CN113481114B

CN113481114B - 一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用

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Publication number: CN113481114B
Application number: CN202110755123.6A
Authority: CN
Inventors: 杨建明; 梁波; 刘云慧; 汤若昊; 王兆宝; 李美洁
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2041-07-05
Also published as: CN113481114A

Abstract

本发明提供了一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。所述爆炸物可视化生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因和爆炸物可视化的目标基因dntA或dntB基因。本发明利用锚定蛋白将目标基因表达产物锚定到宿主菌表面，最终获得爆炸物可视化生物传感器。该生物传感器能够特异性的将2,4‑二硝基甲苯（2,4‑DNT）降解成一种肉眼可见的红色物质2‑羟基‑5‑甲基苯醌，进而判断待测样品中是否存在爆炸物分子，并且其在420nm处具有最大吸光值，可根据标准曲线计算2,4‑DNT浓度，其稳定性很好，且检测范围宽、灵敏度高、方法简便、成本低、安全性强，因此具有广泛的应用前景。

Description

一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

微生物细胞表面展示技术是利用锚定蛋白的作用将目标肽或蛋白质在展示在噬菌体、细菌和酵母细胞的表面。与从细胞质中纯化肽或蛋白质酶，微生物细胞表面展示有三个优势。首先，目标蛋白可以在锚蛋白的作用下锚定在宿主细胞的外膜上，因此展示的蛋白能够直接接触细胞外界环境种的底物，从而加快蛋白与底物的反应。其次，通过使用细胞膜作为基质，蛋白质的稳定性提高。第三，只需收获细胞即可获得蛋白质，无需冗长繁琐的纯化过程。到目前为止，该方法已广泛应用于疫苗筛选、环境修复、全细胞催化、生物传感器等领域。在生物传感器方面，已经开发了各种检测模式和系统，具有优异的灵敏度、特异性和稳定性，包括基于细菌或酵母表面展示系统的电化学和光谱学检测中。

生物传感技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件是负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等等；而报告元件可在感应元件的作用下而产生感应信号，一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）和荧光素酶，分别产生绿色荧光、黄色荧光、红色荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这些较为常见的报告元件的特点是技术成熟、容易操作，但是荧光和自发光的检测需要借助于分析仪器，例如酶标仪、紫外分析仪、荧光检测仪、自发光检测仪等，还需要对荧光信号和自发光信号进行定量和定性分析。荧光和自发光均不能实现肉眼观察，尤其是在由外界光照的情况下。

战区残留爆炸物（例如地雷）对于生命安全、生态系统都造成了不可修复的损伤，因此针对地雷进行安全有效的检测具有重要的战略意义。通过生物传感技术对残留地雷进行检测是一种有效的手段。爆炸物（例如地雷）的有效成份为为2,4,6-三硝基甲苯（TNT），TNT可自然分解为多种化合物，如1,3-二硝基苯（1,3-DNB）和2,4-二硝基甲苯（2,4-DNT），其中2,4-DNT的稳定性最高，可在自然环境中长期存在。以色列科学家Shimshon Belkin报道了对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的生物感应系统，检测限达到0.01 mg/L（New Biotechnology, 2020, 59, 65-73），处于国际上领先水平。此生物感应系统需使用仪器进行特定波长的紫外激发，以及绿色荧光信号的收集。另外，多种非GFP物质都能在紫外激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。因此，该传感器的特异性较差，大大限制了其在复杂环境中的应用。

但到目前为止，国内外无利用表面展示来进行爆炸物分子可视化检测的相关报道。

发明内容

为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器，所述爆炸物可视化生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因和爆炸物可视化的目标基因。

进一步的，所述爆炸物可视化的目标基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；

（3）与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或者SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的，且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

优选的，所述爆炸物可视化的目标基因为DntB基因或DntA基因。

进一步的，所述DntA基因包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5所示的DntAa、DntAb、DntAc、DntAd基因。

进一步的，所述锚定蛋白包括a凝集素、α凝集素、Flo1p絮凝素、Pir蛋白。

进一步的，所述锚定蛋白的编码基因具有下列核苷酸序列之一：

（1）SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

（2）与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具有90%以上同源性的，且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

优选的，所述锚定蛋白为a凝集素。

本发明还提供了所述的爆炸物可视化生物传感器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）克隆爆炸物可视化的目标基因DntB或DntA基因；

（2）克隆锚定蛋白的编码基因，通过遗传操作插入酵母的表达载体中，获得含有锚定蛋白基因的表达载体；

（3）将克隆的DntB或DntA因通过遗传操作分别插入步骤（2）中含有锚定蛋白基因的表达载体中，获得DntA或DntB酵母细胞表面展示表达重组载体；

（4）将所述DntA或DntB酵母细胞表面展示表达重组载体转化酵母感受态细胞，筛选阳性转化子，获得含有DntA或DntB展示系统的酵母工程菌株；

（5）将所述含有DntA或DntB展示系统的酵母工程菌株活化培养后，洗涤收集菌体，获得具有DntA或DntB酶活性的全细胞催化剂，获得爆炸物可视化生物传感器。

本发明还提供了所述的爆炸物可视化生物传感器在用于爆炸物分子实时检测中的应用。

进一步的，所述爆炸物可视化生物传感器的使用方法是：将所述爆炸物可视化生物传感器加入待测样品中，20℃反应1 h后，肉眼观察培养液颜色，若此时显示红色则确定样品中含有爆炸物分子，且红色越深则爆炸物分子的浓度越高；然后离心终止反应，利用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测吸光值，根据标准曲线计算得出爆炸物分子的浓度，吸光值越大则爆炸物分子的浓度越高。

进一步的，在使用时，既能够单独使用一种含目标基因的爆炸物可视化生物传感器，也能够将两种含有不同目标基因的爆炸物可视化生物传感器混合使用。

进一步的，混合使用时，将含有DntB、DntA基因的所述爆炸物可视化生物传感器以1:1-10:7的体积比混合。

优选的，混合使用时，将含有DntA和DntB基因的所述爆炸物可视化生物传感器以1:10-10:1的体积比混合。

优选的，将含有DntA基因的爆炸物可视化生物传感器和含有DntB基因的爆炸物可视化生物传感器以5:1的体积比混合。

进一步的，所述爆炸物可视化生物传感器能够检测到的爆炸物分子浓度的线性范围为0.0005 mg/L-1mg/L，最低检测限是0.0005mg/L。

进一步的，所述爆炸物分子为2,4-DNT。

进一步的，所述爆炸物分子具有很好的稳定性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益技术效果：

（1）酿酒酵母一直被应用于在食品和制药工业中，是公认安全(GRAS)的微生物。酿酒酵母细胞壁坚硬，在自然环境中的生存能力强，细胞的稳定性好。酿酒酵母的遗传操作系统是最为简单成熟的真核细菌遗传操作系统，其作为宿主可用于需要正确折叠和翻译后修饰才能表现出生物活性的复杂蛋白的大量表达，细胞能在廉价培养基中生长繁殖和高密度培养，大大方便了后期大规模检测的需求；

（2）运用细胞表面展示技术，2,4-DNT无需进入到细胞内即可与细胞表面的酶蛋白发生反应，大大缩短了反应时间。与胞内反应相比，检测的灵敏度更高；

（3）当样品中含有2,4-DNT时，经过生物传感器的检测会呈现红色，肉眼可见，无需仪器进行信号检测。因此，利用本发明的可视化生物传感器检测更加便捷、成本低；

（4）该生物传感器的稳定性好，长时间保存活性没有显著改变，稳定性极好，能够保证传感器的使用效果；且特异性强，对2,4-DNT类似物没有响应。

因此，本发明的爆炸物可视化生物传感器检测更加便捷、成本低，在环境保护、反恐防恐和维护国家安全等领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明中pYD1-DntA的质粒图谱。

图2是本发明中pYD1-DntB的质粒图谱。

图3是本发明中pRS41h-DntA的质粒图谱。

图4是本发明中pRS41h-DntB的质粒图谱。

图5是本发明的展示工程菌株的细胞表面定位荧光图。

图6是胞内菌株与展示工程菌株的酶活比较图。

图7是本发明中两个展示工程菌株按不同比例混合的酶活比较图。

图8是本发明中两种展示工程菌株对于不同底物的检测结果图。

图9是本发明中生物传感器对不同浓度的2,4-DNT检测结果图；其中右侧图片为2,4-DNT检测的标准曲线。

图10是本发明中生物感应器对不同浓度的2,4-DNT的检测时产生的红色物质2-羟基-5-甲基苯醌结果图。

图11是本发明中两种展示工程菌株在4 ℃存放的稳定性检测结果图。

具体实施方式

下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。

实施例1：基因的获得和载体的构建

1、基因的获得

目标基因DntA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由洋葱伯克霍尔德氏菌基因组中扩增获得，是由DntAa、DntAb、DntAc、DntAd构成的，分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

目标基因DntB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，由洋葱伯克霍尔德氏菌基因组中扩增获得。

锚定蛋白a凝集素，其编码该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，包括AGA1和AGA2两个结构域基因。

pYD1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，由Invitrogen提供，序列号Catalogno. V835-01。

2. pYD1-DntB、pYD1-DntA质粒载体构建

（1）以洋葱伯克霍尔德氏菌基因组为模板，引物DntAa-F和引物DntAa-R，引物DntAb-F和引物DntAb-R，引物DntAc-F和引物DntAc-R，引物DntAd-F和引物DntAd-R进行聚合酶链式反应（PCR），扩增DntAa、DntAb、DntAc、DntAd片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
DntAa/DntAb/DntAc/DntAd-F	0.5 μM
		DntAa/DntAb/DntAc/DntAd-R	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95 ºC 3 min ；30 循环 ×（95ºC 15 s，60ºC 15 s，72ºC 1min 30s）；72 ºC 10 min；16ºC ∞。

引物序列如下所示：

DntAa-F:

5’-CCGCTCGAGATGGAACTGGTAGTAGAAC -3’（SEQ ID NO.9）；

DntAa-R：

5’- CCAGTTCTCGCTCATCTCCTTGACGCCGCTGGGATAG-3’（SEQ ID NO.10）；

DntAb-F:

5’- CTATCCCAGCGGCGTCAAGGAGATGAGCGAGAACTGGATCGACG-3’（ SEQ ID NO.11）；

DntAb-R:

5’- GTTTTGGTAACTCATCTCCTTGTCCAGCTTGAGCATCACGCG-3’（SEQ ID NO.12）；

DntAc-F:

5’- ATGCTCAAGCTGGACAAGGAGATGAGTTACCAAAACTTAGTGA-3’ （SEQ ID NO.13）；

DntAc-R:

5’- CTGGGTATTGATCATCATCTCCTTGCGATCAGTCGTCTTGGTGAGTT-3’ （SEQ IDNO.14）；

DntAd-F:

5’- AAGACGACTGATCGCAAGGAGATGATGATCAATACCCAGGAAG-3’ （SEQ ID NO.15）；

DntAd-R:

5’-GCTCTAGACAGGAAGATTATCAGGTTGTGG-3’ （SEQ ID NO.16）。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化。

回收后的DntAa、DntAb、DntAc、DntAd进行overlap反应：

组分	用量
		DntAa/DntAb/DntAc/DntAd片段	100 ng
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 46 μL

先PCR反应10个循环，10个循环结束以后，往反应液中各加入2μL DntAa-F和DntAd-R，继续反应32个循环；

PCR程序为：95ºC 3 min ；（95ºC 15 s，62ºC 15 s，72ºC 3min）；72ºC 10 min；16ºC ∞。

PCR产物利用胶回收纯化试剂盒（Vazyme，货号DC301-01）进行胶回收纯化，获得目的片段DntA。

利用限制性内切酶Xho I（Thermo，货号FD0504）和限制性内切酶 Xba I（Thermo，货号FD0524）同时双酶切pYD1质粒和PCR产物，其酶切体系为：

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Xho1	1 μL
Xba1	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

组分	用量
		质粒酶切片段	100 ng
PCR产物酶切片段	50 ng
		10 × T4 DNA Ligase Buffer	2 μL
T4 DNA Ligase	0.5 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 20 μL

连接体系置于22 ºC孵育2 h。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYD1-DntA(图1)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

（2）以洋葱伯克霍尔德氏菌基因组为模板，引物DntB-F和引物DntB-R，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增DntB片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
DntB-F	0.5 μM
		DntB-R	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95ºC 3 min ；30 循环 ×（95ºC 15 s，62ºC 15 s，72ºC 1min 45s）；72ºC 10 min；16ºC ∞。

引物序列如下所示：

DntB-F:

5’- CCGCTCGAGGTGCATCACGTTTCTACTAAGTCGCC-3’ （SEQ ID NO.17）；

DntB-R：

5’- GCTCTAGAGGCAGCTACGACCGATGCATCTA -3’ （SEQ ID NO.18）。

利用限制性内切酶Hind III（Thermo，货号FD0504）和限制性内切酶 Kpn I（Thermo，货号FD0524）同时双酶切pYD1质粒和PCR产物，其酶切体系为：

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Hind III	1 μL
Kpn I	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

连接体系置于22 ºC孵育2 h。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pYD1-DntB(图2)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

3. pRS41h-DntB、pRS41h-DntA质粒载体构建

（1）以洋葱伯克霍尔德氏菌基因组为模板，引物DnyAa-F1和引物DntAa-R1，引物DntAb-F1和引物DntAb-R1，引物DntAc-F1和引物DntAc-R1，引物DntAd-F1和引物DntAd-R1进行聚合酶链式反应（PCR），扩增DntAa、DntAb、DntAc、DntAd片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
DntAa/DntAb/DntAc/DntAd-F1	0.5 μM
		DntAa/DntAb/DntAc/DntAd-R1	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

PCR程序为：95ºC 3 min ；30 循环 ×（95ºC 15 s，60ºC 15 s，72ºC 1min 30s）；72ºC 10 min；16ºC ∞。

引物序列如下所示：

DntAa-F1:

5’-GCTCTAGAATGGAACTGGTAGTAGAAC -3’ （SEQ ID NO.19）；

DntAa-R1：

5’- CCAGTTCTCGCTCATCTCCTTGACGCCGCTGGGATAG-3’ （SEQ ID NO.20）；

DntAb-F1:

5’- CTATCCCAGCGGCGTCAAGGAGATGAGCGAGAACTGGATCGACG-3’ （SEQ ID NO.21）；

DntAb-R1:

5’- GTTTTGGTAACTCATCTCCTTGTCCAGCTTGAGCATCACGCG-3’ （SEQ ID NO.22）；

DntAc-F1:

5’- ATGCTCAAGCTGGACAAGGAGATGAGTTACCAAAACTTAGTGA-3’ （SEQ ID NO.23）；

DntAc-R1:

5’- CTGGGTATTGATCATCATCTCCTTGCGATCAGTCGTCTTGGTGAGTT-3’ （SEQ ID NO.24）；

DntAd-F1:

5’- AAGACGACTGATCGCAAGGAGATGATGATCAATACCCAGGAAG-3’ （SEQ ID NO.25）；

DntAd-R1:

5’- ATAAGAATGCGGCCGCCAGGAAGATTATCAGGTTGTGG-3’ （SEQ ID NO.26）；

回收后的DntAa、DntAb、DntAc、DntAd进行overlap反应：

先PCR反应10个循环，10个循环结束以后，往反应液中各加入2μL DntAa-F1和DntAd-R1，继续反应32个循环；

利用限制性内切酶Xba I（Thermo，货号FD0504）和限制性内切酶 Not I（Thermo，货号FD0524）同时双酶切pRS41H质粒和PCR产物，其酶切体系为：

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Xba1	1 μL
Not I	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

连接体系置于22 ºC孵育2 h。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pRS41H-DntA(图3)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

（2）以洋葱伯克霍尔德氏菌基因组为模板，引物DntB-F1和引物DntB-R1，进行聚合酶链式反应（PCR），扩增DntB片段，其PCR扩增体系如下所示：

组分	用量
		模板	100 ng
DntB-F1	0.5 μM
		DntB-R1	0.5 μM
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，货号P505-d1）	1 μL
		2×Phanta Max Buffer	25 μL
dNTP	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 50 μL

引物序列如下所示：

DntB-F1:

5’- GCTCTAGAGTGCATCACGTTTCTACTAAGTCGCC-3’ （SEQ ID NO.27）；

DntB-R1：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCGGCAGCTACGACCGATGCATCTA -3’ （SEQ ID NO.28）。

组分	用量
		质粒/PCR产物	1000 ng /200ng
10 ×FD Buffer	2 μL
		Xba I	1 μL
Not I	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	Up to 30 μL

酶切体系置于37 ºC孵育2h，进行胶回收纯化。

利用DNA连接酶进行连接，连接体系如下所示：

连接体系置于22 ºC孵育2 h。连接产物转化E. coli DH5α感受态，涂布到含34mg/mL氯霉素的LB固体平板上，PCR筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pRS41H-DntB(图4)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。

实施例2：

1、重组菌株的构建

将pYD1-DntB质粒、pYD1-DntA质粒、pRS41h-DntB质粒、pRS41h-DntA质粒利用LiAc转化方法分别转化酿酒酵母EBY100（Invitrogen, Catalog no. C839-00）感受态细胞，涂布到YNB（0.67 % YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，2 %葡萄糖，0.01 %亮氨酸，0.01 %色氨酸，1.5 %琼脂）固体平板上，获得阳性克隆，由此获得含有载体pYD1-DntB质粒、pYD1-DntA质粒的两个展示工程菌株，以及RS41h-DntB质粒、pRS41h-DntA的两个胞内工程菌株。

（1）LiAc转化方法如下：

将上述构建的质粒转入酿酒酵母菌株EBY100菌株中；从YPD平板挑取酿酒酵母单菌落细胞于YPD培养基过夜活化，次日1 %转接，生长至OD₆₀₀为0.6左右做感受态细胞。

1. 放置于4 ℃预冷10 min，4℃下3000 xg离心2 min，弃掉上清（收集1 ml菌液）。

2. 使用1.5 ml预冷的ddH₂O重悬，4 ℃下3000 xg离心2 min，弃掉上清。

3. 重复第2步一次。

4. 使用500μL预冷的100 mM LiTE重悬，4℃下3000 xg离心2 min，弃掉上清。

5. 使用100 μL 100 mM LiTE重悬至1.5 mL离心管中，于转化前置于冰上（感受态细胞在4 ℃存放不超过一周）。

（2）酿酒酵母的转化：

1. 取100 μL感受态细胞至新的1.5 ml离心管，8000 xg离心2 min，弃掉上清。

2. 取一新1.5 ml离心管，分别加入240 μL的50 %（m/v）PEG3350，36 μL的1 MLiAc，20 μL的5 mg/ml ssDNA（变性鱼精DNA），2 μL (1000 ng)构建的上述质粒， ddH₂O补齐至360μL，充分混匀，备用。

3. 使用第2步中360 μL混合液重悬第1步中的感受态细胞，可使用移液器吹打。

4. 于42 ℃中热激40 min。

5. 加入700 μL YPD培养基，于30 ℃复苏2 h（不能加抗生素）。

6. 6000 xg离心2 min，去除掉900 μL上清。

7. 使用剩下的上清液进行重悬，涂布于YNB（0.67 % YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，2 %葡萄糖，0.01 %亮氨酸，0.01 %色氨酸，1.5 %琼脂）固体平板上，于30 ℃静止培养36-48 h，获得阳性克隆。

2、重组酿酒酵母工程菌株的培养

将活化后的上述酿酒酵母工程菌株按1 %接种到含有0.67 % YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，2 %葡萄糖，0.01 %亮氨酸，0.01 %色氨酸的最小的葡萄糖液体培养液中，30 ℃，180 rpm条件下振荡培养，当OD₆₀₀为2-5时，在含有2 %的半乳糖YNB-CAA（0.67 % YNB(含硫酸铵，不含氨基酸)，0.5 % 酪蛋白氨基酸，2 %葡萄糖或半乳糖）培养基中重悬细胞，3000-5000 xg，5-10 分钟，待其OD为0.5-1时，在30 ℃，180 rpm条件下振荡培养后，收获细胞并用50 mM Tris-HCl（pH 7.8）洗涤，并进行后续酶活实验检测。

3、酶活性检测

将上述制备得到的含有pYD1-DntB质粒、pYD1-DntA质粒的工程菌株（分别为DntA和DntB展示工程菌株）以及含有pRS41h-DntB质粒、pRS41h-DntA质粒的工程菌株（胞内表达菌株）分别活化诱导培养，得到的全细胞催化剂进行酶活反应检测。还原型辅酶Ⅰ（NADH）是DntA催化反应中的辅酶，以2,4-DNT为底物，检测NADH在340nm处的最大吸收值，计算某时间内340 nm处最大吸收值的变化去计算NADH量的减少，从而知道DntA的催化活性；每分钟消耗1 µmol NADH定义为一个活力单位。DntB检测原理同DntA相同，以4-甲基邻苯二酚为底物，检测还原型辅酶Ⅱ（NADPH）量的减少去计算DntB的催化活性，每分钟消耗1 µmol NADPH定义为一个活力单位。

4、DntA、DntB的细胞表面定位分析

对于荧光成像，诱导后的菌株用 PBS 洗涤并用含有 1% 牛血清白蛋白 (BSA) 的PBS 缓冲液在室温下封闭 0.5 小时。然后加入抗 6xHis Tag 小鼠单克隆抗体 (1:200)并在室温下孵育 2 小时。用 PBS 洗涤 3 次后，将细胞与 FITC偶联驴抗小鼠 IgG (1:200) (Sangon Biotech Co., Ltd, China.) 室温孵育 1 h。在荧光显微镜（Axio ScopeA1，Carl Zeiss，Germany）下观察 PBS 洗涤的细胞。

结果如图5所示，酶蛋白被成功展示到细胞表面，说明通过锚定蛋白的作用，将DntA、DntB带到细胞膜外面，并固定在细胞膜上。

5、胞内外酶活的比较

将上述制备得到的含有pYD1-DntB质粒、pYD1-DntA质粒的工程菌株（分别为DntA和DntB展示工程菌株）以及含有pRS41h-DntB质粒、pRS41h-DntA质粒的工程菌株（胞内表达菌株）分别活化诱导培养，获得的全细胞催化剂（OD600=1）分别再添加到含有2,4-DNT至终浓度为1 mg/L，在37 ℃反应1 h后，离心使其反应停止。使用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测反应物的吸光值，并测DntA、DntB的酶活性。

结果图6所示，连接了锚定蛋白的菌株中DntA、DntB的酶活均比相应胞内表达菌株的酶活提高了10倍左右。

6、添加不同比例全细胞催化剂的检测

将DntA、DntB展示工程菌株于培养、洗涤后，得到的不同全细胞催化剂，按不同比例混合后，添加到含有1 mg/ml的2,4-DNT且OD₆₀₀为1的相同缓冲液中，两种全细胞催化剂具体的混合体积比参见图7，在20 ℃反应后，使用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测其吸光值，测DntA、DntB的酶活。

结果如图7显示，当由DntA、DntB展示工程菌株培养洗涤后得到全细胞催化剂的体积比为5:1时，420nm处的吸光值最高，说明两个酶级联反应的酶活最好。

7、特异性检测

将上述优化好的菌株培养诱导结束后，将收获的细胞添加到含有1 mg/L的2,4-DNT、苯、甲苯、硝基苯、苯酚、苯胺、2-硝基甲苯、3-硝基甲苯、4-硝基甲苯，20 ℃ 放置反应，离心停止后，使用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测其吸光值。

结果如图8显示，本发明中构建的菌株对2,4-DNT有较好的特异性，对于复杂样品的实际检测准确性高。

8、不同浓度的2,4-DNT的检测

将上述优化好的菌株培养诱导结束后，收获细胞后用50 mM Tris-HCl（pH 7.8）洗涤，将洗涤后的全细胞催化剂添加到含有0.0005 mg/L-1 mg/L的2,4-DNT中，OD为1，20 ℃反应后，离心停止，使用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测其吸光值。

结果如图9和10显示，随着2,4-DNT浓度的增加，吸光值随着爆炸物分子浓度的增大呈线性增加，且肉眼可见，生物传感器培养液的颜色越来越红，这是因为该生物传感器能够将爆炸物分子2,4-DNT降解成一种肉眼可见的红色物质2-羟基-5-甲基苯醌，进而可以简单的通过肉眼，即可判断待测样品中是否存在爆炸物分子，并且其在420nm处具有最大吸光值。本发明构建的2,4-DNT生物传感器的检测范围为0.0005 mg/L-1 mg/L，最低检测限为0.0005 mg/L (S/N=3)，远低于之前已报道的其它方法，比已报道的最低检测限低20倍。

9、生物传感器的稳定性检测

为了确定本发明中两种表面展示菌株的稳定性，将上述收获的全细胞催化剂放置4 ℃，在不同的时间间隔测定酶活。

相对酶活结果如图11所示，在4 ℃孵育一个月后，它能保持超过90 %的初始活性，孵育半年（180天）后，仍能保持超过80 %的初始活性，说明该生物传感器的稳定性很好。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3231

<212> DNA

<213> 目标基因(DntA )

<400> 1

atggaactgg tagtagaacc cctcaatttg catctgaacg cggagaccgg cagcaccctg 60

cttgacgtgc tcaggtccaa cgaggtcccc atttcttata gctgcatgtc gggccgctgc 120

ggcacttgcc gttgccgtgt gattgccggc catcttcgcg ataacggccc cgagacaggg 180

cgcccgcagg caggaaaggg ggcctatgtc ctggcctgtc aggcggttct gaccgaagac 240

tgcacgatcg agattcctga atctgacgag atcgtggttc acccggcgcg catcgtcaag 300

gggacggtca cagcgataga cgaagccacc catgacatcc ggcgcctgcg catcaaactg 360

gccaaaccgc ttgagttcag ccctggccag tacgcaacgg tgcagttcac gcccgaatgc 420

gtccgcccct attcgatggc cgggctgcct agcgatgcgg aaatggagtt tcagattcgc 480

gcggttccgg gcgggcatgt cagcaactac gttttcaatg aactgtccgt aggcgcttcg 540

gtgcggatca gcggccccct cggaacggcc tatctgcggc gcacgcacac cggccccatg 600

ctttgtgtgg ggggtggaac aggtctggcg cccgtccttt cgatcgttcg aggcgcactg 660

gaaagcggga tgagcaaccc catccatctg tacttcggtg tgcggagcga gcaggacatc 720

tatgacgagg aacgccttca cgcattggct gcaaggtttc cgaatctcaa ggtgaatgtc 780

gttgttgcaa caggccctgc cggccctggt catcgatccg gcctggtcac cgatctgatc 840

ggccgtgact tgcccaattt ggcgggatgg cgcgcctacc tgtgtggcgc tccggccatg 900

gtcgaggccc tgaacctgct cgttgctcgc ctaggcatag tacccgggca catccatgcc 960

gatgcgttct atcccagcgg cgtctgaatg agcgagaact ggatcgacgc cgccgcccgc 1020

gacgaggtgc ccgagggcga cgtgatcggc atcaatatcg tcggcaagga gattgccctc 1080

tacgaggtgg cgggcgagat ctacgccacc gacaacacct gcactcacgg cgccgcccgc 1140

atgagcgatg gctttctcga aggccgggaa attgaatgtc ctttgcatca aggccgattc 1200

gatgtttgca cgggtaaagc cttgtgcaca cccctgacac aggacatcaa aacctacccc 1260

gtaaaaatcg aaaacatgcg cgtgatgctc aagctggact aaatgagtta ccaaaactta 1320

gtgagtgaag cagggctgac gcaaaagcac ctgatttatg gcgacaaaga acttttccag 1380

cacgaattga agaccatctt cgcgcggaac tggctttttc tgacccatga cagtctgatt 1440

ccctcccccg gcgactatgt caaagccaaa atgggcgtcg atgaagtcat cgtctcccgc 1500

cagaacgatg gctcggtgcg agcctttttg aatgtttgcc gtcaccgggg caagacaata 1560

gttgacgctg aagccggaaa tgcgaaaggc tttgtgtgcg gttaccacgg ctggggctat 1620

ggctccaacg gcgaactgca aagcgttccc tttgaaaaag agttgtacgg agatgcgatc 1680

aaaaagaaat gcctgggctt gaaagaagtc ccccgcatcg aaagctttca tggctttatc 1740

tatggctgtt ttgatgcaga agctcccccg ctcatcgatt atctgggtga tgcagcctgg 1800

tacctggaac ccaccttcaa gcactctggt ggcctggaac ttgtaggccc ccccggcaaa 1860

gtggtggtta aggccaactg gaagcctctt gcggaaaact ttgtaggtga cgtctaccac 1920

attggttgga cgcacgcatc tattttgcgc gcagggcagt cgatatttgc tcctcttgcg 1980

ggcaacgcta tgtttccacc cgaaggcgcg ggcttgcaaa tgaccaccaa gtatggcagt 2040

ggaattggcg tattgtggga cgcctactcc ggtatccaga gcgctgatat ggttcccgaa 2100

atgatggcat tcggcggcgc aaaacaggaa aagctcgcca aagaaatcgg cgatgtccgg 2160

gcgcggattt accgcagcca actgaacggc acggttttcc cgaacaacag ctttttgacc 2220

tgctccggtg tcttcaaggt ctttaacccg atcgatgaaa acacgaccga ggtttggacg 2280

tatgccatcg tagaaaaaga catgcctgag gacttaaagc gtcgcttggc tgacgcggtt 2340

cagcgcagtg tcggaccagc aggatactgg gaaagcgacg acaacgacaa catggggacg 2400

ttgtcgcaaa atgccaagaa ataccaatcc agcaacagtg atctgattgc cgatttgggt 2460

ttcggcaagg acgtctacgg cgacgaatgc tatccgggcg tcgttggcaa atcggcaatc 2520

agcgaaacca gctatcgcgg attctaccgt gcctaccagg ctcacatcag cagctccaat 2580

tgggccgagt tcgaaaacac ctcccgaaat tggcacaccg aactcaccaa gacgactgat 2640

cgctaaatga tgatcaatac ccaggaagac aagctggtct ccgcgcacga cgccgaagaa 2700

tttcaccgtt tcttcgtcgg gcacgacagc gatctgcagc aagaagtcac cacactcctg 2760

acccgcgaag cgcacctgct ggacattcag gcctacaaag cctggcttga acactgcgtt 2820

gcccccgaga tcaaatacca agtgatctcg cgagaacttc gctccacttc cgagcgtcga 2880

taccaactga atgatgcggt gaatatctac aacgagaact atcaacagct gaaagttcga 2940

gttgaacacc agatggatcc tcagaactgg tacaacagcc cgaagatccg cttcacccgc 3000

ttcgtcacca atgtcacggc ggccaaggac aagagcgcac cggaaatgct gcatgtgcgg 3060

tccaacctca ttctccatcg cgccagacga ggaaaccaag ttgacgtctt ctatgcaacg 3120

cgagaagaca aatggaaacg catcgaaggt ggtggcatca aattggtcga acgctttgtg 3180

gactacccgg agcgcagtcc ccaaacccac aacctgataa tcttcctgtg a 3231

<210> 2

<211> 987

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAa)

<400> 2

atggaactgg tagtagaacc cctcaatttg catctgaacg cggagaccgg cagcaccctg 60

cttgacgtgc tcaggtccaa cgaggtcccc atttcttata gctgcatgtc gggccgctgc 120

ggcacttgcc gttgccgtgt gattgccggc catcttcgcg ataacggccc cgagacaggg 180

cgcccgcagg caggaaaggg ggcctatgtc ctggcctgtc aggcggttct gaccgaagac 240

tgcacgatcg agattcctga atctgacgag atcgtggttc acccggcgcg catcgtcaag 300

gggacggtca cagcgataga cgaagccacc catgacatcc ggcgcctgcg catcaaactg 360

gccaaaccgc ttgagttcag ccctggccag tacgcaacgg tgcagttcac gcccgaatgc 420

gtccgcccct attcgatggc cgggctgcct agcgatgcgg aaatggagtt tcagattcgc 480

gcggttccgg gcgggcatgt cagcaactac gttttcaatg aactgtccgt aggcgcttcg 540

gtgcggatca gcggccccct cggaacggcc tatctgcggc gcacgcacac cggccccatg 600

ctttgtgtgg ggggtggaac aggtctggcg cccgtccttt cgatcgttcg aggcgcactg 660

gaaagcggga tgagcaaccc catccatctg tacttcggtg tgcggagcga gcaggacatc 720

tatgacgagg aacgccttca cgcattggct gcaaggtttc cgaatctcaa ggtgaatgtc 780

gttgttgcaa caggccctgc cggccctggt catcgatccg gcctggtcac cgatctgatc 840

ggccgtgact tgcccaattt ggcgggatgg cgcgcctacc tgtgtggcgc tccggccatg 900

gtcgaggccc tgaacctgct cgttgctcgc ctaggcatag tacccgggca catccatgcc 960

gatgcgttct atcccagcgg cgtctga 987

<210> 3

<211> 315

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAb)

<400> 3

atgagcgaga actggatcga cgccgccgcc cgcgacgagg tgcccgaggg cgacgtgatc 60

ggcatcaata tcgtcggcaa ggagattgcc ctctacgagg tggcgggcga gatctacgcc 120

accgacaaca cctgcactca cggcgccgcc cgcatgagcg atggctttct cgaaggccgg 180

gaaattgaat gtcctttgca tcaaggccga ttcgatgttt gcacgggtaa agccttgtgc 240

acacccctga cacaggacat caaaacctac cccgtaaaaa tcgaaaacat gcgcgtgatg 300

ctcaagctgg actaa 315

<210> 4

<211> 1344

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAc)

<400> 4

atgagttacc aaaacttagt gagtgaagca gggctgacgc aaaagcacct gatttatggc 60

gacaaagaac ttttccagca cgaattgaag accatcttcg cgcggaactg gctttttctg 120

acccatgaca gtctgattcc ctcccccggc gactatgtca aagccaaaat gggcgtcgat 180

gaagtcatcg tctcccgcca gaacgatggc tcggtgcgag cctttttgaa tgtttgccgt 240

caccggggca agacaatagt tgacgctgaa gccggaaatg cgaaaggctt tgtgtgcggt 300

taccacggct ggggctatgg ctccaacggc gaactgcaaa gcgttccctt tgaaaaagag 360

ttgtacggag atgcgatcaa aaagaaatgc ctgggcttga aagaagtccc ccgcatcgaa 420

agctttcatg gctttatcta tggctgtttt gatgcagaag ctcccccgct catcgattat 480

ctgggtgatg cagcctggta cctggaaccc accttcaagc actctggtgg cctggaactt 540

gtaggccccc ccggcaaagt ggtggttaag gccaactgga agcctcttgc ggaaaacttt 600

gtaggtgacg tctaccacat tggttggacg cacgcatcta ttttgcgcgc agggcagtcg 660

atatttgctc ctcttgcggg caacgctatg tttccacccg aaggcgcggg cttgcaaatg 720

accaccaagt atggcagtgg aattggcgta ttgtgggacg cctactccgg tatccagagc 780

gctgatatgg ttcccgaaat gatggcattc ggcggcgcaa aacaggaaaa gctcgccaaa 840

gaaatcggcg atgtccgggc gcggatttac cgcagccaac tgaacggcac ggttttcccg 900

aacaacagct ttttgacctg ctccggtgtc ttcaaggtct ttaacccgat cgatgaaaac 960

acgaccgagg tttggacgta tgccatcgta gaaaaagaca tgcctgagga cttaaagcgt 1020

cgcttggctg acgcggttca gcgcagtgtc ggaccagcag gatactggga aagcgacgac 1080

aacgacaaca tggggacgtt gtcgcaaaat gccaagaaat accaatccag caacagtgat 1140

ctgattgccg atttgggttt cggcaaggac gtctacggcg acgaatgcta tccgggcgtc 1200

gttggcaaat cggcaatcag cgaaaccagc tatcgcggat tctaccgtgc ctaccaggct 1260

cacatcagca gctccaattg ggccgagttc gaaaacacct cccgaaattg gcacaccgaa 1320

ctcaccaaga cgactgatcg ctaa 1344

<210> 5

<211> 585

<212> DNA

<213> 目标基因(DntAd)

<400> 5

atgatgatca atacccagga agacaagctg gtctccgcgc acgacgccga agaatttcac 60

cgtttcttcg tcgggcacga cagcgatctg cagcaagaag tcaccacact cctgacccgc 120

gaagcgcacc tgctggacat tcaggcctac aaagcctggc ttgaacactg cgttgccccc 180

gagatcaaat accaagtgat ctcgcgagaa cttcgctcca cttccgagcg tcgataccaa 240

ctgaatgatg cggtgaatat ctacaacgag aactatcaac agctgaaagt tcgagttgaa 300

caccagatgg atcctcagaa ctggtacaac agcccgaaga tccgcttcac ccgcttcgtc 360

accaatgtca cggcggccaa ggacaagagc gcaccggaaa tgctgcatgt gcggtccaac 420

ctcattctcc atcgcgccag acgaggaaac caagttgacg tcttctatgc aacgcgagaa 480

gacaaatgga aacgcatcga aggtggtggc atcaaattgg tcgaacgctt tgtggactac 540

ccggagcgca gtccccaaac ccacaacctg ataatcttcc tgtga 585

<210> 6

<211> 1683

<212> DNA

<213> 目标基因(DntB)

<400> 6

gtgcatcacg tttctactaa gtcgccgtct accttgtcgg cggagtgtga agttctcatc 60

gtcgggggta gcttggtcgg cttgtcgctt gcaaactttc tcggccacca cggcgtaagc 120

gctgcagtcg tcgagcggca caagggaacg gccatccacc ctcgtgctgg ccactttcac 180

ctgaggacca ttgaagcatt tcgatatgca ggaatcgagc cagaagtcat gcaggagtct 240

cttcgacagt tcgatccgga cggcggtatc aacgtcgtcg aatcgcttgc cggcaaggag 300

atcgccagcc tgattggcaa cttgaacgaa ggcgtcgaaa aactcagtcc aagtaagcgc 360

ctgttcatga cacaacaaag tctcgaaccc ttgcttagaa agaacgctga aaagctgggg 420

gcccaactta actaccagat ggaattggtt tcattcgagc aggacgccac gggtgtgact 480

gcgcgagtca ggtacatccc atccggggcc gtgagccaag tgcgtgccaa gtacctaatc 540

gccgccgacg gtaaccgcag cccagtccga gagaagctcg gaattgaaat gcgcggctac 600

ggattactct ccaacagtat caccatctac ttcaaggcgg actgcacaaa atggatggct 660

ggacgcaacc tcggcgtggt ctatgtcaac aatcctgacg ttcgcggctt cttccgcttg 720

acgcgggagg ccaagagtgg cttcttgggt gtgaacaccg taggagatgt cagccgcccg 780

gaggcgaaca atgtcgctga aggtatcacg gcagagcgct gcgtcgaaat tgtacgttcc 840

gctgtgggca ttcccgatct ggaagttgaa attgagggca ttgccccgtg gcgcgccgtt 900

gccgatgtgg ctgaccgtta cagaagtgga aatgtgtttc tcatcggcga cgccgcacac 960

gtcgttcctc ctaccggcgg attcggcggg aacactggtg ttcaggacgc gcacaacctt 1020

ggttggaagc tggcttcagt actaaagggt caagcagggc cggctctgct cgacacctac 1080

gaggaggagc ggcgcccggt cggtcaactt acgatcgagc aggcctattc ccgatatgtg 1140

ctgcggatcg cacctgaact gggccgtgaa acgatgaagc ctgtggtcga cgacttgagc 1200

atggaaattg gctaccgcta tttctcatca gccatcttgt cgaacgaaaa gcggggagat 1260

cgtgtttacg ttgatccgcg cacgtcgttc agcttgcctg ggaccagagt gggacacctc 1320

gtctttcagc gagacgggaa atcgatggcg accctggacg tttgtgccgg tggtatgacc 1380

cttcttgccg gagcgggcgg cgtcgcctgg tgtcagtcga cgactgaagc tgccgtaaag 1440

ctgggtatcg aggtcgagtc gaacgtcatt ggaaacgcgg gtggactgac agatgtttca 1500

ggtcgcgcgc tcgaggttct cggaatcgaa agcgcaggtg caattctggt gcgccccgac 1560

ggtttcgtgg cttggcgctc agaacccggt gaggccgcga gtgtcgcgag gatgatcaac 1620

gtgctgaccg ctgtaatgtg tctccagagt cagcgcgtag atgcatcggt cgtagctgcc 1680

taa 1683

<210> 7

<211> 2265

<212> DNA

<213> 锚定蛋白a凝集素(Allo-A)

<400> 7

atgcagttac ttcgctgttt ttcaatattt tctgttattg cttcagtttt agcacaggaa 60

ctgacaacta tatgcgagca aatccccatg acattatctt tcgctcattt tacctacctg 120

ttcacaatat tgttgggatt aactaatatt gccttggcat ctgatccaga aacgattcta 180

gtgacgataa ccaagacaaa cgatgcaaat ggggttgtta caactacagt ttcacccgcg 240

ctagtctcca catccactat cgttcaagct ggcactacga cattgtatac gacttggtgt 300

ccattgacgg tatccacttc atctgctgcc gaaataagtc cttcaatatc gtacgctact 360

accctatcca gatttagtac tttgacatta tctacagaag tctgctccca tgaggcatgt 420

ccttcgtcat cgacgttgcc aaccaccacc ttatctgtga cttccaagtt cacttcatat 480

atttgcccta cttgtcacac aaccgctatc agctcattat ccgaagtagg aactacaacc 540

gtggtatcat ccagcgccat tgaaccatca agtgcctcta taatctcacc tgtcacctct 600

acactttcga gtacaacatc gtccaatcca actactacct ccctaagttc gacatctaca 660

tctccaagct ctacatctac atctccaagc tctacatcta cctcatcaag ttcgacatct 720

acctcatcaa gttcgacatc tacctcatca agttcgacat ctacatctcc aagttcgaca 780

tccacatctt caagtttgac atccacatct tcaagttcta catctacatc ccaaagttct 840

acatctacct catcaagttc gacatctaca tctccaagct ctacatctac ctcatcaagt 900

tcaacatcta catctccaag ttctaaatct acttctgcaa gctccacttc cacttcttca 960

tattcaacat ctacatcccc aagtttgact tcttcatctc caactttggc ttccacttct 1020

ccaagttcaa catctattag ctctactttt actgattcaa cttcatccct tggctcctct 1080

atagcatctt catcaacgtc tgtgtcatta tacagcccat ccacacctgt ttactccgtc 1140

ccttcgactt cgtcaaatgt tgcaactcct tctatgactt cttcaactgt tgaaacaact 1200

gttagttcac aaagttcgtc tgaatatatc accaaatcct caatttctac tactatccca 1260

tcattttcca tgtctacata tttcaccact gttagtggag tcactacaat gtatacgaca 1320

tggtgtcctt atagctctga atctgagact agcacattaa ccagtatgca tgaaacggtt 1380

acaacagacg ctacagtctg cactcacgag tcttgcatgc cctcgcagac aacaagtttg 1440

attacatctt ctataaaaat gtccactaaa aacgtcgcaa cttctgtaag cacctcaacg 1500

gttgaatcct catatgcatg ctccacatgt gctgaaacgt cacactcgta ttcttccgtg 1560

caaacagctt catcaagttc tgtaacacag cagaccacat ccacaaagag ttgggtaagt 1620

tcaatgacaa cttcggatga agatttcaat aagcacgcta ccggtaagta tcatgtaaca 1680

tcttcaggta cctcaaccat ttcgactagt gtaagtgaag ccacgagtac atcaagcatt 1740

gactcagaat ctcaagaaca atcatcacac ttattatcga catcggtcct ttcatcctcc 1800

tccttgtctg ctacattatc ctctgacagt actattttgc tattcagttc tgtatcatca 1860

ctaagtgtcg aacagtcacc agttaccaca cttcaaattt cttcaacatc agagatttta 1920

caacccactt cttccacagc tattgctaca atatctgcct ctacatcatc actttccgca 1980

acatctatct ctacaccatc tacctctgtg gaatcgacta ttgaatcttc atcattgact 2040

ccgacggtat cttctatttt cctctcatca tcatctgctc cctcttctct acaaacatct 2100

gttaccacta cagaagtttc cactacttca atctccatac aataccaaac ttcatcaatg 2160

gtaacaatta gccaatatat gggcagtgga tcgcaaacgc gtttgccatt aggaaagttg 2220

gtcttcgcca tcatggcagt tgcttgcaat gtaattttca gttaa 2265

<210> 8

<211> 5009

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60

cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120

acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180

ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240

ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300

taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360

ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420

ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac cccggatcgg actactagca gctgtaatac 480

gactcactat agggaatatt aagctaattc tacttcatac attttcaatt aagatgcagt 540

tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgcttcagt tttagcacag gaactgacaa 600

ctatatgcga gcaaatcccc tcaccaactt tagaatcgac gccgtactct ttgtcaacga 660

ctactatttt ggccaacggg aaggcaatgc aaggagtttt tgaatattac aaatcagtaa 720

cgtttgtcag taattgcggt tctcacccct caacaactag caaaggcagc cccataaaca 780

cacagtatgt ttttaagctt ctgcaggcta gtggtggtgg tggttctggt ggtggtggtt 840

ctggtggtgg tggttctgct agcatgactg gtggacagca aatgggtcgg gatctgtacg 900

acgatgacga taaggtacca ggatccagtg tggtggaatt ctgcagatat ccagcacagt 960

ggcggccgct cgagtctaga gggcccttcg aaggtaagcc tatccctaac cctctcctcg 1020

gtctcgattc tacgcgtacc ggtcatcatc accatcacca ttgagtttaa acccgctgat 1080

ctgataacaa cagtgtagat gtaacaaaat cgactttgtt cccactgtac ttttagctcg 1140

tacaaaatac aatatacttt tcatttctcc gtaaacaaca tgttttccca tgtaatatcc 1200

ttttctattt ttcgttccgt taccaacttt acacatactt tatatagcta ttcacttcta 1260

tacactaaaa aactaagaca attttaattt tgctgcctgc catatttcaa tttgttataa 1320

attcctataa tttatcctat tagtagctaa aaaaagatga atgtgaatcg aatcctaaga 1380

gaattgggca agtgcacaaa caatacttaa ataaatacta ctcagtaata acctatttct 1440

tagcattttt gacgaaattt gctattttgt tagagtcttt tacaccattt gtctccacac 1500

ctccgcttac atcaacacca ataacgccat ttaatctaag cgcatcacca acattttctg 1560

gcgtcagtcc accagctaac ataaaatgta agctctcggg gctctcttgc cttccaaccc 1620

agtcagaaat cgagttccaa tccaaaagtt cacctgtccc acctgcttct gaatcaaaca 1680

agggaataaa cgaatgaggt ttctgtgaag ctgcactgag tagtatgttg cagtcttttg 1740

gaaatacgag tcttttaata actggcaaac cgaggaactc ttggtattct tgccacgact 1800

catctccgtg cagttggacg atatcaatgc cgtaatcatt gaccagagcc aaaacatcct 1860

ccttaggttg attacgaaac acgccaacca agtatttcgg agtgcctgaa ctatttttat 1920

atgcttttac aagacttgaa attttccttg caataaccgg gtcaattgtt ctctttctat 1980

tgggcacaca tataataccc agcaagtcag catcggaatc tagagcacat tctgcggcct 2040

ctgtgctctg caagccgcaa actttcacca atggaccaga actacctgtg aaattaataa 2100

cagacatact ccaagctgcc tttgtgtgct taatcacgta tactcacgtg ctcaatagtc 2160

accaatgccc tccctcttgg ccctctcctt ttcttttttc gaccgaattt cttgaagacg 2220

aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa tggtttctta 2280

ggacggatcg cttgcctgta acttacacgc gcctcgtatc ttttaatgat ggaataattt 2340

gggaatttac tctgtgttta tttattttta tgttttgtat ttggatttta gaaagtaaat 2400

aaagaaggta gaagagttac ggaatgaaga aaaaaaaata aacaaaggtt taaaaaattt 2460

caacaaaaag cgtactttac atatatattt attagacaag aaaagcagat taaatagata 2520

tacattcgat taacgataag taaaatgtaa aatcacagga ttttcgtgtg tggtcttcta 2580

cacagacaag atgaaacaat tcggcattaa tacctgagag caggaagagc aagataaaag 2640

gtagtatttg ttggcgatcc ccctagagtc ttttacatct tcggaaaaca aaaactattt 2700

tttctttaat ttcttttttt actttctatt tttaatttat atatttatat taaaaaattt 2760

aaattataat tatttttata gcacgtgatg aaaaggaccc aggtggcact tttcggggaa 2820

atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 2880

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 2940

aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 3000

acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 3060

acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 3120

ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg 3180

ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 3240

caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 3300

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 3360

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 3420

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 3480

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 3540

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 3600

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 3660

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggca 3720

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 3780

agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 3840

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 3900

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 3960

cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4020

cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4080

tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4140

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4200

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4260

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4320

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag 4380

ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 4440

agcttccagg ggggaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 4500

ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggccgag cctatggaaa aacgccagca 4560

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 4620

cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 4680

gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 4740

tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 4800

ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttac ctcactcatt 4860

aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcctat gttgtgtgga attgtgagcg 4920

gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctc ggaattaacc 4980

ctcactaaag ggaacaaaag ctggctagt 5009

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgctcgaga tggaactggt agtagaac 28

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccagttctcg ctcatctcct tgacgccgct gggatag 37

<210> 11

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctatcccagc ggcgtcaagg agatgagcga gaactggatc gacg 44

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gttttggtaa ctcatctcct tgtccagctt gagcatcacg cg 42

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgctcaagc tggacaagga gatgagttac caaaacttag tga 43

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgggtattg atcatcatct ccttgcgatc agtcgtcttg gtgagtt 47

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aagacgactg atcgcaagga gatgatgatc aatacccagg aag 43

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctctagaca ggaagattat caggttgtgg 30

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccgctcgagg tgcatcacgt ttctactaag tcgcc 35

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctctagagg cagctacgac cgatgcatct a 31

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctctagaat ggaactggta gtagaac 27

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccagttctcg ctcatctcct tgacgccgct gggatag 37

<210> 21

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctatcccagc ggcgtcaagg agatgagcga gaactggatc gacg 44

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gttttggtaa ctcatctcct tgtccagctt gagcatcacg cg 42

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

atgctcaagc tggacaagga gatgagttac caaaacttag tga 43

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctgggtattg atcatcatct ccttgcgatc agtcgtcttg gtgagtt 47

<210> 25

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aagacgactg atcgcaagga gatgatgatc aatacccagg aag 43

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ataagaatgc ggccgccagg aagattatca ggttgtgg 38

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gctctagagt gcatcacgtt tctactaagt cgcc 34

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ataagaatgc ggccgcggca gctacgaccg atgcatcta 39

Claims

1.一种基于酵母细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器，其特征在于，所述爆炸物可视化生物传感器中含有锚定蛋白的编码基因和爆炸物可视化的目标基因；所述爆炸物可视化的目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.6所示；所述锚定蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；将两种含有不同目标基因的爆炸物可视化生物传感器混合使用。

2.权利要求1所述的爆炸物可视化生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）克隆爆炸物可视化的目标基因DntA或DntB基因；

（3）将克隆的DntA或DntB基因通过遗传操作分别插入步骤（2）中含有锚定蛋白基因的表达载体中，获得DntA或DntB酵母细胞表面展示表达重组载体；

（5）将所述含有DntA或DntB展示系统的酵母工程菌株活化培养后，洗涤收集菌体，获得具有DntA或DntB酶活性的全细胞催化剂，即为爆炸物可视化生物传感器；将两种含有不同目标基因的爆炸物可视化生物传感器混合使用。

3.权利要求1所述的爆炸物可视化生物传感器在用于爆炸物分子实时检测中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述爆炸物可视化生物传感器的使用方法是：将所述爆炸物可视化生物传感器加入待测样品中，20℃反应1 h后，肉眼观察培养液颜色，若此时显示红色则确定样品中含有爆炸物分子，且红色越深则爆炸物分子的浓度越高；然后离心终止反应，利用全细胞全波长分光光度计在420 nm处检测吸光值，根据标准曲线计算得出爆炸物分子的浓度，吸光值越大则爆炸物分子的浓度越高。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，混合使用时，将含有DntA和DntB基因的所述爆炸物可视化生物传感器以1:10-10:1的体积比混合。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述爆炸物可视化生物传感器能够检测到的爆炸物分子浓度的线性范围为0.0005 mg/L-1mg/L，最低检测限是0.0005 mg/L。