CN104745547B - 一种环氧化物水解酶突变体、工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环氧化物水解酶突变体、工程菌及其应用，所述环氧化物水解酶突变体是将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的第182位、第207位和/或第240位氨基酸进行单位点突变或多位点突变获得的；与野生型环氧化物水解酶相比，本发明提供的环氧化物水解酶突变体具有更高的催化活性和立体选择性，所述的环氧化物水解酶突变体尤其适合拆分外消旋环氧氯丙烷制备(S)‑环氧氯丙烷。

Description

一种环氧化物水解酶突变体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种环氧化物水解酶突变体及其编码基因，含有所述环氧化物水解酶突变体基因的重组表达载体和重组工程菌，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该环氧化物水解酶在对映选择性水解拆分外消旋环氧氯丙烷制备高光学活性的(S)-环氧氯丙烷中的应用。

(二)背景技术

环氧化物水解酶(EC 3.3.2.3)是一组功能相似的酶系，能够立体选择性催化环氧化合物生成光学活性的环氧化物和相应邻位二醇。作为一种水解酶它具有一般水解酶的特点如：1.反应不需要添加辅助因子。2.具有广泛的来源。3.在非水介质中仍能保留一定的活性。4.反应条件温和，无污染，符合“绿色化学”趋势。5.这些反应常常显示出化学、区域和立体对映选择性，能够对同类型广泛的底物进行作用。

环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，在哺乳动物、昆虫、微生物和植物中均有发现。哺乳动物环氧化物水解酶参与了体内有害异体物质的代谢，并有调控血压等功能；植物环氧化物水解酶能参与角质以及抗菌物质的合成；昆虫环氧化物水解酶具有分解代谢昆虫发育过程中重要的化合中间体保幼激素以及代谢植物释放的化学预防化合物的重要功能；而微生物是环氧化物水解酶的重要的来源。由于微生物种类的多样性、生长速度快、易于培养和产量高等优点，从微生物中筛选获得环氧化物水解酶是目前主要的途径。近年，已从多种微生物中发现了环氧化物水解酶，如Rhodococcus equi，Rhodococcus ruber，Mycoplanarubra，Bacillus megaterium,Diplodia gossipina，Streptomyces striana,Rhodotorulaglutinis,Bacillus subtilis,Sphingomonas echinoides，Rhodotorula araucariae，Rhodosporidium toruloides，Agrobacterium radiobacter，Mycobacter tuberculosis，Aspergillus niger，Caulobacter crescentus，Trichosporon loubierii，Sphingomonassp，Novosphingobium aromaticivorans，Saccharomyces cerevisiae等。其中部分环氧化物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母、耶氏酵母等)中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于不对称拆分外消旋环氧化物。

手性环氧氯丙烷在医药、农药、化工、材料等领域应用广泛。随着手性药物行业的发展，使得手性环氧氯丙烷作为一种重要医药中间体的地位更加突出。目前，合成手性环氧氯丙烷主要有化学法和生物法拆分两大类。生物法拆分法具有反应条件温和、环境友好的优点。(S)-ECH的生物合成方法主要有环氧化物水解酶的对映选择性拆分方法。Woo等人利用大肠杆菌表达了Novosphingobium aromaticivorans EH，将它应用于250mM环氧氯丙烷的拆分，获得了99％ee和17.3％收率的(S)-ECH。金火喜等人分离得到的Aspergillusniger菌株可用于催化拆分64mM外消旋环氧氯丙烷，获得98％ee和17.5％收率的(S)-环氧氯丙烷。单取代型环氧化物特别是环氧氯丙烷，由于其空间位阻极小，给手性识别带来困难，是现代环氧化物水解酶研究领域的一个难点。由于环氧氯丙烷的底物，目前已发现的环氧化物水解酶对其活性和选择性都很低。

从壤霉菌(Agromyces mediolanus)CCTCC M 2012299克隆得到的环氧化物水解酶AmEH可催化多种环氧化物对映选择性水解拆分制备高光学活性的手性环氧化物，该酶已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组过量表达(Process Biochem 2014,49:409-417；CN102978220A)。该酶能够优先催化(R)-ECH底物水解。但该重组酶对底物的对映选择性并不高，从而限制了它在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。通过已报道的环氧化物水解酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的预催化选择性和活性相关的氨基酸，通过定点突变技术提高环氧化物水解酶对外消旋环氧氯丙烷的催化活性和选择性，将具有较强的工业应用价值。

(三)发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对之前报道的环氧化物水解酶对环氧氯丙烷的催化选择性和活性，特别是催化选择性较低的问题，提供一种环氧化物水解酶突变体蛋白质及其编码基因，含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，将该环氧化物水解酶突变体蛋白质或表达该环氧化物水解酶突变体蛋白质的重组工程菌作为催化剂催化外消旋环氧氯丙烷进行水解拆分反应，制备光学纯(S)-环氧氯丙烷。与野生型环氧化物水解酶相比，本发明提供的环氧化物水解酶突变体蛋白质具有更高的催化底物选择性和活性。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：

本发明提供一种环氧化物水解酶突变体，所述环氧化物水解酶突变体是将SEQ IDNO.13所示氨基酸序列的第182位、第207位和/或第240位进行单位点突变或多位点突变获得的；所述单位点突变是将第182位的色氨酸突变为苯丙氨酸、第207位丝氨酸突变为缬氨酸或第240位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，具体优选为下列之一：

(1)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的第182位的色氨酸突变为苯丙氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；

(2)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的第207位的丝氨酸突变为缬氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示；

(3)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的第240位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示；

(4)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的第182位的色氨酸突变为苯丙氨酸，且第207位的丝氨酸突变为缬氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列为SEQ IDNO.10所示；

(5)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的第207位的丝氨酸突变为缬氨酸，且第240位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列为SEQ IDNO.11所示；

(6)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的第182位的色氨酸突变为苯丙氨酸，第207位的丝氨酸突变为缬氨酸，同时第240位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，氨基酸序列为SEQ IDNO.6所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示.

本发明使用定点饱和突变技术对环氧化物水解酶AmEH编码基因进行突变，连接表达载体后转化宿主大肠杆菌，诱导表达后再通过高通量筛选方法和气相手性检测方法将正突变检出，然后利用定点突变方法，叠加有益突变点，得到对映选性进一步提高的突变体。获得的突变体能催化(1mM～800mM)外消旋环氧氯丙烷拆分，制备高光学纯和收率的(S)-环氧氯丙烷。

具体方法如下：来源于Agromyces mediolanus CCTCC M 2012299(CN102978220A)的环氧化物水解酶(GenBank no.JX467176)由288氨基酸残基组成，已成功构建表达载体pET28-AmEH，功能正常的酶蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中实现过量表达(Process Biochem2014,49:409-417；)。然后经过同源建模和分子对接，根据最优构象选择潜在的可能影响酶活性或选择性的位点；或者对建模获得的模型进行HotSpot Wizard分析，识别其中的功能性氨基酸。设定定点饱和突变的位点，再设计并合成适当的引物，以所述的含亲本环氧化物水解酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增全长突变基因的质粒。通过将该含有全长突变的质粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导表达、筛选出具有高对映选择性环氧化物水解酶的阳性突变子。最后从阳性突变子中抽提出质粒DNA，进行DNA测序分析，以确定引物的突变。在本发明环氧化物水解酶的突变体的制备中，可以采用任何适当的载体。

本发明还提供一种所述环氧化物水解酶突变体的编码基因，具体的，所述基因为SEQ ID No.7-SEQ ID No.12所示核苷酸序列：SEQ ID NO.7(编码SEQ ID No.1所示突变体)，SEQ ID NO.8(编码SEQ ID No.2所示突变体)，SEQ ID NO.9(编码SEQ ID No.3所示突变体)，SEQ ID NO.10(编码SEQ ID No.4所示突变体)，SEQ ID NO.11(编码SEQ ID No.5所示突变体)，SEQ ID NO.12(编码SEQ ID No.6所示突变体)。

本发明还涉及一种含环氧化物水解酶突变体编码基因的重组质粒，所述重组质粒含有上述任一环氧化物水解酶突变体的编码基因序列。

本发明提供一种由所述重组质粒构建的重组基因工程菌，优选所述重组质粒是pET28a(+)；所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

本发明还涉及环氧化物水解酶突变体编码基因在制备重组环氧化物水解酶中的应用，所述应用为：构建含有所述环氧化物水解酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌)中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组环氧化物水解酶的菌体细胞，与野生型的环氧化物水解酶相比，具有更高的催化立体选择性和催化活性。

本发明还提供一种所述环氧化物水解酶突变体在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用，所述的应用为：以含环氧化物水解酶突变体基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以外消旋环氧氯丙烷为底物，以pH 8.0磷酸盐缓冲液为反应介质，在30℃、150r/min条件下反应，反应结束后，获得含(S)-环氧氯丙烷的混合液，将混合液分离纯化，获得(S)-环氧氯丙烷。

所述催化剂的用量以湿菌体重量计为20-100g/L缓冲液，所述底物初始浓度为100～800mmol/L缓冲液。

本发明所述催化剂按如下方法制备：将含环氧化物水解酶突变体基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，再以体积浓度1％接种量接种到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4～0.8，再向培养液加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，4℃、8000g离心10min，收集菌体细胞，即为湿菌体。

所述的环氧化物水解酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶或者纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的环氧化物水解酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞。

本发明的有益效果主要体现在：与野生型环氧化物水解酶相比，本发明提供的Agromyces mediolanus环氧化物水解酶突变体，对映选择性有大幅度的提高(E从12.9％提高到90.26％)，并且具有更高的催化活性(酶活最高提高了2.8倍)。本发明所获得的多个环氧化物水解酶突变体特别适用于催化外消旋环氧氯丙烷拆分制备(S)-环氧氯丙烷，具有较好的工业应用前景。

(四)附图说明：

图1是实施例2中环氧化物水解酶突变体表达并纯化结果的SDS-PAGE分析；其中泳道1为野生型环氧化物水解酶蛋白，泳道2-7分别为突变体蛋白W182F、S207V、N240D、W182F/S207V、S207V/N240D和W182F/S207V/N240D,泳道8为蛋白Marker。

图2是实施例5中环氧化物水解酶突变体全细胞催化外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷的反应进程(150mM)。

图3是实施例6中环氧化物水解酶突变体全细胞催化外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷的反应进程(300mM)。

图4是实施例7中环氧化物水解酶突变体全细胞催化外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷的反应进程(450mM)。

(五)具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：环氧化物水解酶突变体的制备

定点饱和突变和定点突变技术参考(Current Protocols in Protein Science2011,26.6.1-26.6.10；Anal.Biochem.2008,375:376-378)所述方案进行操作。首先设计含有突变点的突变引物，如表1所示。来源于Agromyces mediolanus CCTCC M 2012299的环氧化物水解酶(GenBank no.JX467176)由288氨基酸残基组成(氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示)，已成功构建表达载体pET28-AmEH，以质粒pET28a-AmEH为模板进行全质粒扩增。PCR体系为：5×PS Buffer 10μl，dNTP(2.5mM each)4μl，突变引物F和R各0.5μl，质粒pET28-AmEH0.5μl，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μl，补水至50μl。PCR条件为98℃预变性2min，27个循环：98℃10s，65℃10s，72℃7min，最后72℃10min。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μl，加入1μl Dpn Ⅰ，37℃酶切3h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，获得饱和突变体库。利用NBP高通量筛选并结合手性气相检测，筛选出的阳性克隆再经活力测定证实后从阳性克隆中抽提质粒，送上海桑尼生物技术有限公司进行测序。测序结果用DNAssist软件与野生型环氧化物水解酶基因序列进行比对，确认突变前后基因序列及相应的氨基酸序列的差异。

表1 环氧化物水解酶突变引物

实施例2：环氧化物水解酶亲本和突变体的诱导表达和纯化

1.环氧化物水解酶亲本和突变体的表达

将实施例1出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-AmEH及实施例1中的突变体菌株分别接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，再以1％接种量(v/v)接种到新鲜的含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，4℃、8000g离心10min，收集含有重组环氧化物水解酶的菌体细胞，可用于酶的纯化和生物催化制备(S)-ECH。

2.环氧化物水解酶亲本和突变体的纯化

环氧化物水解酶菌体细胞经超声破碎15min后(冰浴，400W，破2s，停1s)，离心，取上清，使用Ni亲和柱纯化环氧化物水解酶亲本和突变体蛋白，具体方法如下：

(1)用20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液(含500mM NaCl和20mM咪唑)平衡Ni柱；

(2)将粗酶液(即超声离心后的上清)以1.5ml/min的流速通过Ni柱，使目的酶挂载到Ni柱上。

(3)用20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液(含500mM NaCl和200mM咪唑)洗脱目的酶蛋白。

(4)用20mM pH 8.0磷酸盐缓冲液(含500mM NaCl和20mM咪唑)平衡Ni柱，备用。

(5)用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测步骤3收集到的蛋白样品。取20μl样品加入20μl 2×SDS样缓冲液进行处理，上样量均为8μl。结果表明通过上述方法获得的突变体能够纯化得到高纯度蛋白，分子量大小在43kDa，蛋白电泳结果如图1所示。

实施例3环氧化物水解酶突变体的活性、催化常数和立体选择性测定

利用气相色谱对反应后混合物中的底物和产物进行分离，测定反应前后反应体系中底物浓度的减少，确定环氧化物水解酶的催化活性。

气相色谱GC-14C色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。

酶活单位(U)定义为：在30℃、pH 8.0条件下，在1min内催化1μmol环氧氯丙烷所需要的酶量定义为1U。比酶活定义为每毫克蛋白所具有的活力单位数。

环氧水解酶活性测定方法为：总反应体系为0.4ml，其中含50mM底物，pH 8.0、200mM磷酸盐缓冲液，加入实施例2制备的酶液50微升(相当于纯化前含湿菌体2.46mg/ml)，在2ml EP管中，30℃，500rpm条件下反应，加入酶液反应2min后，加入1ml乙酸乙酯萃取，取有机相，加入无水硫酸钠干燥，样品用于气相检测。酶活测定结果见表2。为了测定突变体对环氧氯丙烷催化对映选择性提高的原因，我们测定了野生型和突变体对单一构型底物(R)-环氧氯丙烷和(S)-环氧氯丙烷的动力学参数。采用上述测定酶活的方法，我们测定了突变体和野生型环氧化物水解酶在不同底物浓度下的活性，利用Origin 8.0软件拟合米氏方程，从而得到他们的动力学参数。并计算其对映选择率。动力学常数见表3，对映体选择率见表2。

表2 环氧化物水解酶亲本和突变体对环氧氯丙烷的比活力和对映选择率。

表3 环氧化物水解酶亲本和突变体的稳态动力学参数

实施例4环氧化物水解酶突变体(S207V/N240D)在水解拆分外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷中的应用

转化体系组成及转化操作如下：在10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中加入1g湿菌体(实施例2制备，菌体干重为0.19g)和750mmol/L缓冲液的外消旋环氧氯丙烷构成反应体系，在30℃、150r/min条件下摇床反应，用手性气相分析(同实施例3)监测反应过程中底物ee值的变化，随着反应的进行，R-环氧氯丙烷被完全水解，最终(S)-环氧氯丙烷的ee大于99％，收率为22.8％。

实施例5环氧化物水解酶突变体(W182F/S207V/N240D)在水解拆分150mM外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷中的应用

转化体系组成及转化操作如下：在10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中加入0.4g湿菌体(实施例2制备，菌体干重为0.07g)和终浓度150mmol/L缓冲液的外消旋环氧氯丙烷构成反应体系，在30℃、150r/min条件下摇床反应，用手性气相分析(同例3)监测反应过程中底物ee值的变化，反应进程曲线如图2所示。该图显示：随着反应的进行，R-环氧氯丙烷被完全水解，而S-环氧氯丙烷基本未被水解。最终(S)-环氧氯丙烷的ee大于99％，收率为44.1％。

实施例6环氧化物水解酶突变体(W182F/S207V/N240D)在水解拆分300mM外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷中的应用

转化体系组成及转化操作如下：在10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中加入1g湿菌体(实施例2制备，菌体干重为0.19g)和终浓度300mmol/L缓冲液的外消旋环氧氯丙烷构成反应体系，在30℃、150r/min条件下摇床反应，用手性气相分析(同例3)监测反应过程中底物ee值的变化，反应进程曲线如图3所示。该图显示：随着反应的进行，R-环氧氯丙烷被完全水解，而S-环氧氯丙烷基本未被水解。最终(S)-环氧氯丙烷的ee大于99％，收率为43.7％。

实施例7环氧化物水解酶突变体(W182F/S207V/N240D)在水解拆分450mM外消旋环氧氯丙烷制备(S)-环氧氯丙烷中的应用

转化体系组成及转化操作如下：在10mL磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中加入1g湿菌体(实施例2制备，菌体干重为0.19g)和终浓度450mmol/L缓冲液的外消旋环氧氯丙烷构成反应体系，在30℃、150r/min条件下摇床反应，用手性气相分析(同例3)监测反应过程中底物ee值的变化，反应进程曲线如图4所示。该图显示：随着反应的进行，R-环氧氯丙烷被完全水解，而S-环氧氯丙烷基本未被水解。最终(S)-环氧氯丙烷的ee大于99％，收率为40.5％。

Claims (9)

1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于所述环氧化物水解酶突变体为下列之一：

(1)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列第182位的色氨酸突变为苯丙氨酸；

(2)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列第207位的丝氨酸突变为缬氨酸；

(3)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列第240位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；

(4)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列第182位的色氨酸突变为苯丙氨酸，且将第207位的丝氨酸突变为缬氨酸；

(5)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列第207位的丝氨酸突变为缬氨酸，同时将第240位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；

(6)将SEQ ID NO.13所示氨基酸序列第182位的色氨酸突变为苯丙氨酸，第207位的丝氨酸突变为缬氨酸，且第240位的天冬酰胺突变为天冬氨酸。

2.一种编码权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因。

3.一种含有权利要求2所述基因的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体构建的重组基因工程菌。

5.一种权利要求2所述环氧化物水解酶突变体编码基因在制备重组环氧化物水解酶中的应用，其特征在于所述应用为：构建含有所述环氧化物水解酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组环氧化物水解酶的菌体细胞。

6.一种权利要求1所述环氧化物水解酶突变体在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含环氧化物水解酶突变体基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以外消旋环氧氯丙烷为底物，以pH 8.0磷酸盐缓冲液为反应介质，在30℃、150r/min条件下反应，反应结束后，获得含(S)-环氧氯丙烷的混合液，将混合液分离纯化，获得(S)-环氧氯丙烷。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂的用量以湿菌体重量计为20-100g/L缓冲液，所述底物初始浓度为100～800mmol/L缓冲液。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含环氧化物水解酶突变体基因的重组基因工程菌接种到含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，再以体积浓度1％接种量接种到新鲜的含终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.4～0.8，再向培养液加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，4℃、8000g离心10min，收集菌体细胞，即为湿菌体。