CN108949721A - 表达磷脂酶d的重组菌株及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷脂酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及一种编码磷脂酶D的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一种通过系统改造表达元件提高磷脂酶D表达水平的方法，该方法包括对信号肽、核糖体结合位点以及启动子的筛选与替换，构建的重组质粒转化至宿主菌中，重组菌株可成功表达磷脂酶D。本发明的磷脂酶D具有良好的转磷脂酰基能力，能以卵磷脂和L‑丝氨酸为底物合成产物磷脂酰丝氨酸。重组菌酶活稳定性较好，发酵周期短，为大规模工业化生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种表达磷脂酶D的重组菌株及应用。
背景技术
磷脂酰丝氨酸是一种调节膜蛋白功能状态的磷脂，在动植物组织中均有发现，已被用作食品添加剂以预防老年痴呆。因为它在改善记忆，预防肌肉疼痛，治疗抑郁症等方面都有积极作用，磷脂酰丝氨酸近年来受到了广泛关注。通常情况下，人们可从动植物组织中通过提取分离的方法获得磷脂酰丝氨酸，也可以利用一系列的化学反应合成磷脂酰丝氨酸。但是由于动物细胞和植物组织中磷脂酰丝氨酸含量少，且分离提取过程会造成磷脂酰丝氨酸的损失，导致最终获得的磷脂酰丝氨酸得率较低；且化学合成磷脂酰丝氨酸需要经过一系列复杂的化学反应，过程繁琐且污染环境。由磷脂酶D(PLD)介导的磷脂酰基转移反应是一种有效合成磷脂酰丝氨酸的方法。由于其转化率高，反应条件温和，绿色环保等优点，目前通过酶法合成磷脂酰丝氨酸正逐步得到重视。
磷脂酶D(EC 3.1.4.4)广泛存在于多种生物体中，包括哺乳动物、植物、酵母和细菌中。磷脂酶D目前已成为合成和修饰磷脂的重要工具。由磷脂酶D合成的一些稀有磷脂已成为商业化的实验室试剂，磷脂酰丝氨酸由于其已知的多种功能已作为食品添加剂销售。最近，有人提出，各种结构和功能相关的磷脂酶D构成了磷脂酶D超家族，该超家族包括哺乳动物，植物和细菌磷脂酶D。超家族成员具有如下共同的特征：两个高度保守的序列，HxKxxxxD(x代表任意氨基酸残基；定义为HKD模体)，它们被认为是磷脂酶D的活性中心。来自链霉菌属的Streptomyces sp.PMF PLD(PMF-PLD)的三级结构已被解析，这是第一个已知三级结构的磷脂酶D序列，其催化机理也被进一步研究。催化通过两步(乒乓机制)反应进行。首先，第一个HKD基序上的组氨酸亲核攻击磷脂酰胆碱上的P-O键，形成磷脂酰基酶中间体。然后，第二个HKD上的组氨酸激活进入的受体醇，被激活的受体醇攻击过渡态中间物形成产物磷脂酰丝氨酸(China Oils&Fats.2016,41,80-84)。
目前已有研究报道了磷脂酶D的异源表达，最常用的宿主是大肠杆菌Escherichiacoli。Zambonelli等人将来自于链霉菌属的磷脂酶D基因在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysE中表达，通过IPTG诱导测定其酶活性约为0.005U/mL(Enzyme and MicrobialTechnology.2003,33,676-688)。在食品工业中，枯草芽孢杆菌被认为是安全的(GRAS)表达宿主，并且具有高效胞外分泌系统，蛋白表达至胞外可大大简化下游纯化加工过程。Lu等人在枯草芽孢杆菌DB104中表达来自大肠杆菌K12的磷脂酶D编码基因，重组磷脂酶D活性为1.50U/mL(China Biotechnology.2008,28,56-60)。谷氨酸棒杆菌是一种单细胞膜革兰氏阳性菌，同样被认定为GRAS的菌株，由于其靶蛋白的分泌效率，分泌蛋白的产量和稳定性以及低的胞外水解酶活性，目前已成为表达外源蛋白质的优质宿主。
目前国内外关于磷脂酶D的研究多处于对菌株分离筛选、磷脂酶D的分离纯化以及理化性质的研究阶段，在分子生物学方面，相关基因的克隆与表达研究还相对较少。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种表达磷脂酶D的重组菌株及应用，本发明通过信号肽、RBS和启动子改造来实现磷脂酶D的高效分泌表达，提供包含本发明基因的重组质粒及包含该重组质粒的宿主细胞，以及利用重组菌株生产磷脂酰丝氨酸的方法。
本发明的第一个目的是提供一种磷脂酶D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码上述磷脂酶D的基因序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明的第三个目的是提供包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
本发明的第四个目的是提供一种表达磷脂酶D的重组质粒，包括SEQ ID NO.2所示的基因序列、使磷脂酶D胞外表达的信号肽基因、用于表达磷脂酶D的核糖体结合位点、用于表达磷脂酶D的启动子，其中，信号肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，构建上述重组质粒所用的出发质粒为pDXW-10a，其核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
本发明一具体实施例中，重组质粒pDXW-wrpld4的构建方法包括以下步骤：
(1)以含有磷脂酶D编码基因的质粒为模板，利用引物PCR扩增磷脂酶D编码基因；以B.subtilis168基因组为模板，利用携带有RBS的引物PCR扩增信号肽序列，利用融合PCR技术将含有RBS的信号肽序列和磷脂酶D编码基因序列融合；以B.subtilis168基因组为模板，设计引物，扩增启动子序列；
(2)将pDXW-10多克隆位点上的Kpn I酶切位点GGTACC突变为GGAACC，并在tac-M启动子前设计Kpn I酶切位点，得到pDXW-10a质粒；
(3)将步骤(1)得到的扩增产物克隆至pDXW-10a质粒中构建重组质粒。
本发明通过信号肽、RBS和启动子改造来实现磷脂酶D的高效分泌表达。
本发明的第五个目的是提供一种表达磷脂酶D的重组菌株，重组菌株中导入上述表达磷脂酶D的重组质粒。
进一步地，重组质粒的宿主菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、毕赤酵母Pichia pastoris或谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum。
进一步地，表达磷脂酶D的重组菌株的构建方法包括以下步骤：
将表达磷脂酶D的重组质粒电转化入宿主菌，然后于含卡那霉素抗性的固体种子培养基中，在20-60℃(优选为25-35℃)下培养培养0.5-5天(优选为2-4天)至转化子长出，筛选出阳性转化子，然后将阳性转化子接种至含卡那霉素抗性的液体种子培养基中培养至OD562值为10-40(优选为20-30)。
本发明的第六个目的是公开上述重组菌株在生产磷脂酰丝氨酸中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，包括以下步骤：
利用上述生产磷脂酶D的重组菌株所产生的生产磷脂酶D催化底物大豆卵磷脂和丝氨酸的反应，在30-70℃条件下反应2-30h，得到磷脂酰丝氨酸。
进一步地，反应在Ca2+存在的条件下进行。
进一步地，Ca2+的浓度为0.5-40mM(优选为10-20mM，更优选为15mM)。
进一步地，大豆卵磷脂和丝氨酸的浓度比为1:1-1:8(优选为1:4-1:6，更优选为1:5)。
进一步地，反应在有机-水相的混合体系中进行，有机相和水相体积比为4:1-4:4。
进一步地，有机相为正己烷、乙酸乙酯、氯仿、乙醚和甲苯中的一种或几种。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种新的磷脂酶D，同时提供了一种通过系统改造表达元件提高磷脂酶D表达水平的方法，构建了表达磷脂酶D的重组表达载体、重组菌株，同时提供了一种新的生产磷脂酰丝氨酸的方法。本发明所构建的重组菌株表现出磷脂酶D活性，可成功表达磷脂酶D，酶活达到1.9U/mL，相较于未改造的出发菌株，酶活提高了7.6倍。本发明的磷脂酶D具有良好的转磷脂酰基能力，能以卵磷脂和L-丝氨酸为底物合成产物磷脂酰丝氨酸。重组菌酶活稳定性较好，发酵周期短，为大规模工业化生产奠定了基础具有良好的转酰基能力，在磷脂酰丝氨酸的生物合成领域具有潜在应用价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是PCR扩增磷脂酶D编码基因的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bp DNA标记物；泳道1：扩增得到的磷脂酶D基因。
图2是PCR扩增含有RBS位点的WapA信号肽编码基因核酸电泳图谱。泳道M：500bpDNA Marker；泳道1：扩增得到的WapA基因。
图3是PCR融合磷脂酶D编码基因和含有RBS的WapA信号肽编码基因的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bp DNA Marker；泳道1：扩增得到的融合基因。
图4是PCR扩增pWapA启动子基因核酸电泳图谱。泳道M：500bp DNA Marker；泳道1：扩增得到的pWapA基因。
图5为双酶切后的wrpld4片段。泳道M：1,0000bp DNA Marker；泳道1：双酶切后的目的基因。
图6为通过两次一步反向PCR后获得的pDXW-10a质粒双酶切后的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bp DNA Marker；泳道1：双酶切后的pDXW-10a质粒基因。
图7为扩增验证pDXW-wrpld4质粒上wrpld4片段的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bpDNA Marker；泳道1：扩增得到的wrpld4片段。
图8为双酶切验证重组质粒pDXW-wrpld4的核酸电泳图谱。泳道M：1,0000bp DNAMarker；泳道1：双酶切后的pDXW-10a质粒和wrpld4片段。
图9为磷脂酶D在枯草芽孢杆菌，毕赤酵母，谷氨酸棒杆菌中胞内表达的酶活测试结果。
图10为磷脂酶D在枯草芽孢杆菌，毕赤酵母，谷氨酸棒杆菌中胞外分泌表达的酶活测试结果。
图11为重组菌C.glutamicum ATCC13032/pDXW-wrpld4的SDS-PAGE图谱。泳道1：蛋白Marker；泳道2：空白对照；泳道3：磷脂酶D的蛋白条带。
图12为不同条件下所生产的磷脂酰丝氨酸的转化率测试结果。
图13为磷脂酶D催化底物卵磷脂和L-丝氨酸产生磷脂酰丝氨酸的HPLC检测图谱。a：磷脂酰丝氨酸标样；b：转化液样品磷脂酰丝氨酸分析结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本发明提供了一种磷脂酶D，包括541个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该磷脂酶D的基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，全长1,623个核苷酸。
本发明还提供了一种表达磷脂酶D的重组质粒，包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列、使磷脂酶D胞外表达的信号肽基因、用于表达磷脂酶D的核糖体结合位点、用于表达磷脂酶D的启动子，其中，信号肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，全长96个核苷酸，编码32个氨基酸；核糖体结合位点(RBS)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，共15个核苷酸；启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，全长372个核苷酸。
实施例2
本实施例提供了重组质粒pMA5-pld的构建及其在枯草芽孢杆菌中的表达方法，具体步骤如下：
(1)磷脂酶D编码序列的扩增
以含有磷脂酶D编码基因的重组质粒pET-28a(+)-spld为模板，设计引物(P1、P2)扩增磷脂酶D编码序列：
引物P1：5’-CGGGATCCATGGCACGTCATCCGC-3’(BamHI)
引物P2：5’-CGACGCGTTTAATCCTGACAAATA-3’(MluI)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，58.4℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(1)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基(Ampr)，37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证，验证正确的进行序列测定。
(2)重组质粒pMA5-pld的构建
将pMA5质粒和步骤(1)得到的验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用BamH I和Mlu I进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至LB液体培养基(Ampr),37℃，220rpm培养10～12h，提取质粒后进行PCR验证。
(3)重组质粒pMA5-pld转化B.subtilisWB600
将步骤(2)中的重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，将序列正确的重组质粒命名为pMA5-pld，转化到B.subtilisWB600中。重组菌株在TB培养基中培养36h。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10分钟，菌体重悬于4mL缓冲液(40mM Tris-HCl，0.1％(v/v)TritonX-100,15mM CaCl2)。在冰浴条件下用超声波破碎器破碎，离心后收集上清液进行活性测定，重组菌株B.subtilisWB600/pMA5-pld的酶活为0.14U/mL。
实施例3
本实施例提供了重组质粒pMA5-npld的构建及其在枯草芽孢杆菌中的表达方法，具体步骤如下：
(1)NprB信号肽序列的扩增
以B.subtilis168基因组为模板，设计引物(P3、P4)扩增NprB信号肽序列：
引物P3：5’-CGGGATCCCGCAACTTGACCAAGAC-3’(BamH I)
引物P4：5’-TTGCGCGGATGACGTGCCATAGCAGCTGAGGCATGTGTTA-3’
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，54.6℃退火30s，72℃延伸0.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)磷脂酶D编码序列的扩增
以含有磷脂酶D编码基因的重组质粒pET-28a(+)-spld为模板，设计引物(P5、P6)扩增磷脂酶D编码序列：
引物P5：5’-TAACACATGACTAGCAGCTATGGCACGTCATCCGCGCA-3’
引物P6：5’-CGACGCGTTTAATCCTGACAAATA-3’(Mlu I)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(3)通过融合PCR融合磷脂酶D基因和NprB信号肽序列
以割胶回收纯化的磷脂酶D序列和NprB信号肽序列为模板，以P3、P6为引物融合两段序列：
引物P3：5’-CGGGATCCCGCAACTTGACCAAGAC-3’(BamH I)
引物P6：5’-CGACGCGTTTAATCCTGACAAATA-3’(Mlu I)
融合过程分为两轮PCR反应。第一轮：PCR扩增反应在47μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，19μL ddH2O，磷脂酶D和WapA模板各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共8个循环；72℃终延伸10min。第二轮：PCR扩增反应在50μL体系中进行，在第一轮的反应体系中加入引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，56.2℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(3)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基中(Ampr)，在37℃，220rpm条件下培养10～12h，提取质粒后对质粒PCR验证。
(4)重组质粒pMA5-npld的构建
将pMA5质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用BamH I和Mlu I进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒，将重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，将序列正确的重组质粒命名为pMA5-npld。
(5)重组质粒pMA5-npld转化B.subtilisWB600
将步骤(4)中的重组质粒转化到B.subtilisWB600中。将重组菌株在TB培养基中培养36h。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min。取含有磷脂酶D的发酵上清液进行酶活测定，重组菌株B.subtilisWB600/pMA5-pld的酶活为0.16U/mL。
实施例4
本实施例提供了重组质粒pPIC3.5K-pld的构建及其在毕赤酵母中的表达方法，具体步骤如下：
(1)磷脂酶D编码序列的扩增
以含有磷脂酶D编码基因的重组质粒pET-28a(+)-spld为模板，设计引物(P7、P8)扩增磷脂酶D编码序列：
引物P7：5’-CGGGATCCATGGCACGTCATCCGC-3’(BamHI)
引物P8：5’-CGGAATTCTTAATCCTGACAAATA-3’(EcoRI)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，58.4℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(1)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基中(Ampr)，在37℃，220rpm条件下培养10～12h，提取质粒后对质粒PCR验证，验证正确的进行序列测定。
(2)重组质粒pPIC3.5K-pld的构建
将pPIC3.5K质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用BamH I和EcoRI进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒。
(3)重组质粒pPIC3.5K-pld转化P.pastoris GS115
将步骤(2)中的重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，序列正确的重组质粒命名为pPIC3.5K-pld。用Sal I限制性内切酶使其线性化后以1500v，5ms的电转条件转化P.pastorisGS115。电转液涂布在MD培养基中，在30℃恒温培养箱中倒置培养至转化子长出后，将它们转移到不同G418硫酸盐抗生素浓度的YPD固体培养基上继续培养三天，以在高浓度抗生素的平板上筛选出高拷贝菌株。将重组菌株接种于10mL YPD培养基中于30℃培养12h后并接种至BMGY培养基。培养24h后，通过以4500rpm离心10min收获细胞并重悬于BMMY培养基。每24h向培养液中加入终浓度为5g/L的甲醇进行诱导，诱导96h后将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min。重悬于4mL缓冲液(40mM Tris-HCl，0.1％(v/v)TritonX-100,15mM CaCl2)。在冰浴条件下，用超声波破碎器破碎，离心后收集上清液进行活性测定，重组菌株P.pastoris GS115/pPIC3.5K-pld的酶活为0.22U/mL。
实施例5
本实施例提供了重组质粒pPIC9K-pld的构建及其在毕赤酵母中的表达方法，具体步骤如下：
(1)磷脂酶D编码序列的扩增
以含有磷脂酶D编码基因的重组质粒pET-28a(+)-spld为模板，设计引物(P9、P10)扩增磷脂酶D编码序列：
引物P9：5’-CGGAATTCATGGCACGTCATCCGCGCAAA-3’(EcoRI)
引物P10：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATCCTGACAAAT-3’(NotI)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(1)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基中(Ampr)，在37℃，220rpm的条件下培养10～12h，提取质粒后对质粒PCR验证，验证正确的进行序列测定。
(2)重组质粒pPIC9K-pld的构建
将pPIC9K质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用EcoRI和NotI进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含氨苄青霉素抗性(100mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm条件下培养10～12h后提取质粒。
(3)重组质粒pPIC9K-pld转化P.pastoris GS115
将步骤(2)中的重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，序列正确的重组质粒命名为pPIC9K-pld，用Sal I限制性内切酶使其线性化后以1500v，5ms的电转条件转化P.pastorisGS115。电转液涂布在MD培养基中，在30℃恒温培养箱中倒置培养至转化子长出后，将它们转移到不同G418硫酸盐抗生素浓度的YPD固体培养基上继续培养三天，以在高浓度抗生素的平板上筛选出高拷贝菌株。将重组菌株接种于10mL YPD培养基中于30℃培养12h后并接种至BMGY培养基。培养24h后，通过以4500rpm离心10min收获细胞并重悬于BMMY培养基。每24h向培养液中加入终浓度为5g/L的甲醇进行诱导，诱导96h后将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min。取含有磷脂酶D的发酵上清液进行酶活测定，重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-pld的酶活为0.41U/mL，低于胞内表达的磷脂酶D酶活。
实施例6
本实施例提供了重组质粒pDXW-pld的构建及其在谷氨酸棒杆菌中的表达方法，具体步骤如下：
(1)磷脂酶D编码序列的扩增
以含有磷脂酶D编码基因的重组质粒pET-28a(+)-spld为模板，设计引物(P11、P12)扩增磷脂酶D编码序列：
引物P11：5’-CGGAATTCATGGCACGTCATCCGCGCAAA-3’(EcoRI)
引物P12：5’-CCAAGCTTTTAATCCTGACAAATACCGCG-3’(HindⅢ)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，57.2℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(1)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基中(Kanr)，在37℃，220rpm的条件下培养10～12h，提取质粒后对质粒PCR验证，验证正确的进行序列测定。
(2)重组质粒pDXW-pld的构建
将pDXW-10质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用EcoRI和HindⅢ进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒。
(3)重组质粒pDXW-pld转化C.glutamicum ATCC 13032
将步骤(2)中的重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，序列正确的重组质粒命名为pDXW-pld。重组质粒以1900V，5ms的电转条件转化C.glutamicum ATCC 13032。涂布于含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体种子培养基，在30℃培养箱倒置培养三天至转化子长出，通过PCR验证筛选阳性转化子，接种至含卡那霉素抗性(50mg/L)的液体种子培养基中培养至OD562＝25。。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min。重悬于4mL缓冲液(40mMTris-HCl，0.1％(v/v)TritonX-100,15mM CaCl2)。在冰浴条件下，用超声波破碎器破碎，离心后收集上清液进行活性测定。重组菌株C.glutamicum ATCC 13032/pDXW-pld酶活为0.25U/mL。
实施例7
本实施例提供了重组质粒pDXW-pld4的构建及其在谷氨酸棒杆菌中的表达方法，具体步骤如下：
(1)以含有磷脂酶D编码基因的重组质粒pET-28a(+)-spld为模板，设计引物(P13、P14)扩增磷脂酶D编码序列:
引物P13：5’-AGCCGATGTACTAGCAGCTATGGCACGTCATCCGCGCA-3’
引物P14：5’-CCAAGCTTTTAATCCTGACAAATACCGCG-3’(HindⅢ)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)以B.subtilis168基因组为模板，设计引物(P15、P16)扩增WapA信号肽序列：
引物P15：5’-CGGAATTCTGAAAAAAAGAAAGAGG-3’(EcoRⅠ)
引物P16：5’-TTGCGCGGATGACGTGCCATAGCAGCTGCTAGTACATCGGCT-3’
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸0.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(3)以割胶回收纯化的磷脂酶D序列和WapA信号肽序列为模板，以P14、P15为引物融合两段序列：
引物P14：5’-CCAAGCTTTTAATCCTGACAAATACCGCG-3’(HindⅢ)
引物P15：5’-CGGAATTCAAAAAAAGAAAGAGG-3’(EcoRⅠ)
融合过程分为两轮PCR反应。第一轮：PCR扩增反应在47μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，19μL ddH2O，磷脂酶D和WapA模板各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共8个循环；72℃终延伸10min。第二轮：PCR扩增反应在50μL体系中进行，在第一轮的反应体系中加入引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(3)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基中(Kanr)，在37℃，220rpm的条件下培养10～12h，提取质粒后对质粒PCR验证，验证正确的进行序列测定。
(4)重组质粒pDXW-pld4的构建
将pDXW-10质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用EcoRI和HindⅢ进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒。
(5)重组质粒pDXW-pld4转化C.glutamicum ATCC 13032
将步骤(4)中的重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，序列正确的重组质粒命名为pDXW-pld，重组质粒以1900v，5ms的电转条件转化C.glutamicum ATCC 13032。涂布于含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体种子培养基，在30℃培养箱倒置培养三天至转化子长出，通过PCR验证筛选阳性转化子，接种至含卡那霉素抗性(50mg/L)的液体种子培养基中培养至OD562＝25。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min。收集上清液进行活性测定。重组菌株C.glutamicum ATCC 13032/pDXW-pld4酶活为0.91U/mL。
在以上实施例中，实现了磷脂酶D在枯草芽孢杆菌，毕赤酵母，谷氨酸棒杆菌中的异源表达，重组菌株的酶活分别为0.14U/mL，0.22U/mL，0.25U/mL(图9)，且利用信号肽分别实现了磷脂酶D的在枯草芽孢杆菌，毕赤酵母，谷氨酸棒杆菌中的分泌表达，重组菌株的酶活如图10所示。因为磷脂酶D在谷氨酸棒杆菌中表现出最高水解活力，为0.91U/mL，因此选择谷氨酸棒杆菌作为最优表达宿主，WapA作为最优信号肽。
实施例8
本实施例提供了添加RBS的重组质粒pDXW-rpld4的构建及其在谷氨酸棒杆菌中的表达方法，具体步骤如下：
(1)以含有磷脂酶D编码基因的重组质粒pET-28a(+)-spld为模板，设计引物(P13、P14)扩增磷脂酶D编码序列:
引物P13：5’-AGCCGATGTACTAGCAGCTATGGCACGTCATCCGCGCA-3’
引物P14：5’-CCAAGCTTTTAATCCTGACAAATACCGCG-3’(HindⅢ)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μLddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)以B.subtilis168基因组为模板，设计引物(P16、P17)扩增含有RBS序列(AGAAGGAGATATACC)的WapA信号肽序列：
引物P16：5’-TTGCGCGGATGACGTGCCATAGCAGCTGCTAGTACATCGGCT-3’
引物P17：5’-CGGAATTCAGAAGGAGATATACCAAAAAAAGAAAGAGG-3’(EcoRⅠ)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，53.5℃退火30s，72℃延伸0.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(3)以割胶回收纯化的磷脂酶D序列和含有RBS序列的WapA信号肽序列为模板，以P14、P17为引物融合两段序列：
引物P14：5’-CCAAGCTTTTAATCCTGACAAATACCGCG-3’(HindⅢ)
引物P17：：5’-CGGAATTCAGAAGGAGATATACCAAAAAAAGAAAGAGG-3’(EcoRⅠ)
融合过程分为两轮PCR反应。第一轮：PCR扩增反应在47μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，19μL ddH2O，磷脂酶D和WapA模板各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共8个循环；72℃终延伸10min。第二轮：PCR扩增反应在50μL体系中进行，在第一轮的反应体系中加入引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，55.5℃退火30s，72℃延伸2min，共25个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。将步骤(3)回收产物克隆至pMD19-T载体构建重组克隆质粒，将质粒转化至E.coli JM 109，挑取多个转化子至LB液体培养基中(Kanr)，在37℃，220rpm的条件下培养10～12h，提取质粒后对质粒PCR验证，验证正确的进行序列测定。
(4)重组质粒pDXW-rpld4的构建
将pDXW-10质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用EcoRI和HindⅢ进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒。
(5)重组质粒pDXW-rpld4转化C.glutamicum ATCC 13032
将步骤(4)中的重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，序列正确的重组质粒命名为pDXW-pld。重组质粒以1900v，5ms的电转条件转化C.glutamicum ATCC 13032。涂布于含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体种子培养基，在30℃培养箱倒置培养三天至转化子长出，通过PCR验证筛选阳性转化子，接种至含卡那霉素抗性(50mg/L)的液体种子培养基中培养至OD562＝25。。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min。收集上清液进行活性测定。重组菌株C.glutamicum ATCC 13032/pDXW-rpld4酶活为1.06U/mL，较于未添加RBS的重组菌，酶活提高了16％。
实施例9
本实施例提供了将tac-M启动子替换为pWapA启动子的重组质粒pDXW-wrpld4的构建及其在谷氨酸棒杆菌中的表达方法，具体步骤如下：
(1)以B.subtilis168基因组为模板，设计引物(P18、P19)扩增pWapA启动子序列：
引物P18：5’-GGGGTACCATTTTTATCAACGAAATTTATTT-3’(Kpn I)
引物P19：5’-CGGAATTCTTCCTCTCTCCTTTTGTAATA-3’(EcoRⅠ)
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸0.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(2)以pDXW-10质粒为模板，设计引物(P20、P21，P22、P23)将质粒多克隆位点上的KpnI酶切位点GGTACC突变为GGAACC，并在tac-M启动子前设计Kpn I酶切位点，将改造后的pDXW-10质粒命名为pDXW-10a质粒。
引物P20：5’-GCCTCGAGGGAACCAGATCTCCGCGGCTTAA-3’
引物P21：5’-AGATCTGGTTCCCTCGAGGCGGCCGCCCAT-3’
引物P22：5’-TCATAACGGTACCGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTG-3’
引物P23：5’-ATTTCAGAATATTTGCCGGTACCGTTATGATGTCGGCGCA-3’
PCR扩增反应在50μL体系中进行，反应体系中加入25μL(Premix)，20μL ddH2O，2μL模板DNA，上下游引物各1.5μL。反应条件为在94℃预变性3min后开始循环：94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸10min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行核酸电泳鉴定并割胶回收纯化。
(3)重组质粒pDXW-wrpld4的构建
将pDXW-10a质粒(SEQ ID NO.6)用Kpn I和HindⅢ进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的质粒，将实施例9中验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒用Kpn I和EcoRI进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因，将步骤(1)中获得的pWapA片段同时用EcoRI和HindⅢ进行双酶切，37℃酶切3h后进行核酸电泳验证并割胶回收pWapA基因。将三段回收产物用T4DNA连接酶在16℃过夜连接，连接产物转化至E.coli JM 109感受态细胞中，在含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体LB培养基上过夜培养，挑取多个转化子至含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，220rpm条件下培养10～12h后提取质粒。
(4)重组质粒pDXW-wrpld4转化C.glutamicum ATCC 13032
将步骤(3)中的重组质粒送至上海睿迪测序公司进行序列测定，序列正确的重组质粒命名为pDXW-wrpld4。重组质粒以1900v，5ms的电转条件转化C.glutamicum ATCC13032。涂布于含卡那霉素抗性(50mg/L)的固体种子培养基，在30℃培养箱倒置培养三天至转化子长出，通过PCR验证筛选阳性转化子，接种至含卡那霉素抗性(50mg/L)的液体种子培养基中培养至OD562＝25。将发酵液在4℃条件下，以12000rpm离心10min。收集上清液进行活性测定。重组菌株C.glutamicum ATCC 13032/pDXW-wrpld4酶活为1.3U/mL。
本实施例通过异源表达，添加信号肽，RBS，替换启动子，在谷氨酸棒杆菌中实现了磷脂酶D的高效表达，重组菌株C.glutamicum ATCC 13032/pDXW-wrpld4在优化后的发酵培养基中酶活表现为1.9U/mL，是未改造重组菌C.glutamicum ATCC 13032/pDXW-pld酶活的7.6倍。
本发明以上实施例中，磷脂酶D水解活力的测定方法如下：
100μL反应体系：60μL底物卵磷脂溶液(预热5min)和40μL酶液充分混匀后于60℃条件下反应20min，加入50μL终止液终止反应，并在沸水浴中放置5min后立即放于冰上冷却；6000rpm离心5min，吸取全部上清加入60μL胆碱氧化酶、200μL苯酚溶液、200μL 4-氨基安替比林溶液和40μL过氧化物酶，充分混匀后于37℃反应20min；反应结束后，于OD505nm处测定吸光值，根据标准曲线计算酶活。
本发明中还测试了磷脂酶D蛋白分子量，方法如下：
根据10％分离胶和浓缩胶的配方进行分离胶和浓缩胶制备，制备完成后，取80μL样品加入20μL 5×上样缓冲液，充分混匀后于沸水浴中放置5min使蛋白变性。根据蛋白浓度进行上样，并加入蛋白标记物。上层浓缩胶采用80V电压(约30min)，后期分离胶采用100V电压，当样品至分离胶底部约1cm处关闭电源。结束后用蒸馏水冲洗干净，进行染色和脱色，测定磷脂酶D蛋白分子量大小。SDS-PAGE结果显示(图11)，本发明实施例9中表达的磷脂酶D分子量为60kDa。
实施例10
本实施例提供了一种磷脂酰丝氨酸(PS)的制备方法。
所采用的初试转化条件为：浓度为8mg/mL的大豆卵磷脂(PC50)溶解于8mL乙酸乙酯，作为有机相，将160mg L-丝氨酸溶于4mL磷脂酶D粗酶液，作为水相；将有机相和水相充分超声混匀后，于40℃、120rpm条件下振荡反应12h。
向上述反应液中加入20mL氯仿/甲醇(体积比2/1)混合溶液，3mL超纯水，2500rpm离心5min，去除底层溶液，经真空离心浓缩仪浓缩后，加入2mL正己烷/异丙醇(体积比1/1)溶解，经0.22μm有机膜过滤后，采用HPLC进行产物磷脂酰丝氨酸的检测分析。
为获得最佳转化率，本实施例对转化条件进行了优化。从有机溶剂的选择，有机相水相体积比，底物浓度比，转化温度，转化时间及钙离子浓度这6个角度对转化工艺进行优化。
(1)有机溶剂的选择
将初始转化条件中的乙酸乙酯替换为同体积的正己烷，氯仿，乙醚或甲苯。通过HPLC检测分析，有机相为甲苯时，磷脂酰丝氨酸的转化率最高，为43.3％(图12a)，因此甲苯可作为最佳有机相。
(2)有机相水相体积比
将初始转化条件中的有机相换为甲苯，有机相水相体积比分别设置为4:1,4:2,4:3或4:4，其余转化条件不变，考察两相体积比对转化率的影响。有机相水相体积比为4：2时，磷脂酰丝氨酸的转化率最高，为44.5％(图12b)，因此4:2的两相体积比为最佳比例。
(3)底物浓度比
浓度为8mg/mL的PC50溶解于8mL甲苯，作为有机相，分别取8，16，24，32，40，48mg/mL的L-丝氨酸溶于4mL粗酶液作为水相；将有机相和水相充分超声混匀后，于40℃、120rpm条件下振荡反应12h，以考察不同底物浓度比对转化率的影响。当PC50浓度为8mg/mL，L-丝氨酸浓度为40mg/mL时，磷脂酰丝氨酸的转化率最高，可达43.2％(图12c)，因此1:5为最佳底物浓度比。
(4)转化温度
浓度为8mg/mL的PC50溶解于8mL甲苯，作为有机相，40mg/mL的L-丝氨酸溶于4mL磷脂酶D粗酶液作为水相；将有机相和水相充分超声混匀后，分别于25,30,35,40,45,50℃、120rpm条件下振荡反应12h，以考察不同转化温度比对转化率的影响。由HPLC检测结果可知当转化温度为40℃时最佳，转化率为44.6％(图12e)，因此40℃可作为最佳转化温度。
(5)转化时间
将步骤(4)得到的优化后转化条件中的时间分别设置为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14h，以考察不同转化时间对转化率的影响。由HPLC检测结果可知当转化时间为10h时最佳，转化率为45.8％(图12d)，因此转化时间为10h可作为最佳转化时间。
(6)钙离子浓度
分别取8mL溶有8mg/mL PC50的甲苯作为反应有机相；取4mL溶有40mg/mL L-丝氨酸的粗酶液作为反应水相，其中水相中分别加入终浓度为0mM、5mM、10mM、15mM、20mM的CaCl2，将有机相和水相充分混匀后于40℃、120rpm振荡反应10h，检测PS生成情况。当氯化钙浓度为15mM时，转化率最高，为48.6％(图12f)，因此在转化体系中可添加15mMCaCl2以获得最高转化率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 表达磷脂酶D的重组菌株及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 540
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Ala Arg His Pro Arg Lys Arg Arg Ser Ala Leu Val Pro Arg Thr
1 5 10 15
Ala Val Pro Ala Leu Val Ala Val Leu Leu Pro Val Ala Pro Ala Ser
20 25 30
Ala Asp Thr Gly Ala Thr Pro Ala Thr Pro His Leu Asp Ala Val Glu
35 40 45
Gln Thr Leu Arg Gln Val Ser Pro Gly Leu Glu Gly Arg Val Trp Glu
50 55 60
Arg Thr Ala Gly Asn Thr Leu Asp Ala Ser Thr Pro Gly Gly Ala Asp
65 70 75 80
Trp Leu Leu Gln Thr Pro Gly Cys Trp Gly Asp Ala Thr Cys Ala Asp
85 90 95
Arg Pro Gly Thr Arg Gln Leu Leu Val Lys Met Thr Glu Asn Val Ser
100 105 110
Arg Ala Thr Glu Ser Val Asp Ile Ser Thr Leu Ala Pro Phe Pro Asn
115 120 125
Gly Ala Phe Gln Asp Ala Val Val Ser Gly Leu Lys Ala Ser Val Ala
130 135 140
Ser Gly His Gln Pro Lys Val Arg Ile Leu Val Gly Ala Ala Pro Ile
145 150 155 160
Tyr His Leu Asn Val Val Pro Ser Lys Tyr Arg Asp Glu Leu Val Glu
165 170 175
Lys Leu Gly Lys Asp Ala Ala Lys Val Thr Leu Asn Val Ala Ser Met
180 185 190
Thr Thr Ser Lys Thr Ala Phe Ser Trp Asn His Ser Lys Leu Leu Val
195 200 205
Val Asp Gly Arg Ser Ala Ile Thr Gly Gly Ile Asn Gly Trp Lys Asp
210 215 220
Asp Tyr Leu Asp Thr Thr His Pro Val Ser Asp Val Asp Leu Ala Leu
225 230 235 240
Ser Gly Pro Ala Ala Ala Ser Ala Gly Lys Tyr Leu Asn Glu Leu Trp
245 250 255
Ser Trp Thr Cys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala Ser Val Trp Phe Ala
260 265 270
Ser Ser Asn Gly Ala Gly Cys Met Pro Thr Leu Glu Pro Ala Ala Ser
275 280 285
Ala Glu Ala Pro Arg Gly Asp Val Pro Val Ile Ala Val Gly Gly Leu
290 295 300
Gly Val Gly Ile Gln Arg Asp Asp Pro Ala Ser Arg Phe Arg Pro Thr
305 310 315 320
Leu Pro Thr Ala Pro Asp Thr Lys Cys Val Val Ala Leu His Asp Asn
325 330 335
Thr Asn Ala Asp Arg Asp Tyr Asp Thr Val Asn Pro Glu Glu Ser Ala
340 345 350
Leu Arg Ala Leu Ile Ser Ser Ala Asp Arg His Ile Glu Ile Ser Gln
355 360 365
Gln Asp Leu Asn Ala Thr Cys Pro Pro Leu Pro Arg Tyr Asp Ile Arg
370 375 380
Val Tyr Asp Ala Leu Ala Ala Lys Met Ala Ala Gly Val Lys Val Arg
385 390 395 400
Ile Val Val Ser Asp Pro Ala Asn Arg Gly Ala Val Gly Ser Gly Gly
405 410 415
Tyr Ser Gln Ile Lys Ser Leu Thr Glu Ile Ser Asp Thr Leu Arg Asp
420 425 430
Arg Leu Ala Leu Arg Thr Gly Asp Gln Ala Ser Ala Arg Thr Ala Met
435 440 445
Cys Ser Asn Leu Gln Leu Ala Thr Ala Arg Ser Ser Thr Ser Pro Lys
450 455 460
Trp Ala Asp Glu His Pro Tyr Ala Gln His His Lys Leu Ile Ser Val
465 470 475 480
Asp Gly Ser Ala Phe Tyr Ile Gly Ser Lys Asn Leu Tyr Pro Ala Trp
485 490 495
Leu Gln Asp Phe Gly Tyr Val Val Glu Ser Pro Ala Ala Ala Lys Gln
500 505 510
Leu Asp Thr His Leu Leu Ala Pro Gln Trp Gln Phe Ser Arg Asp Thr
515 520 525
Ala Thr Val Asp Tyr Glu Arg Gly Ile Cys Gln Asp
530 535 540
<210> 2
<211> 1623
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atggcacgtc atccgcgcaa acgtcgctcc gcactggtgc cgcgtaccgc agttccggca 60
ctggtggctg ttctgctgcc ggtggcgccg gcctcagcag acaccggtgc aacgccggca 120
accccgcacc tggatgcggt ggaacagacc ctgcgccaag tttcgccggg cctggaaggt 180
cgtgtttggg aacgcacggc tggtaacacc ctggacgcaa gcaccccggg cggtgcagat 240
tggctgctgc agacgccggg ttgctggggt gacgcaacgt gtgctgatcg tccgggcacc 300
cgccaactgc tggttaaaat gacggaaaac gtctctcgtg caaccgaaag tgtcgacatt 360
tccacgctgg cgccgtttcc gaatggtgcg ttccaggatg ccgttgttag tggcctgaaa 420
gcgagcgttg cctctggtca tcaaccgaaa gtccgtattc tggtgggcgc ggccccgatc 480
tatcacctga atgtcgtgcc gagcaaatac cgcgacgaac tggtggaaaa actgggtaaa 540
gatgcagcta aagttaccct gaacgtcgca tcaatgacca cgtcgaaaac ggcttttagc 600
tggaatcatt ctaaactgct ggttgtcgat ggccgttctg cgattaccgg cggtatcaac 660
ggttggaaag atgactatct ggataccacg caccctgtga gtgatgttga cctggcactg 720
tctggtccgg cagcagcaag tgctggtaaa tacctgaacg aactgtggtc gtggacctgc 780
cgcaataaaa acaatattgc gagcgtgtgg tttgccagct ctaatggcgc aggttgtatg 840
ccgaccctgg aaccggctgc atccgctgaa gcaccgcgtg gcgatgtccc ggtgattgca 900
gtcggcggtc tgggcgtggg tatccagcgt gatgacccgg ccagccgttt ccgtccgacg 960
ctgccgaccg caccggacac caaatgcgtg gttgcgctgc atgataacac caatgccgat 1020
cgtgactacg atacggtgaa cccggaagaa tctgcactgc gtgctctgat cagttccgcg 1080
gaccgccaca ttgaaatcag tcagcaagat ctgaatgcca cctgtccgcc gctgccgcgt 1140
tatgacattc gcgtgtacga tgcgctggcc gcaaaaatgg ctgcgggcgt taaagtccgt 1200
atcgtcgtga gcgatccggc aaaccgtggt gctgttggta gtggcggtta ttcccagatt 1260
aaatcactga cggaaatcag cgacaccctg cgtgatcgtc tggcactgcg taccggtgat 1320
caggcctccg cacgtacggc aatgtgctca aacctgcaac tggctacggc gcgctcatcg 1380
acctctccga aatgggcaga cgaacatccg tatgctcagc atcacaaact gatttcggtg 1440
gatggcagcg cattttatat cggttccaaa aatctgtacc cggcctggct gcaggatttc 1500
ggctacgttg tcgaatcacc ggccgcagct aaacaactgg atacccacct gctggcgccg 1560
cagtggcaat tcagtcgtga caccgccacg gttgattatg aacgcggtat ttgtcaggat 1620
taa 1623
<210> 3
<211> 96
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atgaaaaaaa gaaagaggcg aaactttaaa aggttcattg cagcattttt agtgttggct 60
ttaatgattt cattagtgcc agccgatgta ctagca 96
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
agaaggagat atacc 15
<210> 5
<211> 372
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
atttttatca acgaaattta tttcaatcat tgtatttctc gaccccgctg tcgcgatcgt 60
gctcgatacc gtcttcacag gcttccgccc tgacctctat caaacgcttg gcatcgtaat 120
gatctttgcg ggcatggcct tgacgcttgt caggaggcag gggaaggcga atgtgacagc 180
tgagggtacg gatattgaac aaatacaata aaaaatgtaa aaaggcctat gcggcctttt 240
tttgttttag gtcaattgac tctcgctaat ccttaaaata agataaattt tctagaaaaa 300
tattgtaatg atatttcagt ctagttaaga ttattgagta aatattactt ttattacaaa 360
aggagagagg aa 372
<210> 6
<211> 8351
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
gaattcgcta gcgagctccc atgggcggcc gcctcgaggg aaccagatct ccgcggctta 60
agctgcagaa gcttctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa 120
tcagaacgca gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc 180
ccacctgacc ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg 240
tctccccatg cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa 300
agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa 360
tccgccggga gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc gggcaggacg 420
cccgccataa actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt 480
tgcgtttcta caaactcttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 540
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 600
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 660
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 720
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 780
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg 840
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 900
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 960
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 1020
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 1080
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 1140
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 1200
aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 1260
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 1320
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 1380
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 1440
agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 1500
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 1560
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 1620
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 1680
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 1740
tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 1800
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 1860
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 1920
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 1980
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 2040
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 2100
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 2160
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 2220
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 2280
cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 2340
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga 2400
tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 2460
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga 2520
ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg 2580
tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca 2640
gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg 2700
gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc 2760
cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg 2820
tttggtcact tgatgcctcc gtgtaagggg gaatttctgt tcatgggggt aatgataccg 2880
atgaaacgag agaggatgct cacgatacgg gttactgatg atgaacatgc ccggttactg 2940
gaacgttgtg agggtaaaca actggcggta tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact 3000
cagggtcaat gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag 3060
catcctgcga tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga 3120
ctttacgaaa cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg 3180
cagcagcagt cgcttcacgt tcgctcgcgt atcggtgatt cattctgcta accagtaagg 3240
caaccccgcc agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca cgatcatgcg cacccgtggc 3300
caggacccaa cgctgcccga gatgcgccgc gtgcggctgc tggagatggc ggacgcgatg 3360
gatatgttct gccaagggtt ggtttgcgca ttcacagttc tccgcaagaa ttgattggct 3420
ccaattcttg gagtggtgaa tccgttagcg aggtgccgcc ggcttccatt caggtcgagg 3480
tggcccggct ccatgcaccg cgacgcaacg cggggaggca gacaaggtat agggcggcgc 3540
ctacaatcca tgccaacccg ttccatgtgc tcgccgaggc ggcataaatc gccgtgacga 3600
tcagcggtcc agtgatcgaa gttaggctgg taagagccgc gagcgatcct tgaagctgtc 3660
cctgatggtc gtcatctacc tgcctggaca gcatggcctg caacgcgggc atcccgatgc 3720
cgccggaagc gagaagaatc ataatgggga aggccatcca gcctcgcgtc gcgaacgcca 3780
gcaagacgta gcccagcgcg tcggccgcca tgccggcgat aatggcctgc ttctcgccga 3840
aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag ggcgtgcaag attccgaata 3900
ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa gcggtcctcg ccgaaaatga 3960
cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat aaagaagaca gtcataagtg 4020
cggcgacgat agtccattgt caacaacaag acccatcata gtttgccccc gcgacattga 4080
ccataaattc atcgcacaaa atatcgaacg gggtttatgc cgcttttagt gggtgcgaag 4140
aatagtctgc tcattacccg cgaacaccgc cgcattcaga tcacgcttag tagcgtcccc 4200
atgagtaggc agaaccgcgt ccaagtccac atcatccata acgatcatgc acggggtgga 4260
atccacaccc agacttgcca gcacctcatt agcgacacgt tgcgcagcgg ccacgtcctt 4320
agccttatcc acgcaatcta gaacgtactg cctaaccgcg aaatcagact gaatcagttt 4380
ccaatcatcg ggcttcacca aagcaacagc aacgcgggtt gattcgaccc gttccggtgc 4440
ttccagaccg gcgagcttgt acagttcttc ttccatttca cgacgtacat cagcgtctat 4500
gtaatcaatg cccaaagcac gcttagcccc acgtgaccag gacgaacgca ggtttttaga 4560
accaacctca tactcacgcc accgagccac caaaacagcg tccatatcct cgccggcgtc 4620
gctttgatcg gccaacatat ccaacatctg aaacggcgtg tacgacccct tagacgcggt 4680
tttagtagcg gagccagtca gttcctgaga catgccctta gcgaggtagg ttgccatttt 4740
cgcagcgtct ccaccccagg tagacacctg atcaagtttg accccgtgct cacgcagtgg 4800
cgcgtccata ccggccttaa ccacaccagc agaccagcgg gaaaacatgg aatcctcaaa 4860
cgccttgagt tcatcgtcag acagtggacg atccaagaac aacagcatgt tgcggtgcaa 4920
gtgccaaccg ttcgcccaag agtctgtgac ctcatagtca ctataggtgt gctccacccc 4980
gtaccgtgca cgttctttct tccactgaga tgttttcacc atcgaagagt acgcagtctt 5040
aatacccgct tcaacctgcg caaatgactg tgagcggttg tgtcgaacag tgcccacaaa 5100
catcatgagc gcgccacccg ccgccaagtg attcttagta gcaatagcca gctcaatgcg 5160
gcgttcgccc atgacttcca attcagccag aggtgacccc cagcgagagt gagagttttg 5220
cagaccctca aactgcgaag caccgttaga cgaccaggac accgcaacag cttcgtccct 5280
gcgccaccta tggcaccccg ccagagcctt actattggtg atcttgtaca tgacgttttg 5340
cctacgccac gccctagcgc gagtgacctt agaaccctca ttgacctgcg gttccttaga 5400
ggtgttcact tctatttcag tgttacctag acccgatgtt gtgcggggtt gcgcagtgcg 5460
agtttgtgcg ggtgttgtgc ccgttgtctt agctagtgct atggttgtca attgaaaccc 5520
cttcgggtta tgtggccccc gtgcatatga gttggtagct cgcacggggg tttgtcttgt 5580
ctagggacta ttaattttta gtggtgtttg gtggccgcct agcttggcta tgcgtgccag 5640
cttacccgta ctcaatgtta aagatttgca tcgacatggg agggttacgt gtccgatacc 5700
tagggggggt atccgcgact aggtgccccg gtgctcactg tctgtaccgg cggggcaagc 5760
cccacacccc gcatggacag ggtggctccg ccccctgcac ccccagcaat ctgcatgtac 5820
atgttttaca cattagcacg acatgactgc atgtgcatgc actgcatgca gactaggtaa 5880
atatgagtat gtacgactag taacaggagc actgcacata atgaatgagt tgcaggacaa 5940
tgtttgctac gcatgcgcat gacatatcgc aggaaagcta ctagagtctt aaagcatggc 6000
aaccaaggca cagctagaac agcaactaca agaagctcaa caggcactac aggcgcagca 6060
agcgcaggca caagccacca tcgaagcact agaagcgcag gcaaaggcta agcccgtcgt 6120
ggtcaccgca cgcgttcctt tggcactacg tgaggacatg aagcgcgcag gcatgcagaa 6180
cggtgaaaac ctccaagagt tcatgatcgc cgcgtttacc gagcggctag aaaagctcac 6240
caccaccgac aacgaggaaa acaatgtcta acccactagt tctctttgcc caccgtgacc 6300
cggtaaatga cgtgacgttc gagtgcattg agcacgccac ctacgacaca ctttcacacg 6360
ctaaagacca gatcaccgcc caaatgcaag ccctagacga agaagccgcc ctactgccct 6420
aatgggtgtt tcatgggtgt ttccctagtg tttcatggtg ttttcaccta agctagggaa 6480
ttgcgcgaga agtctcgcaa aaatcagcaa cccccggaac cacacagttc acgggggttc 6540
ttctatgcca gaaatcagaa aggggaacca gtgaacgacc ccgaatattg gatcacagcg 6600
cagcaggtcg ccgcccgcgt agctctcacc ccggccacca ttaaaaagtg ggcaaacgag 6660
ggaaaaatca ccgcatacaa gatcggcaag tccgtccgat tcaaagcatc agacgtagac 6720
gacgatagtc atgccccgcg cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg 6780
catcggtcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 6840
gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag 6900
tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa 6960
gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc 7020
tgtggcgccg gtgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt 7080
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaat taattcttag aaaaactcat 7140
cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa 7200
aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat 7260
cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct 7320
cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga 7380
atggcaaaag tttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt 7440
catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac 7500
gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca 7560
ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct 7620
ggaatgctgt tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga 7680
taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct 7740
catctgtaac atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat 7800
cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc 7860
atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggccta gagcaagacg 7920
tttcccgttg aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt 7980
ttattgttca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc 8040
gtagaaaaga tcaaagcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatccgg 8100
agcttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg 8160
gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt 8220
tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggtaccg gcaaatattc tgaaatgagc 8280
tgttgacaat taatcatcgg ctggaaccat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 8340
cacaggaaac a 8351
Claims (10)
1.一种磷脂酶D，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的磷脂酶D的基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
4.一种表达磷脂酶D的重组质粒，其特征在于：包括权利要求2所述的基因序列、使磷脂酶D胞外表达的信号肽基因、用于表达磷脂酶D的核糖体结合位点、用于表达磷脂酶D的启动子，其中，信号肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；核糖体结合位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求4所述的表达磷脂酶D的重组质粒，其特征在于：所用出发质粒为pDXW-10a，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种表达磷脂酶D的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株中导入由权利要求4中所述表达磷脂酶D的重组质粒。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于：所述重组质粒的宿主菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、毕赤酵母Pichia pastoris或谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum。
8.权利要求6所述的重组菌株在生产磷脂酰丝氨酸中的应用。
9.一种生产磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用权利要求6所述的重组菌株所产生的生产磷脂酶D催化底物大豆卵磷脂和丝氨酸的反应，在30-70℃条件下反应2-30h，得到所述磷脂酰丝氨酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述反应在Ca2+存在的条件下进行。
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