CN113637654A - 一种重组磷脂酶d突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用 - Google Patents

一种重组磷脂酶d突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组磷脂酶D突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用，属于生物工程技术领域。本发明先通过构建重组磷脂酶，所述重组磷脂酶是在来源于穗产色链霉菌的磷脂酶的基础上，在PLD的C端去掉信号肽并通过连接肽加上标签MBP获得的，所述重组磷脂酶突变体，是将重组磷脂酶的第379位、第169位、第185位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。本发明的重组磷脂酶突变体表现出较高的转磷脂酰活性，磷脂酰胆碱的转化率可达85.8％，磷脂酰丝氨酸产率可达72.12％，磷脂酰丝氨酸的产量可以达到57.69g/L。采用本发明的方法，提高了单位催化剂的生产能力和催化剂的反应效率，降低了反应的成本。

Description

一种重组磷脂酶D突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用
技术领域
本发明涉及一种重组磷脂酶D突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)是一种唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能的磷脂，对许多细胞代谢过程有重要的调节的作用，其主要功能是可提高脑细胞活力，对治疗脑萎缩、预防老年痴呆、改善老年人的大脑功能；同时修复大脑损伤、治疗儿童多动症具有非常明显的效果。自然界中天然的磷脂酰丝氨酸含量非常稀少，提取工艺繁杂，不足以满足人们的需求，因此制备纯度高、质量好的磷脂酰丝氨酸产品就有重要的意义。
磷脂酰丝氨酸的制备方法比较多，其中以提取法和酶转化法为主。生物酶法主要是指以磷脂酰胆碱(PC)和丝氨酸作为反应底物，在磷脂酶D(PLD)的催化作用下，发生转磷脂酰基反应生成磷脂酰丝氨酸。相对传统的溶剂萃取法，通过生物法制备磷脂酰丝氨酸具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备磷脂酰丝氨酸。
目前，磷脂酶D主要从大豆等植物或动物脑中分离提取得到或采用微生物发酵法，但采取提取分离的方法获得磷脂酶D，生产成本高，环境污染代价大，售价昂贵，不能满足市场的需求；而微生物发酵法，链霉菌发酵周期比较长(5-7天)，生产强度低，并不适用于工业生产；有研究表明磷脂酶D异源表达容易形成包涵体，且磷脂酶D对表达宿主的生长有抑制作用，导致分泌量很低，因此迫切需要一种能够提高磷脂酶D蛋白表达量的方法。
但是，天然的磷脂酶D除了具备磷脂酰转移活性—可将卵磷脂和丝氨酸转化为磷脂酰丝氨酸(PS)以外，还具备磷脂酰胆碱水解活性，在有水存在的环境中，磷脂酶D会催化水解卵磷脂产生磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)和胆碱。而酶催化生成PS的反应体系不可避免会有水的参与，这就导致部分卵磷脂不能成功转化为PS，从而在很大的程度上降低了PS的产率，增加制备的成本。
发明内容
本发明提供了一种重组磷脂酶D SrMBPPLD及其突变体，所述重组磷脂酶DSrMBPPLD的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示
所述重组磷脂酶DSrMBPPLD是在来源于穗产色链霉菌(Streptomycesracemochromogenes)的磷脂酶D SrPLD(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核酸序列如SEQID NO.2所示)的基础上，在PLD的C端去掉信号肽(所述信号肽的核酸序列如SEQ ID NO.6所示)并通过连接肽GSGGSG加上一段促溶标签MBP(所述促溶标签MBP的核酸序列如SEQ IDNO.5所示)，获得重组磷脂酶DSrMBPPLD。
本发明还提供了一种重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的重组磷脂酶D SrMBPPLD的第379位、第169位、第185位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
本发明所述的上述第379位、第169位、第185位的突变位点的编号，是按照重组磷脂酶DSrMBPPLD的原始来源磷脂酶D SrPLD的氨基酸序列去掉信号肽后的序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.7)进行编号的。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(f)任一：
(a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸得到的，突变体命名为Y379G；
(b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第169位的亮氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为L169R；
(c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第185位的色氨酸突变为天冬酰胺得到的，突变体命名为W185N；
(d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸，同时将169位的亮氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为Y379G/L169R；
(e)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸，同时将185位的色氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为Y379G/W185N；
(f)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸，第185位的色氨酸突变为天冬酰胺，同时将169位的亮氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为Y379G/L169R/W185N。
在本发明的一种实施方式中，所述重组磷脂酶D SrMBPPLD的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示
本发明还提供了一种编码上述重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以PET-28a为表达载体。
本发明还提供了携带上述基因，或上述重组载体的微生物细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述重组磷脂酶DSrMBPPLD突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主，以pET28a为表达载体。
本发明还提供了一种获得上述重组磷脂酶DSrMBPPLD突变体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在重组磷脂酶D SrMBPPLD氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带重组磷脂酶D SrMBPPLD基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；
(2)将含突变体的质粒载体转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化磷脂酶D SrMBPPLD。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明还提供了一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，所述方法为，
将上述重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体，或上述微生物细胞，或上述重组大肠杆菌添加至含有磷脂酰胆碱和L-丝氨酸的反应体系中，进行反应制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述的微生物细胞，或上述重组大肠杆菌在反应体系中添加的终浓度为10～60g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌在反应体系中添加的终浓度为20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述磷脂酰胆碱在反应体系中的终浓度为：10～80g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述L-丝氨酸在反应体系中的终浓度为：20～60g/L。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：在pH 5.5～8.0、30～50℃、条件下反应6～15h。
本发明还提供了上述重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述重组大肠杆菌在制备磷脂酰丝氨酸，或含有磷脂酰丝氨酸的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
有益效果
(1)本发明提供了一种重组磷脂酶D SrMBPPLD及其突变体，用于催化生产磷脂酰丝氨酸。本发明重组磷脂酶D SrMBPPLD实现了在Escherichia coli BL21(DE3)可溶性表达，解决了磷脂酶D在大肠杆菌中包涵体的问题，且转磷脂酰活性较对照组提高了2.01倍。
(2)本发明重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体转磷脂酰活性，相对于重组磷脂酶DSrMBPPLD提高了3.7～8.5倍。本发明突变体的催化半衰期(7.3h)和TTN(23800)较对照分别提高了3.5倍和1.98倍。且重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体表现出较高的转磷脂酰活性，在40℃、pH 6.0的条件下反应12h，磷脂酰胆碱的转化率可达85.8％，磷脂酰丝氨酸产率可达72.12％，磷脂酰丝氨酸的产量可以达到57.69g/L。采用本发明的方法，提高了单位催化剂的生产能力和催化剂的反应效率，降低了反应的成本，加快了酶转化法生产磷脂酰丝氨酸的工业化进程。
附图说明
图1：来源于穗色链霉菌磷的脂酶D SrPLD诱导表达的SDS-PAGE图；泳道M是指低分子量蛋白Marker；泳道0是空感受态细胞E.coli BL21(pET-28a)的蛋白条带；泳道1～3分别是25℃下0.2mM IPTG浓度诱导表达后上清液、沉淀和全细胞中所目的蛋白条带大小。
图2：重组磷脂酶D SrMBPPLD诱导表达的SDS-PAGE图；泳道M是指低分子量蛋白Marker；泳道0是空感受态细胞E.coli BL21(pET-28a)的蛋白条带；泳道1～3分别是促溶标签MBP在25℃下0.2mM IPTG浓度诱导表达后上清液、沉淀和全细胞中所目的蛋白条带大小。
图3：各突变体转化生成PS的摩尔转化率。
图4：反应底物及产物的液相检测图谱；其中，图A是PA、PS、PC标准品的色谱图；图B是反应0h磷脂酶D转化产物的色谱图；图C磷脂酶D转化生成PA、PS的色谱图。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的pMal-p2X、pET-28a(+)质量购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)，限制性内切酶、T4 DNA连接酶、primeSTAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。标品磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸均购自美国Sigma-Aldrich公司，其余试剂均为市场购买所得。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。
LB固体培养基：在LB液体培养基基础上，添加2％的琼脂。
TB液体培养基：KH2PO4 2.31g/L，K2HPO4·3H2O 16.42g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨12g/L，甘油4g/L。
配制pH6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液：0.2mol/L的乙酸和乙酸钠混合缓冲液，具体配方见《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，诸葛健主编)。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
磷脂酶D SrMBPPLD转磷脂酰酶活的检测：
将卵磷脂溶于乙酸乙酯中，配制成10mM的溶液，L-Ser溶于pH6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中，配制成3M的溶液，按照有机相：水相＝3:1的比例进行加入，混匀后加入0.1mL 15mMCaCl2溶液和10μL磷脂酶D液。37℃，400rpm震荡反应20min,反应后的反应液样品于12000rpm条件下离心5～10min，吸取上层有机相，挥发有机相后用流动相(正己烷/异丙醇/乙酸＝8/8/1)进行溶解后，过0.22μm有机膜，进行高相液相色谱法HPLC分析。
酶活力定义为：以卵磷脂/磷脂酰胆碱为反应底物，37℃条件下，每分钟生成1μmol磷脂酰丝氨酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位，记为U·mL-1。
磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)含量的检测：
以己酸乙酯作为有机相，乙酸-乙酸钠缓冲液作为水相，有机相与水相的比例为3:1的反应介质对全细胞转化磷脂酰胆碱和L-Ser生成磷脂酰丝氨酸的影响。转化的底物浓度为50g·L-1，全细胞浓度20g·L-1，于30℃、200rpm恒温摇床中反应12h。转化后的反应液样品于12000rpm条件下离心5～10min，吸取上层有机相，挥发有机相后用流动相(正己烷/异丙醇/乙酸＝8/8/1)进行溶解后，过0.22μm有机膜，进行高相液相色谱法HPLC分析(如图4所示)。
上述具体的高效液相色谱法HPLC分析方法为：
以
Figure BDA0003285486210000053
100DIOL(5μm，250×4mm)作为色谱柱，以经过抽滤、超声脱气的正己烷/异丙醇/乙酸(8/8/1，v/v/v)为流动相，进样量为20μL，柱温为30℃，紫外检测器的波长为210nm，流速为0.8mL/min，样品处理时间为15min。在此检测条件下，磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)的保留时间分别为7.448min、8.478min、10.557min。
Figure BDA0003285486210000051
Figure BDA0003285486210000052
其中：mPS/PA表示PS、PA的质量，g；mPC表示磷脂酰胆碱的初始质量，g；742、600和758分别表示PS、PA和PC的相对分子质量。
比酶活测定方法：采用上述HPLC法测PLD的酶活。1个单位的PLD的酶活，被定义为生成1μmol PS产物所需的酶量(U)。通过测定PS的含量即可计算酶活力。
比酶活定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数(U/mg蛋白)。
Figure BDA0003285486210000061
实施例1：SrPLD的表达与纯化
基因工程菌的构建及蛋白的表达：
以穗产色链霉菌Streptomyces racemochromogenes中目的蛋白编码基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2所示)为模板，利用F1和R1为引物(下划线分别是BamH I和EcoR I限制性酶切位点)PCR扩增，扩增条件为：95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃2min)，72℃5min。
F1：aaatgggtcgcggatccttggcacgcacc；
R1：gacggagctcgaattctcaggcctggcaga。
获得PLD基因编码区cDNA序列，PCR产物回收后与经同样双酶切的pET-28a(+)质粒载体通过同源重组连接，获得重组表达质粒pET-28a(+)-PLD，将重组质粒pET-28a(+)-PLD转化入E.coli BL21(DE3)，经过PCR鉴定，获得阳性的工程菌命名为E.coli BL21/pET-28a(+)-PL D。
将工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-PLD接入LB液体培养基，培养12h后得到种子液，将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的TB液体培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，25℃培养14h，诱导表达重组目的蛋白。取150mL诱导发酵液经6000r/min离心收集菌体。
结果如图1：泳道1～3分别是上清液、沉淀和全细胞中所含蛋白的条带大小，可见，SrP LD上清液蛋白表达量很低，几乎全部在沉淀中，由此说明，SrPLD在E.coli BL21异源表达几乎以包涵体的形式存在。
实施例2：重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD的构建及磷脂酶D SrMBPPLD的表达
(1)重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD的构建
为了解决SrPLD异源表达包涵体的问题，本课题组发现SrPLD含有一段信号肽序列(所述信号肽的核酸序列如SEQ ID NO.6所示)，所以要构建一个去除信号肽的重组质粒。以实施例1制备得到的重组质粒pET-28a(+)-PLD为模板，利用F2和R2为引物(下划线分别是BamH I和EcoR I限制性酶切位点)PCR扩增，扩增条件为：95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃2min)，72℃5min。
F2：atgggtcgcggatccgcttcgccga；
R2：gacggagctcgaattctcacgcttggcac。
PCR产物回收后与经同样双酶切的pET-28a(+)质粒载体通过同源重组连接，获得重组表达质粒pET-28a(+)-PLD0，将重组质粒pET-28a(+)-PLD0转化入E.coli BL21(DE3)，经过PCR鉴定，获得阳性的工程菌命名为E.coli BL21/pET-28a(+)-PLD0。
(2)以带有MBP核苷酸序列(SEQ ID NO.5所示)的pMal-p2X质粒为模板，利用F3和R3为引物PCR扩增(下划线是含有MBP的部分片段)，获得MBP基因编码区cDNA序列，扩增条件为：95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃1.5min)，72℃5min。
F3：gtggacagcaaatgggtcgcggatccatgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatct；
R3：aagtgcggcgtcggcgaagctccgctgccaccactcccagc。
以质粒pET-28a(+)-PLD0为模板，利用F4和R4为引物进行全质粒PCR扩增，获得全质粒片段的pET-28a(+)-PLD0，扩增条件为：95℃5min，29个循环(98℃10s，55℃15s，72℃7min)，72℃5min。
F4：gcgacccatttgctgtccac；
R4：gcttcgccgacgcc。
将上述获得的MBP基因编码区cDNA序列，PCR产物回收后与经同样全质粒PCR扩增获得pET-28a(+)-PLD0载体通过同源重组连接，获得重组表达质粒pET-28a(+)-SrMBPPLD，将重组质粒pET-28a(+)-SrMBPPLD转化入E.coli BL21(DE3)，经过PCR鉴定，获得阳性的工程菌命名为E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD。
将工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD接入LB液体培养基，培养12h后得到种子液，将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的TB液体培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，25℃培养14h，诱导表达重组目的蛋白。取150mL诱导发酵液经6000r/min离心收集菌体。
结果如图2：泳道1～3分别是上清液、沉淀和全细胞中所含蛋白的条带大小，可见，SrMBPPLD几乎在上清液中表达，且目的蛋白大小正确，由此说明重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD能够使SrMBPPLD在E.coli BL21异源表达。
实施例3：全细胞制备磷脂酰丝氨酸
在10mL小棕瓶中分别加入0.08g诱导培养后表达PLD蛋白的全细胞E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD或E.coli BL21/pET-28a(+)-PLD、0.24g L-丝氨酸、0.3g磷脂酰胆碱(PC)、1mL pH6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、3mL乙酸乙酯，于40℃、400rpm恒温摇床中反应12h，反应pH为6.0。转化后的反应液样品于12000rpm条件下离心5～10min，吸取上层有机相，挥发有机相后用流动相(正己烷/异丙醇/乙酸＝8/8/1)进行溶解后，过0.22μm有机膜后，进行高相液相色谱法HPLC分析。
分别对得到的E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD和E.coli BL21/pET-28a(+)-PLD进行全细胞制备磷脂酰丝氨酸，结果分别为：采用重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD进行全细胞转化制备磷脂酰丝氨酸的产量为：8.4g/L，PS转化率为：10.5％；采用重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-PLD进行全细胞转化制备磷脂酰丝氨酸的产量为：18.96g/L，PS转化率为：23.7％。
可以看出SrMBPPLD相对于SrPLD而言，PS转化率提高了99.7％。
实施例4：酶的表达纯化及转磷脂酰酶活性验证
具体步骤如下：
(1)粗酶液的制备
将从甘油管中保存的菌株E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD涂布于LB固体培养基上，在37℃下恒温培养至长出单克隆，挑取单克隆至新鲜的LB液体培养基中，以200rpm、37℃下恒温培养12h后得到种子液，将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的TB液体培养基，培养2h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于25℃下诱导培养14h，结束后收集细胞。
分别将发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10mL结合液A(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、20mM咪唑、1％甘油，用HCl调pH至7.4)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，分别得到粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。
(2)磷脂酶D的纯化
准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入超纯水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液B(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、500mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。
分别对纯化后的SrPLD和SrMBPPLD的纯酶液进行酶活的检测，结果如表1所示，可以看出SrMBPPLD相对于SrPLD而言，酶活提高了2.01倍，结合实例2的SrMBPPLD可溶性表达以及实例3全细胞制备PS的产率来看，总体而言，重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD效果要比E.coli BL21/pET-28a(+)-SrPLD好。
表1重组菌的酶活及其PS的转化率
Figure BDA0003285486210000091
实施例5：单突突变体的构建和筛选
具体步骤如下：
以实施例2构建得到的pET-28a(+)-SrMBPPLD为模板，设计SrMBPPLDY379G、SrMBPPLDL169R、SrMBPPLDW185N、SrMBPPLDF462G、SrMBPPLDN183S突变位点的引物，如表2所示，通过全质粒PCR进行突变体构建。
表2单突变体突变引物序列
Figure BDA0003285486210000092
构建反应PCR扩增体系：PrimSTAR酶0.5μL、5×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL每个突变位点的两条引物各1μL、，模板(SrMBPPLDwt)4μL、水32.5μL；反应条件为：①94℃3min；②98℃10s；③55℃30s；④72℃3min；⑤将②～④三个步骤循环29次；⑥72℃5min；⑦12℃保温。将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×T Buffer 5μL)，消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，化学转化法具体步骤：(1)将10μL同源重组产物导入100μLE.coli BL21(DE3)感受态细胞；(2)冰浴15-30min；(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；(4)加入800μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；(5)5000rpm离心2min收菌；(6)移去上清，剩余100-200μL吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素LB抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。(7)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。
分别制备得到基因工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDY379G、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDL169R、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDW185N、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDF462G、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDN183S。
随后将得到的上述基因工程菌按照实施例3的方法，进行全细胞转化制备磷脂酰丝氨酸，筛选出较好的突变体，结果如表3所示，工程菌E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDY379G、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDL169R、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDW185N催化PS的效果比较好，是野生型E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLD的1.36-1.54倍。
表3单突变体PS的转化率
Figure BDA0003285486210000101
实施例6:双突、三突的构建和筛选
(1)双突变体构建：
本实施例的双突变体是在相应的单突变体的基础上，按照表4中的引物，通过全质粒PCR进行双突突变体构建，例如，在突变体SrMBPPLDY379G的基础上，利用突变引物利用突变引物L169R-R和L169R-F(表1)，通过全质粒PCR进行双突突变体SrMBPPLDY379G/L169R构建。
基因工程菌的制备方法参见实施例2中步骤(1)，所用引物如表4所示，按照实施例4的方法，制备得到含有双突变体基因工程菌：E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDY379G/L169R、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDY379G/W185N、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDY379G/P249N、E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDY379G/K360Q。
表4双突变体突变引物序列
Figure BDA0003285486210000102
Figure BDA0003285486210000111
(2)双突变体的筛选：
将测序正确的的突变体菌株接种至LB种子培养基，200rpm、37℃培养培养10h，分别将种子液按照5％(v/v)的接种量，接种至新鲜的TB液体培养基，在200rpm、37℃培养至OD600＝0.8左右，加入终浓度为5g/L的乳糖诱导，诱导条件为200rpm、25℃诱导14h。
随后将得到的上述基因工程菌按照实施例3的方法，进行全细胞转化制备磷脂酰丝氨酸。
反应结束后，用HPLC方法进行测定PS的产量，结果如表5所示，含有突变体SrMBPPLDY379G/W185N基因工程菌和突变体SrMBPPLDY379G/L169R基因工程菌的效果最好，PS的转化率分别可以达到56.9％和59.8％。
表5双突变体PS的转化率
Figure BDA0003285486210000112
(3)三突突变体的构建：
在突变体SrMBPPLDY379G/L169R的基础上，利用突变引物利用突变引物W185N-R和W185N-F(表1)，通过全质粒PCR进行三突突变体构建，具体实施方式参见实施例2中步骤(1)，所用引物如表4所示，按照实施例4的方法，制备得到含有三突变体SrMBPPLDY379G /L169R/W185N基因工程菌：E.coli BL21/pET-28a(+)-SrMBPPLDY379G/L169R/W185N。按照实施例3的方法，进行全细胞转化制备磷脂酰丝氨酸；反应结束后，用HPLC方法进行测定PS的产量，含有三突变体SrMBPPLDY379G/L169R/W185N基因工程菌制备得到的PS的转化率为72.12％，相应的产量为57.69g/L。
(4)分别对上述实施例中得到的含有有益突变体的基因工程菌制备得到的PS的转化率进行汇总，如图3所示。
(5)突变体酶活的检测
对实施例4和5中得到的有益突变体进行了转磷脂酰酶活性验证，具体实施方式参见实施例4。分别对纯化后的各个突变体的纯酶液进行了酶活的检测，结果如表6所示。最佳的三突变体SrMBPPLDY379G/L169R/W185N酶活为25.17U·mL-1，相对于野生型SrMBPPLD(3.02U·mL-1)提高了8.5倍。
表6有益突变体的酶活数据
Figure BDA0003285486210000121
实施例7：亲本酶和突变体的性能测定
(1)动力学参数的测定
为了对有益突变体进行评价，本发明测定了突变亲本Q0及突变体Q1至Q6(具体含义如表7所示)在37℃下的动力学参数。kcat/Km通过37℃条件下测定不同浓度的水解磷脂酰胆碱所产生的醌亚胺类物质的初始利率计算。具体实施步骤参见文献On the effects ofsite-specific mutations on activity and expression of the Streptomyces PMFphospholipase D，J.Mol.Catal.B.Enzym.41(2006)1-7和《生物化学》(高等教育出版社，王镜岩主编)。结果如表7所示。
(2)催化半衰期的测定
由于转化反应是体内全细胞催化，因此进一步验证了体内反应的催化半衰期(指以PC和L-Ser为底物的催化反应过程中酶活剩余一半所需的时间)，通过转化过程中的残留酶活实验测定亲本酶和突变体的催化半衰期。
分别将含有SrMBPPLD亲本酶的基因工程菌和含有突变体的基因工程菌各以20g/L终浓度的湿细胞加入反应液中。以磷脂酰胆碱为底物，在整个转化过程中每隔1h测定它们的残留酶活(反应0h时的初始酶活设为100％)，共测定12h；结果如表7所示。
其中涉及的反应体系为：在10mL小棕瓶中分别加入0.08g制备得到的基因工程菌、0.24g L-丝氨酸、0.3g磷脂酰胆碱(PC)、1mL pH 6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、3mL乙酸乙酯，于40℃、400rpm恒温摇床中反应12h，反应pH为6.0。结果如表7所示。
(3)比酶活的检测
按照比酶活的检测方法，分别检测SrMBPPLD亲本酶及其突变体的比酶活数据。结果如表7所示。
(4)TTN(整体转换数)的计算
TTN是由生成的产品量和消耗的催化剂量决定，这种关系优势体现在均相催化中，叫做整体转换数。
采用HPLC法测TTN。通过测定PS的摩尔数以及消耗纯化蛋白的摩尔数即可计算TTN。
其中涉及到的反应体系：分别将纯化的SrMBPPLD亲本酶蛋白和含有突变体蛋白(制备方法同实施例4)分别以10μmol加入到反应液中。以磷脂酰胆碱为底物，在40℃、400rpm恒温摇床中反应20min，反应完毕后，用HPLC测定生成PS摩尔数。按照下列公式计算TTN，结果如表7所示。
Figure BDA0003285486210000131
表7 SrMBPPLD亲本酶及其突变体的动力学参数
Figure BDA0003285486210000132
结果显示，突变体的Km值较WT均有降低，其中三突变体的Km最低，说明三突变体对底物的亲和力有所增加。三突变体SrMBPPLDY379G/L169R/W185N的催化效率kcat/Km(1.53mM-1·s-1)比WT(0.79mM-1·s-1)提高93.7％。所有的突变体与Q0相比，催化半衰期均变长，其中Q6为7.3h，比Q0的2.1h变长了247％。与之一致的是各突变体的总转化数(TTN)与Q0相比均得到提高。Q6的TTN是23800为Q0的12000的1.98倍。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种重组磷脂酶D突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用
<130> BAA211258A
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 528
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Ala Arg Thr Val Arg Thr Thr Ala Leu Ser Leu Thr Leu Ser Phe
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Pro Ala Phe Ala Ala Ser Pro Thr Pro His
20 25 30
Leu Asp Ser Val Glu Gln Thr Leu Arg Gln Val Ser Pro Gly Leu Glu
35 40 45
Gly Ser Val Trp Glu Arg Thr Ala Gly Asn Ser Leu Gly Ala Ser Ala
50 55 60
Pro Gly Gly Ser Asp Trp Leu Leu Gln Thr Pro Gly Cys Trp Gly Asp
65 70 75 80
Pro Ser Cys Thr Asp Arg Pro Gly Ser Arg Arg Leu Leu Asp Lys Thr
85 90 95
Arg Gln Asp Ile Ala Gln Ala Arg Gln Ser Val Asp Ile Ser Thr Leu
100 105 110
Ala Pro Phe Pro Asn Gly Gly Phe Gln Asp Ala Val Val Ala Gly Leu
115 120 125
Lys Glu Ala Val Ala Lys Gly Asn Arg Leu Gln Val Arg Ile Leu Val
130 135 140
Gly Ala Ala Pro Ile Tyr His Ala Asn Val Ile Pro Ser Ser Tyr Arg
145 150 155 160
Asp Glu Met Val Ala Arg Leu Gly Pro Ala Ala Ala Asn Val Thr Leu
165 170 175
Asn Val Ala Ser Met Thr Thr Ser Lys Thr Gly Phe Ser Trp Asn His
180 185 190
Ser Lys Leu Val Val Val Asp Gly Gly Ser Val Ile Thr Gly Gly Ile
195 200 205
Asn Ser Trp Lys Asp Asp Tyr Leu Asp Thr Ala His Pro Val Asn Asp
210 215 220
Val Asp Leu Ala Leu Ser Gly Pro Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Tyr
225 230 235 240
Leu Asp Thr Leu Trp Asp Trp Thr Cys Arg Asn Lys Ser Ser Trp Ser
245 250 255
Ser Val Trp Phe Ala Ser Ser Asn Asn Ala Gly Cys Met Pro Thr Leu
260 265 270
Pro Arg Pro Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Asp Val Pro Ala Leu Ala
275 280 285
Val Gly Gly Leu Gly Val Gly Ile Arg Gln Ser Asp Pro Ala Ser Ala
290 295 300
Phe Lys Pro Val Leu Pro Thr Ala Pro Asp Thr Lys Cys Gly Ile Gly
305 310 315 320
Val His Asp Asn Thr Asn Ala Asp Arg Asp Tyr Asp Thr Val Asn Pro
325 330 335
Glu Glu Ser Ala Leu Arg Ala Leu Val Ala Ser Ala Asn Ser His Val
340 345 350
Glu Ile Ser Gln Gln Asp Leu Asn Ala Thr Cys Pro Pro Leu Pro Arg
355 360 365
Tyr Asp Ile Arg Leu Tyr Asp Thr Leu Ala Ala Lys Leu Ala Ala Gly
370 375 380
Val Lys Val Arg Ile Val Val Ser Asp Pro Ala Asn Arg Gly Ala Val
385 390 395 400
Gly Ser Asp Gly Tyr Ser Gln Ile Lys Ser Leu Asn Glu Val Ser Asp
405 410 415
Ala Leu Arg Gly Arg Leu Thr Ala Leu Thr Gly Asp Glu Arg Thr Ser
420 425 430
Lys Ala Ala Met Cys Gln Asn Leu Gln Leu Ala Thr Phe Arg Ala Ser
435 440 445
Asp Lys Ala Thr Trp Ala Asp Gly Lys Pro Tyr Ala Gln His His Lys
450 455 460
Leu Val Ser Val Asp Asp Ser Ala Phe Tyr Ile Gly Ser Lys Asn Leu
465 470 475 480
Tyr Pro Ser Trp Leu Gln Asp Phe Gly Tyr Val Val Glu Ser Pro Ala
485 490 495
Ala Ala Asn Gln Leu Lys Asp Ser Leu Leu Ala Pro Gln Trp Lys Tyr
500 505 510
Ser Gln Ala Thr Ala Thr Tyr Asp Tyr Ala Arg Gly Leu Cys Gln Ala
515 520 525
<210> 2
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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gcagcacctg cattcgcggc ttcgccgacg ccgcacttag actccgtaga gcaaacgctg 120
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ggagcttccg cgcctggcgg gtcggactgg ctgcttcaaa cacccggctg ttggggtgat 240
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gcgcaggcac gccaatcagt tgacatttcc actcttgcac cttttccgaa tggagggttc 360
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atgaccacta gcaaaaccgg gttctcttgg aaccacagca agcttgtcgt agtagacggc 600
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ttggacacac tttgggattg gacgtgccgc aacaagtcct catggagtag tgtgtggttt 780
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<210> 3
<211> 875
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac tgggagtggt ggcagcggag cttcgccgac gccgcactta 1140
gactccgtag agcaaacgct gcgccaagtc tctcctggct tggaagggag tgtttgggaa 1200
cgtacagcag gaaattccct tggagcttcc gcgcctggcg ggtcggactg gctgcttcaa 1260
acacccggct gttggggtga tccttcatgc acggatcgtc caggttcccg ccgcttgctg 1320
gataagaccc gtcaagatat tgcgcaggca cgccaatcag ttgacatttc cactcttgca 1380
ccttttccga atggagggtt ccaagacgcc gtcgttgccg ggttgaaaga ggccgttgcc 1440
aaaggtaacc gtcttcaagt ccgcatttta gtgggtgcgg ctccaattta tcatgcgaat 1500
gtaattccat cctcctaccg cgacgagatg gttgcccgct tgggaccggc ggccgctaat 1560
gttaccttga acgtggcgtc gatgaccact agcaaaaccg ggttctcttg gaaccacagc 1620
aagcttgtcg tagtagacgg cggatcagtc atcacaggag gaattaattc ctggaaggac 1680
gactacttgg ataccgcgca tcctgtgaat gacgtggact tggcattaag tggacctgca 1740
gcgggaagcg ccggacgcta cttggacaca ctttgggatt ggacgtgccg caacaagtcc 1800
tcatggagta gtgtgtggtt tgcttcctcc aacaacgcgg gctgtatgcc aacgttgccc 1860
cgtccagctg cgccggccgg aggaggtgac gtgccggctt tagcggttgg cggtttaggc 1920
gtaggaatcc gtcaaagtga ccctgcctca gcattcaagc ccgttcttcc cacggcacca 1980
gatactaagt gcggaatcgg tgtacacgat aatacgaatg cagaccgtga ctatgatacg 2040
gtcaacccgg aggaaagcgc cctgcgcgcc ttggtcgctt ctgctaactc ccacgtggag 2100
attagccagc aggatttaaa cgccacatgc cccccactgc cgcgttacga catccgcttg 2160
tacgatacat tagcagccaa actggcagca ggggttaaag ttcgcatcgt ggtgtcagac 2220
ccggctaacc gtggagctgt tggatctgat ggatattcgc agattaaatc gcttaacgaa 2280
gtatccgacg cgttgcgtgg acgtcttacg gcattaacgg gtgacgagcg tacctccaag 2340
gctgctatgt gccaaaatct tcaactggcg acgtttcgtg cctccgataa agcgacctgg 2400
gccgatggaa aaccctatgc tcaacaccac aaacttgtgt ctgttgacga cagtgcgttc 2460
tacattgggt ctaaaaacct ttacccttcg tggcttcagg attttggtta tgtagttgag 2520
tctccggcag ccgcgaacca gcttaaggat agtttgcttg ccccgcagtg gaaatattcg 2580
caggctacgg caacctatga ctacgcgcgt gggttgtgcc aagcgtga 2628
<210> 5
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60
ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120
ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180
atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240
accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300
aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360
gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420
aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480
ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540
gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600
aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660
ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720
gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780
ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840
ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900
ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggtga aagatccgcg tattgccgcc 960
actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020
tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080
gccctgaaag acgcgcagac t 1101
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atggcgcgta cggtacgtac caccgcctta tcgctgacct tgtcattcgc tttactgccg 60
gcagcacctg cattcgcg 78
<210> 7
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ala Ser Pro Thr Pro His Leu Asp Ser Val Glu Gln Thr Leu Arg Gln
1 5 10 15
Val Ser Pro Gly Leu Glu Gly Ser Val Trp Glu Arg Thr Ala Gly Asn
20 25 30
Ser Leu Gly Ala Ser Ala Pro Gly Gly Ser Asp Trp Leu Leu Gln Thr
35 40 45
Pro Gly Cys Trp Gly Asp Pro Ser Cys Thr Asp Arg Pro Gly Ser Arg
50 55 60
Arg Leu Leu Asp Lys Thr Arg Gln Asp Ile Ala Gln Ala Arg Gln Ser
65 70 75 80
Val Asp Ile Ser Thr Leu Ala Pro Phe Pro Asn Gly Gly Phe Gln Asp
85 90 95
Ala Val Val Ala Gly Leu Lys Glu Ala Val Ala Lys Gly Asn Arg Leu
100 105 110
Gln Val Arg Ile Leu Val Gly Ala Ala Pro Ile Tyr His Ala Asn Val
115 120 125
Ile Pro Ser Ser Tyr Arg Asp Glu Met Val Ala Arg Leu Gly Pro Ala
130 135 140
Ala Ala Asn Val Thr Leu Asn Val Ala Ser Met Thr Thr Ser Lys Thr
145 150 155 160
Gly Phe Ser Trp Asn His Ser Lys Leu Val Val Val Asp Gly Gly Ser
165 170 175
Val Ile Thr Gly Gly Ile Asn Ser Trp Lys Asp Asp Tyr Leu Asp Thr
180 185 190
Ala His Pro Val Asn Asp Val Asp Leu Ala Leu Ser Gly Pro Ala Ala
195 200 205
Gly Ser Ala Gly Arg Tyr Leu Asp Thr Leu Trp Asp Trp Thr Cys Arg
210 215 220
Asn Lys Ser Ser Trp Ser Ser Val Trp Phe Ala Ser Ser Asn Asn Ala
225 230 235 240
Gly Cys Met Pro Thr Leu Pro Arg Pro Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly
245 250 255
Asp Val Pro Ala Leu Ala Val Gly Gly Leu Gly Val Gly Ile Arg Gln
260 265 270
Ser Asp Pro Ala Ser Ala Phe Lys Pro Val Leu Pro Thr Ala Pro Asp
275 280 285
Thr Lys Cys Gly Ile Gly Val His Asp Asn Thr Asn Ala Asp Arg Asp
290 295 300
Tyr Asp Thr Val Asn Pro Glu Glu Ser Ala Leu Arg Ala Leu Val Ala
305 310 315 320
Ser Ala Asn Ser His Val Glu Ile Ser Gln Gln Asp Leu Asn Ala Thr
325 330 335
Cys Pro Pro Leu Pro Arg Tyr Asp Ile Arg Leu Tyr Asp Thr Leu Ala
340 345 350
Ala Lys Leu Ala Ala Gly Val Lys Val Arg Ile Val Val Ser Asp Pro
355 360 365
Ala Asn Arg Gly Ala Val Gly Ser Asp Gly Tyr Ser Gln Ile Lys Ser
370 375 380
Leu Asn Glu Val Ser Asp Ala Leu Arg Gly Arg Leu Thr Ala Leu Thr
385 390 395 400
Gly Asp Glu Arg Thr Ser Lys Ala Ala Met Cys Gln Asn Leu Gln Leu
405 410 415
Ala Thr Phe Arg Ala Ser Asp Lys Ala Thr Trp Ala Asp Gly Lys Pro
420 425 430
Tyr Ala Gln His His Lys Leu Val Ser Val Asp Asp Ser Ala Phe Tyr
435 440 445
Ile Gly Ser Lys Asn Leu Tyr Pro Ser Trp Leu Gln Asp Phe Gly Tyr
450 455 460
Val Val Glu Ser Pro Ala Ala Ala Asn Gln Leu Lys Asp Ser Leu Leu
465 470 475 480
Ala Pro Gln Trp Lys Tyr Ser Gln Ala Thr Ala Thr Tyr Asp Tyr Ala
485 490 495
Arg Gly Leu Cys Gln Ala
500

Claims (10)

1.一种重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQID NO.3所示的重组磷脂酶D SrMBPPLD的第379位、第169位、第185位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
2.如权利要求1所述的重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体，其特征在于，所述突变体为以下(a)～(f)任一：
(a)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸得到的，突变体命名为Y379G；
(b)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第169位的亮氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为L169R；
(c)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第185位的色氨酸突变为天冬酰胺得到的，突变体命名为W185N；
(d)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸，同时将169位的亮氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为Y379G/L169R；
(e)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸，同时将185位的色氨酸突变为天冬酰胺得到的，突变体命名为Y379G/W185N；
(f)将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的磷脂酶D SrMBPPLD的第379位的酪氨酸突变为甘氨酸，第185位的色氨酸突变为天冬酰胺，同时将169位的亮氨酸突变为精氨酸得到的，突变体命名为Y379G/L169R/W185N。
3.编码权利要求1或2所述的重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.携带权利要求3所述基因，或权利要求4所述的重组载体的微生物细胞。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，表达了权利要求1或2所述的重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体。
7.如权利要求6所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主，以pET28a为表达载体。
8.一种磷脂酰丝氨酸的制备方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的重组磷脂酶DSrMBPPLD突变体，或权利要求5所述的微生物细胞，或权利要求6或7所述的重组大肠杆菌添加至含有磷脂酰胆碱和L-丝氨酸的反应体系中，进行反应制备得到。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体在反应体系中添加的终浓度为10～40g/L。
10.权利要求1或2所述的重组磷脂酶D SrMBPPLD突变体，或权利要求3所述的基因，或权利要求4所述的重组载体，或权利要求5所述的重组细胞，或权利要求6或7所述的重组大肠杆菌在制备磷脂酰丝氨酸，或含有磷脂酰丝氨酸的产品中的应用。
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