CN109593749B - 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用 - Google Patents

卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种来源于放射形土壤杆菌的卤醇脱卤酶突变体，以及其在制备(S)‑环氧氯丙烷中的应用。所述突变的位点为下列之一：(1)第81位；(2)第86位；(3)第94位。本发明通过卤醇脱卤酶进行改造获得多株突变株，针对1,3‑二氯‑2‑丙醇转化制备(S)‑ECH具有极高的立体选择性。在磷酸盐缓冲体系中，能够催化制备光学纯度(e.e.值)大于99％的(S)‑ECH。该技术具有酶立体选择性优异，反应体系简单，操作过程易于控制，生产成本低，产品光学纯度高等突出优势，具有良好的工业应用价值。

Description

卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种来源于放射农杆菌的卤醇脱卤酶突变体，以及其在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。
(二)背景技术
手性环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的三碳合成子，在手性药物的制备中有着重要的应用；其中降血脂类药物阿托伐他汀、芳氧丙胺醇类β-肾上腺阻断剂阿替洛尔、减肥药左旋肉碱、治疗心绞痛药物美托洛尔以及抗生素海藻唑啉等多种药物均需要(S)-环氧氯丙烷作为手性中间体参与来完成手性药物的制备，(S)-ECH有着广泛的市场需求。传统的(S)-ECH化学合成工艺从外消旋环氧氯丙烷出发，通过Salan试剂催化水解外消旋环氧氯丙烷，可以得到e.e.值为99％，但是，(S)-ECH的产率为43％，而且，其催化剂成本极高，环境不友好。Xue等通过对来自Agrobacterium radiobacter AD1的HheC进行改造获得突变株HheCP175S/W249P其催化1,3-DCP生成(S)-ECH时，转化率达93.7％，e.e.值为95.3％，但随着反应的进行，e.e.急速下降至零。Zhang等通过对HheC突变株进行固定化获得固定化酶，其在有机相中催化1,3-DCP生成(S)-ECH时，e.e.值达98％，转化率达52.34％。
随着手性药物行业的发展，使得手性环氧氯丙烷作为一种市场前景广阔的手性药物中间体。卤醇脱卤酶法以其合成的步骤短，收率高，环境污染小，理论收率高，成本低等明显优势被广泛关注。受限于卤醇脱卤酶的立体选择性与反应体系障碍，当前的卤醇脱卤酶法制备的手性ECH产品尚不能达到光学纯，不能满足工业化应用的要求。
(三)发明内容
本发明目的即是提供一种来源于放射形土壤杆菌的卤醇脱卤酶突变体及以该突变体制备高产率和e.e.值的(S)-ECH应用，本发明通过对其卤素结合域处蛋白进行改造，获得了能够催化1,3-DCP获得高光学纯和高产的(S)-ECH的突变体。
本发明采用的技术方案是：
一种来源于放射形土壤杆菌的卤醇脱卤酶突变体，由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸经定点饱和突变而来，所述突变的位点为下列之一：(1)第81位；(2)第86位；(3)第94位。
优选的，所述突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第81位异亮氨酸突变为色氨酸(即突变体I81W)、丝氨酸(即突变体I81S)、天冬酰胺(即突变体I81N)、谷氨酰胺(即突变体I81Q)或组氨酸(即突变体I81H)而得。
或者，所述突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第86位苯丙氨酸突变为天冬酰胺(F86N)或天冬氨酸(F86D)而得。
或者，所述突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第94位缬氨酸突变为甘氨酸(即突变体V94G)、色氨酸(即突变体V94W)、甲硫氨酸(即突变体V94M)、精氨酸(即突变体V94R)或天冬酰胺(即突变体V94N)而得。
更为优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4(突变体I81W)、SEQ ID NO.6(突变体F86N)或SEQ ID NO.8(突变体V94R)所示。
本发明还涉及所述的卤醇脱卤酶突变体在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用(涉及反应参见图1)。
具体的，所述应用为：以含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以pH 8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，在600rpm、37℃条件下进行反应，反应结束后，将反应分离纯化，获得(S)-手性环氧氯丙烷。
所述卤醇脱卤酶突变体编码基因序列如SEQ ID NO.3(编码突变体I81W)、SEQ IDNO.5(编码突变体F86N)或SEQ ID NO.7(编码突变体V94R)所示。
催化剂的用量以湿菌体重量计为5～100g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为5～200mM。
所述湿菌体可按如下方法制备：将含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液；再以体积浓度1％的接种量将种子液接种到新鲜的含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为0.4-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体。
所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体用200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液重悬(wt/vol＝1:10)，将重悬后的菌液在50％的功率下破碎30min。
所述湿菌体超声破碎的条件为：将湿菌体用200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液重悬(wt/vol＝1:10)，将重悬后的菌液在50％的功率下破碎30min。
本发明以含有卤醇脱卤酶基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示)的表达载体为模板，利用定点饱和突变以及迭代饱和突变技术进行突变，扩增产物转化宿主细胞，构建突变库。将突变体诱导表达后进行筛选，从而获得了高e.e.值，且保持(S)-ECH高稳定性的卤醇脱卤酶突变体，这些突变体能以1,3-二氯-2-丙醇为底物，高效生物催化生产e.e.值大于99％的(S)-ECH并且反映至24h后与(S)-ECH仍保持较高浓度。
本发明获得了多种卤醇脱卤酶突变体，以说明书所附的序列2为参考序列，优选来自第81位和第86位和第94位的两个突变和四个突变体和五个突变体，并且以1,3-二氯-2-丙醇为底物其具有e.e.值高达100％。优选的是，所述亲本序列中的第81位的异亮氨酸(Ile)突变成色氨酸(Trp)和所述亲本序列的第86位的苯丙氨酸(Phe)突变成天冬酰胺(Asn)和第94位缬氨酸(Val)突变成精氨酸(Arg)。
本发明所述的卤醇脱卤酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是经部分纯化的和完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的卤醇脱卤酶突变体制成固定化酶和者固定化细胞形式的固化酶。
通过将该含有全长突变的质粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导表达、筛选出具有高e.e.值的阳性突变子。最后从阳性突变子中抽提出质粒DNA，进行DNA测序分析，以确定突变体的突变信息。在本发明卤醇脱卤酶突变体的制备方法中，可以采用pET28b(+)载体和大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞。在本发明制备的卤醇脱卤酶突变体的方法中，所获得的卤醇脱卤酶突变体基因可以在原核细胞和真核细胞胞内表达，也可以采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞和真核细胞胞外表达。
本申请文本中所用的术语“亲本”系指来自于Agrobacterium radiobacterAD1ZJB15067的卤醇脱卤酶，其核苷酸序列如序列1所示，氨基酸序列如序列2所示。
本申请文本中所用的术语“卤醇脱卤酶突变体”是指这样一种以序列表中序列2表示氨基酸序列为参考序列，存在来自第81位和第86位和第94位的两个突变和四个突变体和五个突变体，并且以1,3-二氯-2-丙醇为底物其具有e.e.值大于99％的酶。因此，在本申请中，所述卤醇脱卤酶突变体的变体，包括对序列2所示氨基酸序列中除第81位和第82位和第86位和第87位和第94位和第96位和第185位的其他位点的保守取代形式、增加和缺失一个和几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
本申请中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7表示的序列为参考序列，本序列中针对第241-243位核苷酸在内的能够编码脯氨酸的全部密码子、本序列中针对第256-258位核苷酸在内的能够编码天冬酰胺的全部密码子、本序列中针对第280-282位核苷酸在内的能够编码精氨酸的全部密码子。
在本申请文本中所用的氨基酸三字母和单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.，138:9-37,1984)。
与现有技术相比，本发明有益效要体现在：通过卤醇脱卤酶进行改造获得多株突变株，针对1,3-二氯-2-丙醇转化制备(S)-ECH具有极高的立体选择性。在磷酸盐缓冲体系中，能够催化制备光学纯度(e.e.值)大于99％的(S)-ECH。该技术具有酶立体选择性优异，反应体系简单，操作过程易于控制，生产成本低，产品光学纯度高等突出优势，具有良好的工业应用价值。
(四)附图说明
图1卤醇脱卤酶催化1,3-二氯-2-并处合成(S)-ECH。
图2亲本与优选突变株蛋白表达情况。M:Marker；第1泳道：亲本菌株；第2泳道：I81W；第3泳道：F86N；第4泳道：V94R。
图3为优选菌株与亲本菌株之间对于(S)-ECH稳定性反应进程比较。Treatment 1:10mL 200mM磷酸缓冲液加入(S)-ECH(20mM)。Treatment 2:10mL 200mM磷酸盐缓冲液。加入(S)-ECH(20mM)和NaCl(20mM)。Treatment 3:0.2g亲本菌株用10mL 200mM磷酸盐缓冲液重悬。加入(S)-ECH(20mM)和NaCl(20mM)。Treatment 4:0.2g HheC I81W细胞用10mL 200mM磷酸盐缓冲液重悬。加入(S)-ECH(20mM)和NaCl(20mM)。Treatment5:0.2g HheC F86N细胞用10mL 200mM磷酸盐缓冲液重悬。加入(S)-ECH(20mM)和NaCl(20mM)。Treatment 6:0.2gHheC V94R细胞用10mL 200mM磷酸盐缓冲液重悬。加入(S)-ECH(20mM)和NaCl(20mM)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：卤醇脱卤酶定点饱和突变文库的构建
根据GenBank AAK92099基因序列设计引物(见表1)。分别以引物I81X-F和I81X-R，F86X-F和F86X-R，V94X-F和V94X-R，对亲本的HheC基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)进行定点饱和突变实验。50μL PCR反应体系：25μL 2×Phanta Max Buffer，1μL dNTP，1μL P1(50μM)和P2(50μM)，2μL(100-200ng)亲本质粒模板，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNApolymerase，19μL去离子水。
PCR程序：95℃预变性3min，30个循环：95℃15s，分别在合适退火温度保持15s，72℃3min30s，最后在72℃延伸10min。
PCR产物经琼脂糖核酸电泳验证后，采用PCR cleanup Kit对产物进行纯化。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μL，加入1μL DpnI，37℃酶切2h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那抗性(50mg/L)的LB平板。
实施例2：卤醇脱卤酶单点饱和突变文库的筛选
挑取单菌落克隆子(由实施列1构建的突变库)在2mL的深96孔板中培养，含有1mLLB和50μg/mL卡那抗性。同时挑取三个亲本作为对照。2mL的深96孔板置于37℃条件培养5h，然后取100μL菌液到另外一个无菌的2mL 96孔板，并向其中加入100μL、30％(wt/vol)的无菌甘油。向剩余的900μL菌液中加入100μL含50μg/mL卡那抗性和1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)LB培养基，置于28℃诱导12-14h，诱导后的菌株在3,000×g和4℃条件下离心30min，弃上清，收集菌体。500μL反应体系(200mM磷酸盐缓冲液、1.3-二氯-2-丙醇)加入每个孔，将菌体进行重悬，然后置于37℃和150rpm的条件下反应1h。用1mL乙酸乙酯萃取，后于1,2000rpm下离心1min，将上清液转入含有无水Na2SO4的2mL EP管中做吸水处理，后用气相检测。
气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的量和e.e.值作为对照。确定关键位点为81位和86位和94位。获得了优良突变体菌株，记为突变体I81W，突变体I81S，突变体I81N，突变体I81Q，突变体I81H，突变体F86D，突变体F86N，突变体V94G，突变体V94W，突变体V94M和突变体V94R，其e.e.值大于95.3％。
实施例3：卤醇脱卤酶迭代饱和突变文库的构建
根据GenBank AAK92099基因序列设计引物(见表1)。分别以引物F86X-F和F86X-R，V94X-F和V94X-R，以第81位点优选突变体质粒为模板进行第86位和第94位进行迭代饱和突变，50μL PCR反应体系：25μL 2×Phanta Max Buffer，1μL dNTP，1μL P1(50μM)和P2(50μM)，2μL(100-200ng)亲本质粒模板，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase，19μL去离子水。PCR程序：95℃预变性3min，30个循环：95℃15s，分别在合适退火温度保持15s，72℃3min30s，最后在72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖核酸电泳验证后，采用PCR cleanupKit对产物进行纯化。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μL，加入1μLDpnI，37℃酶切2h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布于含卡那抗性(50mg/L)的LB平板。
表1：引物
Primer Name Primer Sequence 5'-3'
I81X-F GTGTCCAACGATNNSTTCGCGCCGGAA
I81X-R TTCCGGCGCGAASNNATCGTTGGACAC
F86X-F TTCGCGCCGGAANNSCAGCCGATCGAT
F86X-R ATCGATCGGCTGSNNTTCCGGCGCGAA
V94X-F GATAAATATGCTNNSGAAGATTACCGT
V94X-R ACGGTAATCTTCSNNAGCATATTTATC
V94R-F GATAAATATGCTAGGGAAGATTACCGT
V94R-R ACGGTAATCTTCCCTAGCATATTTATC
实施例4：卤醇脱卤酶迭代饱和突变文库的筛选
挑取单菌落克隆子(由实施例3构建的突变库)在2mL的深96孔板中培养，含有1mLLB和50μg/mL卡那抗性。同时挑取三个亲本作为对照。2mL的深96孔板置于37℃条件培养5h，然后取100μL菌液到另外一个无菌的2mL 96孔板，并向其中加入100μL、30％(wt/vol)的无菌甘油。向剩余的900μL菌液中加入100μL含50μg/mL卡那抗性和1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)LB培养基，置于28℃诱导12-14h，诱导后的菌株在3,000×g和4℃条件下离心30min，弃上清，收集菌体。500μL反应体系(200mM磷酸盐缓冲液、1.3-二氯-2-丙醇)加入每个孔，将菌体进行重悬，然后置于37℃和150rpm的条件下反应1h。用1mL乙酸乙酯萃取，后于1,2000rpm下离心1min，将上清液转入含有无水Na2SO4的2mL EP管中做吸水处理，后用气相检测。气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的量和e.e.值作为对照。确定联合突变在反应进行前期均对1,3-二氯-2-丙醇无明显活性。
实施例5：卤醇脱卤酶优势菌株联合突变及活性筛选
根据GenBank AAK92099基因序列设计引物(见表1)。以引物V94R-F和V94R-R，以第81位点和第86位点联合突变(实施例4)优选突变体质粒为模板进行第94位进行联合突变，50μL PCR反应体系：25μL2×Phanta Max Buffer，1μL dNTP，1μL P1(50μM)和P2(50μM)，2μL(100-200ng)亲本质粒模板，1μL Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase，19μL去离子水。PCR程序：95℃预变性3min，30个循环：95℃15s，分别在合适退火温度保持15s，72℃3min30s，最后在72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖核酸电泳验证后，采用PCR cleanup Kit对产物进行纯化。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μL，加入1μLDpnI，37℃酶切2h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那抗性(50mg/L)的LB平板。
分别取亲本卤醇脱卤酶和本实施例中卤醇脱卤酶突变体湿菌体0.1g，用10mL200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功率超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶液。采用粗酶液催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH，并比较它们的e.e.值。该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入1,3-二氯-2-丙醇，进行反应。反应5min后，取500μL反应液，加入1000μL乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的e.e.值作为对照，e.e.值计算公式：[e.e.(％)＝(S-R)/(S+R)×100]。几种卤醇脱卤酶的e.e.值比较见表2。
实施例6：卤醇脱卤酶优势菌株复筛
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例2制备的3种卤醇脱卤酶突变体湿菌体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功率超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶液。采用粗酶液催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH，并比较它们的e.e.值。该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入1,3-二氯-2-丙醇，进行反应。反应5min后，取500μL反应液，加入1000μL乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的e.e.值作为对照，e.e.值计算公式：[e.e.(％)＝(S-R)/(S+R)×100]。几种卤醇脱卤酶的e.e.值比较见表2。
表2：卤醇脱卤酶生成(S)-ECH e.e.值比较
Figure BDA0001918950960000101
Figure BDA0001918950960000111
实施例7：亲本卤醇脱卤酶和卤醇脱卤酶突变体催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH的e.e.值稳定性比较
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例1制备的3种卤醇脱卤酶突变体湿菌体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功率超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶液。采用粗酶液催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH，并比较它们的e.e.值。该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入1,3-二氯-2-丙醇，进行反应。反应6h后，取500μL反应液，加入1000μL乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的e.e.值作为对照，e.e.值计算公式：[e.e.(％)＝(S-R)/(S+R)×100]。几种卤醇脱卤酶的e.e.值比较见表3。
表3卤醇脱卤酶生成(S)-ECH e.e.值稳定性比较
卤醇脱卤酶 对应氨基酸序列号 e.e.值(％)
亲本 SEQ ID NO.2 -8.54
I81W SEQ ID NO.4 >50
F86N SEQ ID NO.6 >50
V94R SEQ ID NO.8 >50
实施例8：亲本卤醇脱卤酶和卤醇脱卤酶突变体维持(S)-ECH稳定性的探究
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例1制备的3种卤醇脱卤酶突变体湿菌体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功率超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶液。采用粗酶液催化(S)-ECH，并比较它们的(S)-ECH稳定性。该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入(S)-ECH和NaCl，进行反应。于反应过程中取样监测，取500μL反应液，加入1000μL乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的剩余量作为对照。结果如图3所示。
实施例9：亲本卤醇脱卤酶和卤醇脱卤酶突变体催化不同浓度1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH的e.e.值比较
分别取亲本卤醇脱卤酶和实施例1制备的3种卤醇脱卤酶突变体湿菌体0.1g，用10mL 200mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液进行重悬，50％功率超声破碎10min。在4℃、15000rpm离心10min，上清为制备的粗酶液。采用粗酶液催化不同浓度1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-ECH，并比较它们的e.e.值。该体系在600rpm、37℃条件下进行反应。通过向反应体系中加入5-200mM的1,3-二氯-2-丙醇，进行反应。反应过程中于2min、5min、7min、15min、20min、30min、1h、2h、4h、6h取500μL反应液，加入1000μL乙酸乙酯萃取，经无水硫酸钠干燥后气相分析。气相分析条件：Agilent-7890GC和手性BGB-175色谱柱，气相程序是60℃5min，10℃/min程序升温至160℃保留3min。保留时间为Rt(S)-ECH＝6.5min，Rt(R)-ECH＝6.6min。以亲本生产的(S)-ECH的量作为对照。几种卤醇脱卤酶的e.e.值比较见表4。
表4：卤醇脱卤酶生成(S)-ECH的e.e.值比较
Figure BDA0001918950960000131
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 786
<212> DNA
<213> Agrobacterium radiobacter
<400> 1
gcttctaccg ctattgtgac taacgtaaag catttcggtg gcatgggctc tgcgctgcgt 60
ctgtctgaag ctggtcacac tgttgcttgc catgacgaaa gcttcaaaca gaaagatgaa 120
ctggaagctt tcgcggaaac ttatcctcag ctgaaaccga tgtctgaaca ggaaccggct 180
gaactgattg aagctgtgac ctctgcctac ggccaagttg acgtcctggt gtccaacgat 240
attttcgcgc cggaattcca gccgatcgat aaatatgctg tggaagatta ccgtggtgct 300
gtcgaagctc tgcagatccg cccatttgca ctggttaacg cggtggcttc ccagatgaag 360
aaacgtaaat ctggccacat catcttcatt acctctgcaa ctccattcgg tccgtggaaa 420
gaactgtcca cttatacttc cgcccgtgct ggcgcttgca ctctggcaaa cgcgctgtcc 480
aaagagctgg gcgaatacaa cattccggtt ttcgcgatcg gttcgaacta cctgcactct 540
gaagacagcc cgtacttcta cccgaccgaa ccgtggaaaa ctaacccgga acacgtggcg 600
cacgtaaaaa aggttaccgc actgcagcgt ctgggtaccc aaaaagaact gggcgaactg 660
gttgcgttcc tggcatctgg ttcctgtgat tacctgaccg gtcaagtctt ttggctggca 720
ggtggcttcc cgatgatcga acgtccgccg ggtatgccgg aactcgagca ccaccaccac 780
caccac 786
<210> 2
<211> 262
<212> PRT
<213> Agrobacterium radiobacter
<400> 2
Ala Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys His Phe Gly Gly Met Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His Thr Val Ala Cys His Asp
20 25 30
Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr Tyr
35 40 45
Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Ile Glu
50 55 60
Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Gln Val Asp Val Leu Val Ser Asn Asp
65 70 75 80
Ile Phe Ala Pro Glu Phe Gln Pro Ile Asp Lys Tyr Ala Val Glu Asp
85 90 95
Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile Arg Pro Phe Ala Leu Val
100 105 110
Asn Ala Val Ala Ser Gln Met Lys Lys Arg Lys Ser Gly His Ile Ile
115 120 125
Phe Ile Thr Ser Ala Thr Pro Phe Gly Pro Trp Lys Glu Leu Ser Thr
130 135 140
Tyr Thr Ser Ala Arg Ala Gly Ala Cys Thr Leu Ala Asn Ala Leu Ser
145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Pro Val Phe Ala Ile Gly Ser Asn
165 170 175
Tyr Leu His Ser Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Tyr Pro Thr Glu Pro Trp
180 185 190
Lys Thr Asn Pro Glu His Val Ala His Val Lys Lys Val Thr Ala Leu
195 200 205
Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly Glu Leu Val Ala Phe Leu
210 215 220
Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly Gln Val Phe Trp Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Pro Pro Gly Met Pro Glu Leu Glu
245 250 255
His His His His His His
260
<210> 3
<211> 786
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gcttctaccg ctattgtgac taacgtaaag catttcggtg gcatgggctc tgcgctgcgt 60
ctgtctgaag ctggtcacac tgttgcttgc catgacgaaa gcttcaaaca gaaagatgaa 120
ctggaagctt tcgcggaaac ttatcctcag ctgaaaccga tgtctgaaca ggaaccggct 180
gaactgattg aagctgtgac ctctgcctac ggccaagttg acgtcctggt gtccaacgat 240
tggttcgcgc cggaattcca gccgatcgat aaatatgctg tggaagatta ccgtggtgct 300
gtcgaagctc tgcagatccg cccatttgca ctggttaacg cggtggcttc ccagatgaag 360
aaacgtaaat ctggccacat catcttcatt acctctgcaa ctccattcgg tccgtggaaa 420
gaactgtcca cttatacttc cgcccgtgct ggcgcttgca ctctggcaaa cgcgctgtcc 480
aaagagctgg gcgaatacaa cattccggtt ttcgcgatcg gttcgaacta cctgcactct 540
gaagacagcc cgtacttcta cccgaccgaa ccgtggaaaa ctaacccgga acacgtggcg 600
cacgtaaaaa aggttaccgc actgcagcgt ctgggtaccc aaaaagaact gggcgaactg 660
gttgcgttcc tggcatctgg ttcctgtgat tacctgaccg gtcaagtctt ttggctggca 720
ggtggcttcc cgatgatcga acgtccgccg ggtatgccgg aactcgagca ccaccaccac 780
caccac 786
<210> 4
<211> 262
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
Ala Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys His Phe Gly Gly Met Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His Thr Val Ala Cys His Asp
20 25 30
Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr Tyr
35 40 45
Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Ile Glu
50 55 60
Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Gln Val Asp Val Leu Val Ser Asn Asp
65 70 75 80
Trp Phe Ala Pro Glu Phe Gln Pro Ile Asp Lys Tyr Ala Val Glu Asp
85 90 95
Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile Arg Pro Phe Ala Leu Val
100 105 110
Asn Ala Val Ala Ser Gln Met Lys Lys Arg Lys Ser Gly His Ile Ile
115 120 125
Phe Ile Thr Ser Ala Thr Pro Phe Gly Pro Trp Lys Glu Leu Ser Thr
130 135 140
Tyr Thr Ser Ala Arg Ala Gly Ala Cys Thr Leu Ala Asn Ala Leu Ser
145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Pro Val Phe Ala Ile Gly Ser Asn
165 170 175
Tyr Leu His Ser Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Tyr Pro Thr Glu Pro Trp
180 185 190
Lys Thr Asn Pro Glu His Val Ala His Val Lys Lys Val Thr Ala Leu
195 200 205
Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly Glu Leu Val Ala Phe Leu
210 215 220
Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly Gln Val Phe Trp Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Pro Pro Gly Met Pro Glu Leu Glu
245 250 255
His His His His His His
260
<210> 5
<211> 786
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
gcttctaccg ctattgtgac taacgtaaag catttcggtg gcatgggctc tgcgctgcgt 60
ctgtctgaag ctggtcacac tgttgcttgc catgacgaaa gcttcaaaca gaaagatgaa 120
ctggaagctt tcgcggaaac ttatcctcag ctgaaaccga tgtctgaaca ggaaccggct 180
gaactgattg aagctgtgac ctctgcctac ggccaagttg acgtcctggt gtccaacgat 240
attttcgcgc cggaaaacca gccgatcgat aaatatgctg tggaagatta ccgtggtgct 300
gtcgaagctc tgcagatccg cccatttgca ctggttaacg cggtggcttc ccagatgaag 360
aaacgtaaat ctggccacat catcttcatt acctctgcaa ctccattcgg tccgtggaaa 420
gaactgtcca cttatacttc cgcccgtgct ggcgcttgca ctctggcaaa cgcgctgtcc 480
aaagagctgg gcgaatacaa cattccggtt ttcgcgatcg gttcgaacta cctgcactct 540
gaagacagcc cgtacttcta cccgaccgaa ccgtggaaaa ctaacccgga acacgtggcg 600
cacgtaaaaa aggttaccgc actgcagcgt ctgggtaccc aaaaagaact gggcgaactg 660
gttgcgttcc tggcatctgg ttcctgtgat tacctgaccg gtcaagtctt ttggctggca 720
ggtggcttcc cgatgatcga acgtccgccg ggtatgccgg aactcgagca ccaccaccac 780
caccac 786
<210> 6
<211> 262
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
Ala Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys His Phe Gly Gly Met Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His Thr Val Ala Cys His Asp
20 25 30
Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr Tyr
35 40 45
Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Ile Glu
50 55 60
Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Gln Val Asp Val Leu Val Ser Asn Asp
65 70 75 80
Ile Phe Ala Pro Glu Asn Gln Pro Ile Asp Lys Tyr Ala Val Glu Asp
85 90 95
Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile Arg Pro Phe Ala Leu Val
100 105 110
Asn Ala Val Ala Ser Gln Met Lys Lys Arg Lys Ser Gly His Ile Ile
115 120 125
Phe Ile Thr Ser Ala Thr Pro Phe Gly Pro Trp Lys Glu Leu Ser Thr
130 135 140
Tyr Thr Ser Ala Arg Ala Gly Ala Cys Thr Leu Ala Asn Ala Leu Ser
145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Pro Val Phe Ala Ile Gly Ser Asn
165 170 175
Tyr Leu His Ser Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Tyr Pro Thr Glu Pro Trp
180 185 190
Lys Thr Asn Pro Glu His Val Ala His Val Lys Lys Val Thr Ala Leu
195 200 205
Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly Glu Leu Val Ala Phe Leu
210 215 220
Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly Gln Val Phe Trp Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Pro Pro Gly Met Pro Glu Leu Glu
245 250 255
His His His His His His
260
<210> 7
<211> 786
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
gcttctaccg ctattgtgac taacgtaaag catttcggtg gcatgggctc tgcgctgcgt 60
ctgtctgaag ctggtcacac tgttgcttgc catgacgaaa gcttcaaaca gaaagatgaa 120
ctggaagctt tcgcggaaac ttatcctcag ctgaaaccga tgtctgaaca ggaaccggct 180
gaactgattg aagctgtgac ctctgcctac ggccaagttg acgtcctggt gtccaacgat 240
attttcgcgc cggaattcca gccgatcgat aaatatgcta gggaagatta ccgtggtgct 300
gtcgaagctc tgcagatccg cccatttgca ctggttaacg cggtggcttc ccagatgaag 360
aaacgtaaat ctggccacat catcttcatt acctctgcaa ctccattcgg tccgtggaaa 420
gaactgtcca cttatacttc cgcccgtgct ggcgcttgca ctctggcaaa cgcgctgtcc 480
aaagagctgg gcgaatacaa cattccggtt ttcgcgatcg gttcgaacta cctgcactct 540
gaagacagcc cgtacttcta cccgaccgaa ccgtggaaaa ctaacccgga acacgtggcg 600
cacgtaaaaa aggttaccgc actgcagcgt ctgggtaccc aaaaagaact gggcgaactg 660
gttgcgttcc tggcatctgg ttcctgtgat tacctgaccg gtcaagtctt ttggctggca 720
ggtggcttcc cgatgatcga acgtccgccg ggtatgccgg aactcgagca ccaccaccac 780
caccac 786
<210> 8
<211> 262
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
Ala Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys His Phe Gly Gly Met Gly
1 5 10 15
Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His Thr Val Ala Cys His Asp
20 25 30
Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr Tyr
35 40 45
Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Ile Glu
50 55 60
Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Gln Val Asp Val Leu Val Ser Asn Asp
65 70 75 80
Ile Phe Ala Pro Glu Phe Gln Pro Ile Asp Lys Tyr Ala Arg Glu Asp
85 90 95
Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile Arg Pro Phe Ala Leu Val
100 105 110
Asn Ala Val Ala Ser Gln Met Lys Lys Arg Lys Ser Gly His Ile Ile
115 120 125
Phe Ile Thr Ser Ala Thr Pro Phe Gly Pro Trp Lys Glu Leu Ser Thr
130 135 140
Tyr Thr Ser Ala Arg Ala Gly Ala Cys Thr Leu Ala Asn Ala Leu Ser
145 150 155 160
Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Pro Val Phe Ala Ile Gly Ser Asn
165 170 175
Tyr Leu His Ser Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Tyr Pro Thr Glu Pro Trp
180 185 190
Lys Thr Asn Pro Glu His Val Ala His Val Lys Lys Val Thr Ala Leu
195 200 205
Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly Glu Leu Val Ala Phe Leu
210 215 220
Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly Gln Val Phe Trp Leu Ala
225 230 235 240
Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Pro Pro Gly Met Pro Glu Leu Glu
245 250 255
His His His His His His
260

Claims (5)

1. 一种来源于放射形土壤杆菌的卤醇脱卤酶突变体，由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸经定点饱和突变而来，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 6或SEQID NO. 8所示。
2.权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经超声破碎后获得的上清液作为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以pH 8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质，在600 rpm、37 ℃条件下进行反应，反应结束后，将反应分离纯化，获得(S)-手性环氧氯丙烷。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于卤醇脱卤酶突变体编码基因序列如SEQ IDNO. 3、SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO.7所示。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于催化剂的用量以湿菌体重量计为5~100 g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为5~200 mM。
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