CN112980815A

CN112980815A - α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16及其应用

Info

Publication number: CN112980815A
Application number: CN202110254306.XA
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 姜宏; 周文婷; 孙建安; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: CN112980815B

Abstract

本发明公开了一种α‑L‑岩藻糖苷酶OUCJdch‑16，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。编码‑L‑岩藻糖苷酶OUCJdch‑16的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。α‑L‑岩藻糖苷酶OUCJdch‑16在水解pNp‑Fuc/制备二岩藻糖基乳糖中的应用。本发明还公开了包含有编码α‑L‑岩藻糖苷酶OUCJdch‑16的基因的重组表达载体、重组宿主。本发明的α‑L‑岩藻糖苷酶OUCJdch‑16具有一定的嗜冷性，其在25～45℃下均具有较高的酶活性，因而其可在较广的温度范围内实现工业应用。此外，液相结果表明，OUCJdch‑16在最适反应条件下具有更高的转化率，具有良好的生物催化合成效率。

Description

α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16及其应用

技术领域

本发明涉及α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16及其应用，属于功能酶技术领域。

背景技术

二岩藻糖基乳糖是一种由α(1→2)糖苷键连接L-岩藻单糖和D-乳糖组成的人乳低聚糖，具有调节肠道菌群和免疫系统发育、抵抗病原菌的黏附、促进神经系统发育和修复以及提高艾滋病毒感染婴儿存活率等生理活性，这使得二岩藻糖基乳糖在医药、保健品、食品、农业等领域有了更大的应用价值，因此大量合成二岩藻糖基乳糖具有重要意义。

目前，二岩藻糖基乳糖的制备方法主要有天然提取、化学法、生物酶法。婴儿主要从母乳中获取二岩藻糖基乳糖，但是由于母乳中的含量不仅与母亲血型有关，还会在产后的前三个月不断下降，因此不能从母乳中大量提取。而化学合成法步骤多，纯化难，产品收率低，成本高昂，且合成过程涉及有毒试剂。相比之下，生物合成具有区域特异性、专一性好，能实现靶向生产，产物单一易纯化，反应条件温和，安全无毒等优点，所以生物合成二岩藻糖基乳糖是一种经济可行的方法。岩藻糖苷酶可以利用底物pNp-岩藻糖和乳糖合成二岩藻糖基乳糖，但野生型菌株产酶水平低，难以满足工业生产和应用的要求，可采用异源表达提高产酶水平，制备酶制剂，用于工业化生产。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16，其可以降解pNp-Fuc，将水解的岩藻糖基转移到乳糖上产生二岩藻糖基乳糖。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MKIVQRLSILILVTILNVNTGIAQNKSQKDKLSDDERMAWWRDSKFGMFIHWGAYSIIGGERGTKIAGGGAEWAMDKLDYTIEDYEKFPKMFNPQLFDADAWVTMAKNAGMKYIVLTSKHHEGFALWDSKVSKYDIMDTAPFKRDIVKELAEACKKQGIKFCLYYSIVDWHHPQAQGNLYPNYNISQHDDPSVVNPDFPKYYQNYMKPQVGELLKNYGDIGVVWFDGDWISDYTTEMGKDLYKYIRDIQPNTIVNNRVDKGRTGMDGMNNKPGQFAGDFGTPEQEIPDTGIDTDWEACMTMNGTWGYKPSDNKWKSSEDLIQKLVDIVSKGGNFLLNIGPDGFGRFPAESIRRLEAMGEWTKKNGEAVYGASASPYEKPSWGRYTKKDGVVYAHVFEWPKDGLLKLNKEIKIKKATVLTNPNTVLKSIATSAEVLLDIPMLAPDATVTVIKIELAK。

编码上述α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

5’-ATGAAGATAGTACAAAGGTTAAGTATTCTGATATTAGTTACAATATTAAATGTAAATACAGGTATTGCTCAAAACAAATCACAAAAAGACAAACTTTCAGATGATGAGCGTATGGCGTGGTGGCGCGATTCAAAATTTGGAATGTTTATCCACTGGGGTGCTTACTCTATAATTGGTGGAGAACGTGGTACAAAAATCGCAGGCGGTGGTGCAGAATGGGCAATGGATAAATTAGATTATACAATCGAAGATTACGAGAAGTTTCCTAAAATGTTCAATCCGCAATTATTTGATGCGGATGCTTGGGTGACTATGGCAAAAAATGCAGGGATGAAGTATATCGTACTTACTTCAAAGCATCATGAAGGATTTGCACTTTGGGATTCGAAGGTGTCTAAATATGACATCATGGATACAGCACCTTTTAAGCGTGATATTGTTAAGGAACTAGCAGAAGCTTGTAAAAAACAAGGCATAAAATTCTGTTTGTATTACTCTATAGTAGATTGGCATCATCCACAAGCGCAAGGAAATTTGTATCCAAACTATAACATTTCTCAGCATGATGACCCATCAGTTGTTAATCCTGATTTCCCAAAATATTATCAAAATTACATGAAGCCTCAAGTGGGTGAATTGTTGAAGAACTATGGTGATATAGGTGTTGTATGGTTTGATGGTGATTGGATTTCAGATTATACCACAGAGATGGGTAAGGACCTTTACAAATACATCCGTGACATTCAGCCCAACACTATTGTGAACAATAGAGTAGATAAAGGAAGAACCGGTATGGACGGAATGAATAATAAGCCAGGTCAATTTGCAGGTGATTTTGGTACTCCAGAACAAGAGATTCCAGATACGGGAATTGACACAGATTGGGAAGCTTGCATGACTATGAACGGAACTTGGGGCTATAAACCATCTGATAACAAATGGAAAAGTAGTGAAGATTTAATTCAGAAATTAGTAGATATTGTATCAAAAGGAGGTAACTTTTTATTAAACATAGGCCCTGATGGTTTCGGAAGATTTCCGGCAGAAAGCATCAGACGTTTAGAAGCGATGGGTGAGTGGACAAAGAAAAATGGAGAGGCTGTTTATGGCGCTTCTGCAAGTCCTTACGAAAAACCTTCGTGGGGTCGATATACCAAAAAAGATGGAGTAGTGTATGCACATGTATTTGAATGGCCAAAAGATGGATTACTAAAACTTAACAAAGAAATCAAAATTAAAAAAGCAACAGTATTAACAAATCCGAACACTGTTTTGAAATCGATTGCTACTTCTGCTGAGGTTTTATTAGACATTCCTATGTTGGCACCCGATGCTACTGTAACAGTTATTAAAATTGAGTTGGCTAAATAA-3’。

所述α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16在水解pNp-Fuc/制备二岩藻糖基乳糖中的应用。

一种水解pNp-Fuc/制备二岩藻糖基乳糖的方法：采用上述α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16水解pNp-Fuc，制备二岩藻糖基乳糖。

进一步地，水解的条件为：最适温度为25℃，最适pH为6.0。

进一步地，制备二岩藻糖基乳糖的条件为：最适温度为25℃，最适pH为5.0。

一种重组表达载体，其携带有上述编码α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的基因。

一种表达α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的重组宿主，其基因组中包含上述编码α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的基因，可通过转化/转染上述重组表达载体制备得到。

所述重组宿主在制备α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16中的应用。

一种酶制剂，包含有上述α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16。该酶制剂在水解pNp-Fuc/制备二岩藻糖基乳糖中的应用。

本发明的α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16，相较于现有的岩藻糖苷酶(如中国发明专利申请CN 110885809A中涉及的α-L-岩藻糖苷酶)，OUCJdch-16具有一定的嗜冷性，其在25～45℃下均具有较高的酶活性，在25℃有最高活性，而来源于Thermotoga maritima的Tmαfuc最适反应温度≥60℃，来源于Pedobacter sp.CAU209的PbFuc最适反应温度为35℃，相比之下，本发明的OUCJdch-16更适宜于低温环境，因而其可在较广的温度范围内实现工业应用。此外，液相结果表明，OUCJdch-16在最适反应条件下转化率达到92.15％，与PbFuc酶85％的转化率相比，OUCJdch-16具有良好的生物催化合成效率。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：本发明的α-L-岩藻糖苷酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为粗蛋白；2为200mM咪唑溶液洗脱下来的目的蛋白。

图2：温度变化对水解pNp-Fuc反应相对酶活的影响示意图。

图3：pH变化对水解pNp-Fuc反应相对酶活的影响示意图。

图4：本发明的α-L-岩藻糖苷酶在不同温度下放置12h剩余水解反应酶活变化图。

图5：本发明的α-L-岩藻糖苷酶在不同pH下放置12h剩余水解反应酶活变化图。

图6：本发明的α-L-岩藻糖苷酶合成二岩藻糖基乳糖产物定性HPLC分析图。

图7：本发明的α-L-岩藻糖苷酶合成二岩藻糖基乳糖产物定性质谱分析图。

图8：温度变化对合成二岩藻糖基乳糖反应相对酶活的影响示意图。

图9：pH变化对合成二岩藻糖基乳糖反应相对酶活的影响示意图。

图10：加酶量和反应时间的变化对合成二岩藻糖基乳糖转化率的影响示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1α-L-岩藻糖苷酶基因OUCJdch-16的克隆

本发明的α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16基因为基因组扩增获得。发明人挖掘到菌株Flavobacterium algicola的α-L-岩藻糖苷酶片段，该菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，发明人提取了该菌的基因组，通过基因扩增获得了OUCJdch-16序列，此序列含有1371个碱基序列，如SEQ ID NO.2所示，编码456个氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示。根据进化树比对，发现该α-L-岩藻糖苷酶属于糖苷水解酶第29家族(GH29)。

以提取的基因组为模板，在α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增OUCJdch-16基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-GATCCGAATTCGAGCTCCGTATGCAAAAMAAATCAVAAAAA-3’，如SEQ IDNO.3所示；

下游引物：5’-CTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTAGCCAACTCAATTTTAAT-3’，如SEQ IDNO.4所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸120s，反应30个循环，72℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳后回收1371bp的PCR产物片段。

实施例2α-L-岩藻糖苷酶基因的表达载体构建

基因片段与pET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50μg/mL硫酸卡那霉素的(LB)培养基固体平板上。37℃温箱中培养12～16h后，挑取单克隆至含有50μg/mL硫酸卡那霉素LB液体培养基，转速220rpm的37℃摇床培养过夜，阳性验证后测序，并命名为pET28a-OUCJdch-16。

实施例3α-L-岩藻糖苷酶基因的重组质粒及工程菌的构建

提取测序正确的重组质粒，并转化至宿主E.coli BL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出。

实施例4利用大肠杆菌工程菌制备重组α-L-岩藻糖苷酶

挑取大肠杆菌重组菌株接种在5ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养12h后按1％的接种量接入含有硫酸卡那霉的ZYP-5052培养基，20℃，220rpm培养48h，自诱导表达α-L-岩藻糖苷酶。4℃，8000g离心10min，收集菌体，细胞重悬于50mMpH7.4的Tirs-HCl缓冲液中，超声破碎30min后12000g离心15min，上清液即为粗酶液。粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，使用平衡缓冲液(500mM NaCl,50mM Tris-HCl)平衡柱子，然后用20mM咪唑溶液(20mM咪唑，500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱结合力弱的杂蛋白，200mM咪唑溶液(200mM咪唑，500mM NaCl,50mM Tris-HCl)洗脱目的蛋白，将得到的溶液进行SDS-PAGE检测(结果如图1所示)，核对条带是否单一、大小是否准确，同时采用水解pNp-Fuc是否有颜色变化验证所获蛋白是否具有酶活，使用Bradford法测定蛋白浓度。

实施例5α-L-岩藻糖苷酶水解pNp-Fuc反应比酶活测定

α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16活性的标准测定方法为：在99μL pH 6.0 50mM磷酸缓冲液和99μL 5mM pNp-Fuc中加入2μL酶液，于25℃下反应5min，加入2M Na₂CO₃终止反应，在OD₄₀₅ nm下检测其吸光度。酶活力定义为在标准条件下每min产生1μmol pNP所需要的酶量。经测定，纯化后的α-L-岩藻糖苷酶活力可达17.11U/mg。

实施例6测定重组α-L-岩藻糖苷酶的水解最适反应条件

反应条件为：在pH 7.0下，选取20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃反应5min测定最适温度；在25℃下，选用pH为3.0～10.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据α-L-岩藻糖苷酶的酶活力，确定OUCJdch-16的最适pH。结果如图2，图3所示，重组α-L-岩藻糖苷酶的最适反应温度为25℃，最适pH为6.0，同时其最适温度测定实验结果显示该重组褐藻胶裂解酶在25～45℃酶活均比较高，表明该酶具有一定的嗜冷性。

实施例7测定重组α-L-岩藻糖苷酶水解反应的稳定性

反应条件为：在pH 6.0下，取一定量的酶液在4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃放置12h，在最适条件下(温度为25℃，pH为6.0)测定其残留酶活；在25℃下，取一定量的酶液分别在pH为3.0～10.0的缓冲液放置12h，在最适条件下(温度为25℃，pH为6.0)测定其残留酶活。结果如图4，图5所示，重组α-L-岩藻糖苷酶在20℃及pH4.0下稳定性最好。

实施例8重组α-L-岩藻糖苷酶合成产物定性分析

以20mM pNp-Fuc和500mM乳糖为底物，采用200μL反应体系，加入0.01Uα-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16，置于25℃，pH 6.0的条件下反应3h，所得反应产物煮沸5min并于10000rpm离心10min以除去体系中蛋白等杂质，收集上清过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。HPLC条件为：使用Sugar Pak I column(6.5×300mm)，以50mg/L EDTA二钠钙为流动相，流速0.25mL/min，柱温75℃，上样量20μL，示差检测，结果如图6所示。在maXis ESI QTOF仪器上进行正模式质谱分析，目标质量范围m/z比为50-1000，在m/z为511.1575处检测到产物，确定α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16合成产物为二岩藻糖基乳糖。

实施例9测定重组α-L-岩藻糖苷酶合成二岩藻糖基乳糖的最适条件

在pH6.0的磷酸盐缓冲液中，将含有100μL底物(20mM pNp-Fuc和500mM乳糖)和100μL纯化酶的混合物分别置于4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃中孵育3h，煮沸5min结束反应，并于10000rpm离心10min以除去体系中蛋白等杂质，收集上清过0.22μm滤膜，进行HPLC检测定量；在25℃下，将含有100μL底物(20mM pNp-Fuc和500mM乳糖)和100μL纯化酶的混合物分别pH为3.0～10.0的缓冲液中孵育3h，煮沸5min结束反应，并于10000rpm离心10min以除去体系中蛋白等杂质，收集上清过0.22μm滤膜，进行HPLC检测定量。结果如图8，图9所示，重组α-L-岩藻糖苷酶合成二岩藻糖基乳糖的最适反应温度为25℃，最适pH为5.0。将含有750μL底物(20mM pNp-Fuc和500mM乳糖)和750μL酶活力为0.297U、0.742U、1.484U、2.967U、5.192U、7.418U、9.643U、11.127U、12.341U、14.24U的纯化酶混合物置于pH为5.0的柠檬酸缓冲液中，在25℃下孵育0.5h、3h、6h、12h、24h、48h、84h、120h，煮沸5min结束反应并于10000rpm离心10min以除去体系中蛋白等杂质，收集上清过0.22μm滤膜，进行HPLC检测定量。结果如图10所示，当加酶量为14.24U，反应时间为120h时，重组α-L-岩藻糖苷酶合成二岩藻糖基乳糖的转化率最高为92.15％。

实施例10利用重组α-L-岩藻糖苷酶制备酶制剂

利用实施例4制备的重组α-L-岩藻糖苷酶制备酶制剂：将发酵破碎液纯化后，用缓冲液置换咪唑，酶液保存在4℃。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16及其应用

<141> 2021-03-09

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> Flavobacterium algicola

<400> 1

Met Lys Ile Val Gln Arg Leu Ser Ile Leu Ile Leu Val Thr Ile Leu

1 5 10 15

Asn Val Asn Thr Gly Ile Ala Gln Asn Lys Ser Gln Lys Asp Lys Leu

20 25 30

Ser Asp Asp Glu Arg Met Ala Trp Trp Arg Asp Ser Lys Phe Gly Met

35 40 45

Phe Ile His Trp Gly Ala Tyr Ser Ile Ile Gly Gly Glu Arg Gly Thr

50 55 60

Lys Ile Ala Gly Gly Gly Ala Glu Trp Ala Met Asp Lys Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Thr Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Phe Pro Lys Met Phe Asn Pro Gln Leu

85 90 95

Phe Asp Ala Asp Ala Trp Val Thr Met Ala Lys Asn Ala Gly Met Lys

100 105 110

Tyr Ile Val Leu Thr Ser Lys His His Glu Gly Phe Ala Leu Trp Asp

115 120 125

Ser Lys Val Ser Lys Tyr Asp Ile Met Asp Thr Ala Pro Phe Lys Arg

130 135 140

Asp Ile Val Lys Glu Leu Ala Glu Ala Cys Lys Lys Gln Gly Ile Lys

145 150 155 160

Phe Cys Leu Tyr Tyr Ser Ile Val Asp Trp His His Pro Gln Ala Gln

165 170 175

Gly Asn Leu Tyr Pro Asn Tyr Asn Ile Ser Gln His Asp Asp Pro Ser

180 185 190

Val Val Asn Pro Asp Phe Pro Lys Tyr Tyr Gln Asn Tyr Met Lys Pro

195 200 205

Gln Val Gly Glu Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Asp Ile Gly Val Val Trp

210 215 220

Phe Asp Gly Asp Trp Ile Ser Asp Tyr Thr Thr Glu Met Gly Lys Asp

225 230 235 240

Leu Tyr Lys Tyr Ile Arg Asp Ile Gln Pro Asn Thr Ile Val Asn Asn

245 250 255

Arg Val Asp Lys Gly Arg Thr Gly Met Asp Gly Met Asn Asn Lys Pro

260 265 270

Gly Gln Phe Ala Gly Asp Phe Gly Thr Pro Glu Gln Glu Ile Pro Asp

275 280 285

Thr Gly Ile Asp Thr Asp Trp Glu Ala Cys Met Thr Met Asn Gly Thr

290 295 300

Trp Gly Tyr Lys Pro Ser Asp Asn Lys Trp Lys Ser Ser Glu Asp Leu

305 310 315 320

Ile Gln Lys Leu Val Asp Ile Val Ser Lys Gly Gly Asn Phe Leu Leu

325 330 335

Asn Ile Gly Pro Asp Gly Phe Gly Arg Phe Pro Ala Glu Ser Ile Arg

340 345 350

Arg Leu Glu Ala Met Gly Glu Trp Thr Lys Lys Asn Gly Glu Ala Val

355 360 365

Tyr Gly Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Glu Lys Pro Ser Trp Gly Arg Tyr

370 375 380

Thr Lys Lys Asp Gly Val Val Tyr Ala His Val Phe Glu Trp Pro Lys

385 390 395 400

Asp Gly Leu Leu Lys Leu Asn Lys Glu Ile Lys Ile Lys Lys Ala Thr

405 410 415

Val Leu Thr Asn Pro Asn Thr Val Leu Lys Ser Ile Ala Thr Ser Ala

420 425 430

Glu Val Leu Leu Asp Ile Pro Met Leu Ala Pro Asp Ala Thr Val Thr

435 440 445

Val Ile Lys Ile Glu Leu Ala Lys

450 455

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> Flavobacterium algicola

<400> 2

atgaagatag tacaaaggtt aagtattctg atattagtta caatattaaa tgtaaataca 60

ggtattgctc aaaacaaatc acaaaaagac aaactttcag atgatgagcg tatggcgtgg 120

tggcgcgatt caaaatttgg aatgtttatc cactggggtg cttactctat aattggtgga 180

gaacgtggta caaaaatcgc aggcggtggt gcagaatggg caatggataa attagattat 240

acaatcgaag attacgagaa gtttcctaaa atgttcaatc cgcaattatt tgatgcggat 300

gcttgggtga ctatggcaaa aaatgcaggg atgaagtata tcgtacttac ttcaaagcat 360

catgaaggat ttgcactttg ggattcgaag gtgtctaaat atgacatcat ggatacagca 420

ccttttaagc gtgatattgt taaggaacta gcagaagctt gtaaaaaaca aggcataaaa 480

ttctgtttgt attactctat agtagattgg catcatccac aagcgcaagg aaatttgtat 540

ccaaactata acatttctca gcatgatgac ccatcagttg ttaatcctga tttcccaaaa 600

tattatcaaa attacatgaa gcctcaagtg ggtgaattgt tgaagaacta tggtgatata 660

ggtgttgtat ggtttgatgg tgattggatt tcagattata ccacagagat gggtaaggac 720

ctttacaaat acatccgtga cattcagccc aacactattg tgaacaatag agtagataaa 780

ggaagaaccg gtatggacgg aatgaataat aagccaggtc aatttgcagg tgattttggt 840

actccagaac aagagattcc agatacggga attgacacag attgggaagc ttgcatgact 900

atgaacggaa cttggggcta taaaccatct gataacaaat ggaaaagtag tgaagattta 960

attcagaaat tagtagatat tgtatcaaaa ggaggtaact ttttattaaa cataggccct 1020

gatggtttcg gaagatttcc ggcagaaagc atcagacgtt tagaagcgat gggtgagtgg 1080

acaaagaaaa atggagaggc tgtttatggc gcttctgcaa gtccttacga aaaaccttcg 1140

tggggtcgat ataccaaaaa agatggagta gtgtatgcac atgtatttga atggccaaaa 1200

gatggattac taaaacttaa caaagaaatc aaaattaaaa aagcaacagt attaacaaat 1260

ccgaacactg ttttgaaatc gattgctact tctgctgagg ttttattaga cattcctatg 1320

ttggcacccg atgctactgt aacagttatt aaaattgagt tggctaaata a 1371

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gatccgaatt cgagctccgt atgcaaaaca aatcacaaaa agacaaac 48

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ctcagtggtg gtggtggtgg tgtttagcca actcaatttt aataac 46

Claims

1.一种α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.权利要求1所述的α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16在水解pNp-Fuc/制备二岩藻糖基乳糖中的应用。

4.一种水解pNp-Fuc/制备二岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16水解pNp-Fuc，制备二岩藻糖基乳糖。

5.根据权利要求4所述的水解pNp-Fuc/制备二岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于：水解的条件为：温度为25℃，pH为6.0；

或/和：制备二岩藻糖基乳糖的条件为：温度为25℃，pH为5.0。

6.一种重组表达载体，其携带有权利要求2所述的编码α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的基因。

7.一种表达α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的重组宿主，其基因组中包含权利要求2所述的编码α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16的基因。

8.权利要求7所述的重组宿主在制备α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16中的应用。

9.一种酶制剂，其特征在于：包含有权利要求1所述的α-L-岩藻糖苷酶OUCJdch-16。

10.权利要求9所述的酶制剂在水解pNp-Fuc/制备二岩藻糖基乳糖中的应用。