lys23、Ser24、Tyr25、Val27、Ser28、Gln29、Gly30、Ser32、Arg33、Asp34、Lys35、Tyr37、Ala38、Asp40、phe41、Trp42、Asp43、lys44、Thr45、Thr47、Asn48、Tyr49、Asn50、Pro53、Val54、Ser56、Arg57、Phe58、Gln60、Lys61、Leu63、Asp64、Glu65、Thr66、Gly67、Ala68、Lys69、Lys70、His76、Ser77、Met78、Tyr85、Ile87、Lys88、Asn89、Leu90、Asp91、Gly93、Asn94、Lys95、Asn98、Arg107、Leu108、Thr109、Thr110、Gly111、Lys112、Leu114、Pro115、Gly116、Thr117、Asp118、Pro119、Asn120、Gln121、Lys122、Leu124、Tyr129、Ser131、Ala132、Asp133、Met134、Ile135、Val136、Met137、Asn138、Tyr139、Leu140、Arg142、Asp144、Gly145、Ala146、Arg147、Asn148、Val149、Gln150、Ile151、His152、Gly153、Val154、Gly155、HiS156、Ile157、Gly158、Tyr161、Ser162、Ser163、Gln164、Asn166、Leu168、Lys170、Glu171、Asn174、Gly175、Gly176、Gly177、Gln178、Asn179、Thr180、Asn181。

利用分子动力学方法，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A的均方根涨落RMSF(Root Mean SquareFluctuation)，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A位于柔性较大的区域的残基。

通过上述步骤结合，确定以下残基：Asn4、Gly13、Ala15、Ser16、Val27、Ser28、Gln29、Gly30、Ser32、Ala38、Phe41、Trp42、Thr45、Thr47、Asn48、Gln60、Thr66、Gly67、Ala68、Met78、Asn89、Leu90、Gly93、Asn94、Asn98、Thr109、Thr110、Gly111、Leu114、Pro115、Gly116、Thr117、Pro119、Asn120、Gln121、Leu124、Ala132、、Met134、Gly145、Ala146、Gln150、Ile151、Gly153、Val154、Gly155、Tyr161、Ser162、Ser163、Ser167、Asn174、Gly175、Gly176、Gly177、Gln178、Asn179、Thr180、Asn181位于蛋白质表面且RMSF值较大。

实施例3

本实施例说明结合实施例1与实施例2获得结果，分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点的方法。

结合实施例1与2获得结果，确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点，若突变成天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)四种氨基酸残基的任意一种，可以使该酶热稳定性提高。

利用Pymol可视化软件，以该氨基酸为中心，在4范围内寻找上述4种氨基酸中带相反电荷的氨基酸残基过程。

PyMOL>select60,resi60(选中可以突变的氨基酸)；

PyMOL>select near60,60expand4（选中4范围的残基，确定是否与此带相反电荷的残基）。

通过上述分析，最终确定了表1的以下高突变率残基及结果，可能对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性起到重要作用。

表1枯草芽孢杆菌脂肪酶A高突变率残基及突变结果

突变位点	突变率	突变结果
			ln60	9	6×D、1×E、1×N
ly111	9	1×D
			er167	9	1×D
sn174	9	1×E
			ly175	9	1×E

实施例4

本实施例说明基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子模拟技术解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪脂肪酶A蛋白结构的作用机制的方法。

利用在线服务器SWISS-Model同源建模构建Gln60Lys、Gln60Asp、Gln60Glu、Gly111Asp、Ser167Asp、Asn174Glu、Gly175Lys突变体，并采用Verify_3D对突变体模型进行评估与优化，获得突变体准确的空间构象。

Lip-A及突变体的模拟和分析都用GROMACS4.5.4软件包进行。主要包括以下几个步骤：

第一步将利用pdb2gmx命令添加所有缺失的氢原子，PDB文件转换成相应的gro、itp、top文件。对碱性氨基酸His、Lys、Arg及酸性氨基酸Asp、Glu五种氨基酸质子化；并且选用GROMOS9643a1力场；溶剂模型采用显式模型SPC。该命令格式为：

pdb2gmx_mpi -f Asn174Glu500.pdb-o Asn174Glu500.gro -p Asn174Glu500.top-i.itp-waterspc-ignh-ss-ter-lys-asp-glu-his-arg-missing。

第二步利用editconf命令为模拟的蛋白分子建立周期性立方体盒子，并在蛋白周围添加1.0nm的水分子层。该命令格式为：

editconf_mpi-bt cubic-f Asn174Glu500.gro-o Asn174Glu500.gro-d1.0。

第三步利用genbox命令为第二步建立的盒子，填充水分子，输出包含分子文件及水盒子文件。同时更改top文件，使其含水分子。该命令格式为：

genbox_mpi -cp Asn174Glu500.gro -cs spc216.gro -o Asn174Glu500_b4em.pdb -pAsn174Glu500.top。

第四步利用grompp命令将第三步生成的gro、top及mdp文件结合，建立一个二进制文件tpr；并利用genion命令加入适当数目的CL离子中和体系电荷；此外，需要手动修改Asn174Glu500.top与Asn174Glu500.gro文件原子数目，与添加CL离子相匹配。该命令格式为：

grompp_mpi-f em.mdp-c Asn174Glu500_b4em.pdb-p Asn174Glu500.top-oAsn174Glu500_em.tpr；

genion_mpi-s Asn174Glu500_em.tpr-o Asn174Glu500_ion.pdb-pname CL-nn5-gAsn174Glu500_ion.log。

第五步利用grompp与mdrun对体系进行能量最小化。首先采用最速下降法能量最优化(Steepest Descent)方法，对体系进行5000步能量最优化。然后进行约束优化,约束蛋白，采用压力(Parrinello-Rahman)为1.0Bar与温度(V-rescale)为500K，进行100ps的平衡模拟。该命令格式为：

grompp_mpi-f em.mdp-c Asn174Glu500_ion.pdb-p Asn174Glu500.top-oAsn174Glu500_em.tpr；

mdrun_mpi-v-s Asn174Glu500_em.tpr-o Asn174Glu500_em.trr-c Asn174Glu500_b4pr.pdb-eem.edr-g em.log；

grompp_mpi-f pr.mdp-c Asn174Glu500_b4pr.pdb-p Asn174Glu500.top-o pr.tpr；

mdrun_mpi-s pr.tpr-o pr.trr-c Asn174Glu500_b4md.pdb-e pr.edr-gpr.log。

第六步进行分子动力学模拟。体系采用没有约束进行模拟,模拟时间为7ns,时间步长为2fs。体系中各原子的坐标每1ps收集1次。长程静电相互作用采用PME(Particle Mesh Ewald)法，短程作用力的阀值(rlist)为1.0nm，范德华(vdW)相互作用的截断值(rvdw)为1.0nm,库仑相互作用的截断值(rcoμLomb)为1.0nm。该命令格式为：

grompp_mpi-f md.mdp-c Asn174Glu500_b4md.pdb-p Asn174Glu500.top-omd.tpr；

mdrun_mpi-s md.tpr-o md.trr-c Asn174Glu500_md.pdb-e md.edr-gmd.log。

经分子模拟动力学验证，通过分析Lip-A与突变体Lip-A^N174E的动力学数据（均方根偏差RMSD（图2）及二级结构(α、β)百分含量（表2）），证实Asn174Glu突变点可能对枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性起到作用。

表2Lip-A及Lip-A^N174E突变体的二级结构百分含量

实施例5

本实施例说明构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株（Asn174Glu），并验证突变株的热稳定性，得到热稳定性提高后的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的方法。

本发明人是通过枯草芽孢杆菌168菌株（Bacillus subtilis str.168）的基因序列，GenBank登录号为AL009126.3设计引物，通过PCR得到脂肪酶A基因。所采用的实验方法，包括众所周知的聚合酶链式反应（PCR）技术；DNA的提取、酶切、连接等DNA分子操作技术，以枯草芽孢杆菌168菌株总DNA为模板，扩增出脂肪酶A的DNA序列，把这一段DNA序列连接到表达载体上如pET-22b等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定基因的功能和酶学特性。

1．枯草芽孢杆菌168菌株的培养

枯草芽孢杆菌168菌株（Bacillus subtilis str.168），从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买，接种于以下培养基（克/升）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl10，然后在37℃恒温摇床上振荡培养至混浊，离心收集菌体用于总DNA的提取。

用设计好的引物以枯草芽孢杆菌168菌株总DNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性2分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃2分钟；35个循环后72℃延伸10分钟。将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为629bp，与预期结果相符，然后将PCR纯化后连接到TAKARA的pMD20-T载体上送到测序公司进行测序分析。

2．枯草芽孢杆菌168菌株脂肪酶A的克隆

通过NCBI已报道序列，设计以下PCR引物：

引物1：5’-CCGCATATGGCTGAACACAATC-3’；

引物2：5’-CCCAAGCTTATTCGTATTCTGGC-3’。

上下游引物的5’端分别设计了的NdeⅠ和HindⅢ酶切位点用于连接到表达载体pET-22b，用设计好的引物以枯草芽孢杆菌168菌株总DNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性2分钟；94℃30秒，56℃30秒，72℃2分钟；35个循环后72℃延伸10分钟。将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为629bp，与预期结果相符，然后将PCR纯化后连接到TAKARA的pMD20-T载体上送到测序公司进行测序分析。然后利用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，与同样利用NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切的表达载体pET-22b进行连接，连接产物经转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选验证得到表达重组质粒pET-LipA。

把表达重组质粒pET-LipA转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株的感受态细胞中，挑取转化子于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃摇床中培养，当OD600达到0.8左右时，加入IPTG使其终浓度达到0.5mmol/L，继续培养6小时进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用1/10发酵液体积的磷酸盐缓冲液缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为枯草芽孢杆菌合成酶的粗酶液。

分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株，分子生物构建枯草芽孢杆菌脂肪A大肠杆菌工程菌BL21-pET22b-Lip-A。采用全质粒扩增的方式进行突变：

设计引物：

S链：ATGATTAAAGAAGGGCTGGAGGGCGGGGGCCAGAAT；

A链：ATTCTGGCCCCCGCCCTCCAGCCCTTCTTTAATCAT）。

引物上Asn174Glu，用primSTAR对全质粒进行扩增，PCR反应液：5*Prime STAR Buffer（Mg+plus）10μL，dNTP Mixture（各2.5mM）4μL，Prime1（10μM）1μL，Prime2（10μM）1μL，模版DNA<200ng，Prime STAR HS，DNA Polymerase（2.5U/μL）0.5μL，灭菌蒸馏水补充至50μL。

突变质粒分别转入DH5α，涂布LB平板，转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中；过夜培养，提取质粒，并转入BL21(DE3)，涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌。

验证突变株的热稳定性，将突变菌接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，IPTG诱导产酶，离心收集细胞，破碎，上清液用Ni柱纯化。将原始菌与突变株的发酵液在55℃下，分别保存5、20及60min后，测定残余活力。

测定蛋白含量，采用Bradford的方法，以牛血清蛋白作为标准蛋白绘制标准曲线。

测定酶活：两个空白，两个样品，240μL底物溶液，10μL酶液40℃条件下反应10min，波长405下测定酶活。突变株与原始株分别经过5、20及60min保温处理后，突变株(Lip-A^N174E)相对残余活力是原始菌株(Lip-A)的倍数的数据如表3。

表3突变株(Lip-A^N174E)相对残余活力是原始菌株(Lip-A)的倍数

Claims

1. 一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)预测枯草芽孢杆菌脂肪酶A氨基酸突变的热点区域；

2)确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点；

3)结合步骤1)与2)分析确定与热稳定性相关的氨基酸突变位点：首先在于步骤2)后，得到的氨基酸位点突变可以选择性突变为天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸四种氨基酸残基的任意一种；再利用Pymol可视化软件，以该氨基酸为中心，在4Å范围内寻找上述4种氨基酸中带相反电荷的氨基酸残基，从而确定突变位点及突变残基为：Gln60Lys、Gln60Asp、Gln60Glu、Gly111Asp、Ser167Asp、Asn174Glu、Gly175Lys；

4)基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子模拟技术解析离子键引入对稳定枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构的作用机制：所有的模拟和分析都用GROMACS 4.5.4进行，力场为GROMOS96 43a1，温度为500 K，pH=7.0；体系采用周期性立方体盒子，枯草芽孢杆菌脂肪酶A的周围填充水分子1.0 nm，加入Cl离子中和体系电荷，溶剂模型采用显式模型SPC；模拟首先进行5000步的最速下降法能量最小化；然后进行约束优化，约束枯草芽孢杆菌脂肪酶A，采用压力为1.0 Bar与温度为 500 K，进行100 ps的平衡模拟；长程静电相互作用采用PME法，短程作用力的阀值为1.0 nm、范德华相互作用的截断值为1.0 nm，库仑相互作用的截断值为1.0 nm；最后进行分子动力学模拟，没有约束，模拟时间为7 ns，时间步长为2 fs；体系中各原子的坐标每1 ps收集1次；通过分析均方根偏差RMSD、均方根涨落RMSF、回转半径Rg、溶液可及表面积SAS、二级结构含量、氢键、盐键参数，来解析突变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定的贡献，确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的重要氨基酸位点是Asn174Glu；

5)构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株，并验证突变株的热稳定性，得到热稳定性提高后的枯草芽孢杆菌脂肪酶A：采用全质粒扩增的方式进行突变：设计引物，引物上Asn174Glu，用prim STAR对全质粒进行扩增，突变质粒分别转入DH5α，涂布LB平板，转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中；过夜培养，提取质粒，并转入BL21，涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1）所述的预测枯草芽孢杆菌脂肪酶A氨基酸突变的热点区域的方法为：利用HotSpot Wizard在线服务器，对超过50种枯草芽孢杆菌脂肪酶家族蛋白一级序列进行静态分析比对，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A每一个残基可突变率及突变结果，筛选突变率高的氨基酸残基位点，同时排除催化活性中心及底物通道周围的功能氨基酸，从而预测氨基酸突变的热点区域。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）所述的蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点的确定方法是：利用Pymol可视化软件与B-因子来得；利用分子动力学方法，获得枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A柔性较大的区域，并结合Pymol可视化软件，确定位于蛋白质表面且柔性较大区域的氨基酸位点。