CN107557393B - 一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：1)采用阳离子聚合物对一定大小的磁性纳米颗粒团簇进行修饰获得一种纳米载体；2)提供靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒；3)将步骤1)所得纳米载体与所述靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒共孵育获得一种纳米复合物；以及4)在磁场作用下，将步骤3)所得纳米复合物与T细胞共孵育，制得一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统。根据本发明，提供了一种能对T细胞内目的基因进行简单、安全且高效编辑的方法，在肿瘤免疫治疗中具有良好的应用前景。

Description

一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及 其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种磁性纳米材料介导的 CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗通过间接或者直接激活人体T细胞来清除肿瘤细胞，对多种肿瘤特别是晚期肿瘤的治疗具有良好的效果，且安全性很好。2013年，该方法被Science评为年度十大科技突破之首。在抗肿瘤免疫过程中，T细胞被T细胞受体(T cell receptor，TCR)介导的抗原识别信号激活，同时众多的共刺激信号和共抑制信号精细调节T细胞反应的强度和质量，这些抑制信号即为免疫检查点。针对免疫检查点的阻断是增强T细胞激活的有效策略之一。目前，免疫检查点抑制剂相关抗体已被开发成药物并成功应用于肿瘤的免疫治疗中，但是该技术成本较高，病人的治疗费用十分昂贵，且副作用较大。

基因编辑技术，通过设计表达质粒等，靶向敲除T细胞内免疫检查点相关基因(如：PD-1，CTLA-4，TIM-3等)，从而降低甚至阻断免疫检查点的表达，是肿瘤免疫治疗的另一重要策略。目前，锌指核酸酶技术(ZFN)以及类转录激活因子效应物核酸酶技术(TALEN)这两种基因靶向修饰技术应用到靶向编辑T细胞的研究中。但是，这两种技术均依赖于DNA特异性结合蛋白的合成完成基因打靶，其过程繁琐、耗时且费用昂贵，不利于普及和推广使用。RNA介导的CRISPR/Cas9技术作为第三代基因组编辑技术，使用序列特异性向导RNA分子(sequence-specific guide RNA，gRNA)引导核酸内切酶到靶点，完成目的基因组的编辑。该方法简单、成本低且编辑效率高，已对诸多类型细胞内的基因成功进行了编辑。但是，该方法对T细胞的编辑效果仍十分有限。原代T细胞是悬浮细胞且尺寸很小(约4～10μm)，使用常规脂质体技术很难进行转染。目前，研究人员使用电转或病毒载体技术虽然使转染效率有所改善，但这两种方法都存在缺点。电转过程会对细胞膜造成不可逆的损伤而导致细胞毒性。病毒载体免疫原性较大，极易产生细胞毒性，甚至插入基因组导致安全性问题。此外，病毒装载质粒过程较为繁琐，不利于普及和推广使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用，从而解决现有技术中肿瘤免疫治疗方法费用昂贵、副作用大、过程繁琐、甚至容易产生细胞毒性的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T 细胞内递送系统的制备方法，包括以下步骤：1)采用阳离子聚合物对一定大小的磁性纳米颗粒团簇进行修饰获得一种纳米载体；2)提供靶向目标基因的 CRISPR/Cas9系统表达质粒；3)将步骤1)所得纳米载体与所述靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒共孵育获得一种纳米复合物；以及4)在磁场作用下，将步骤3)所得纳米复合物与T细胞共孵育，制得一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统。

根据本发明，步骤4)中的磁场包括均匀磁场和非均匀磁场。换句话说，本发明对于磁场没有特殊要求，使用常规磁场，无论是均匀磁场，还是非均匀磁场，均能实现高效的转染效果。

常规磁场包括钕铁硼永久磁场(50mT～1T)或梯度在30～200T m^-1的磁场等在内的普通磁场。均匀磁场包括但不局限于由亥姆霍兹线圈和螺线管等产生的均匀磁场。磁场作用时间优选为10～45min，根据不同细胞系选择最佳作用时间。磁场作用温度为20～37℃，其中最佳地为37℃。

根据本发明，所述磁性纳米颗粒团簇的粒径优选为50～200nm，具有团簇结构的磁性纳米颗粒既能提高磁场响应能力，还能提高对DNA的吸附量。

根据本发明所提供的方法，其工作原理为：首先采用阳离子聚合物修饰磁性纳米颗粒团簇，使其带有正电荷，然后通过静电相互作用吸附 CRISPR/Cas9系统表达质粒，更多地吸附带负电的质粒DNA，纳米载体的团簇结构大大提高了对质粒DNA的负载量。在磁场作用下，团簇结构具有较强的磁场响应力，合适的团簇粒径使得纳米载体能被T细胞大量摄取，因此能安全高效地将CRISPR/Cas9系统表达质粒运送至T细胞内，实现对T细胞中目的基因的高效编辑。

所述磁性纳米颗粒可以是Fe₃O₄，γ-Fe₂O₃或CoFe₂O₄纳米颗粒等所有常规具有磁性的纳米材料。

所述磁性纳米颗粒在溶液中具有团簇结构，具有团簇结构的磁性纳米颗粒可以是直接购买所得，也可以是通过化学反应使单分散的磁性纳米颗粒形成团簇结构。

步骤1)中所述的阳离子聚合物选自：聚丙烯氯化铵(PAH)、L-多聚赖氨酸(PLL)、D-多聚赖氨酸(PDL)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEA)、阳离子聚丙烯酰胺(CPAM)、聚乙二醇(PEG)、壳聚糖(CS)等。

步骤2)中所述的靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统包括表达Cas9蛋白和/或sgRNA的质粒，其中，表达Cas9蛋白的质粒有pMJ920和 pCAG-T3-hCAS-pA等，表达sgRNA的质粒有pAC1429-pX-sgRNA-10xPBSc、 SP6-sgRNA-scaffold、pAC1374-pX-sgRNA-5xPBSb等，Cas9蛋白和sgRNA 共表达质粒有pX330、pX458或pX459等。

当使用Cas9蛋白和sgRNA两种表达质粒时，具体实施时Cas9蛋白和 sgRNA表达质粒的质量比优选为1：0.5～4：1。

作为举例而非限制，根据本发明提供的一种靶向目标基因的 CRISPR/Cas9系统，以pX458为例，其sgRNA的设计原则为：种属信息为人源，sgRNA靶向位点位于目标基因的外显子区域，sgRNA靶向位点符合5’– 20nt–NGG或5’–CCN–20nt的序列原则；脱靶率低。

所述的靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统构建中，根据选择的sgRNA 序列(smallguide RNA，小向导RNA)，获得其对应的DNA互补链，需在正向链和反向链5’端分别加上和质粒上相应位置相同的粘性末端，便于后续连接DNA双链和线性化的质粒，sgRNA序列的修饰方法依据所选的表达质粒而定，表达质粒相同，任何序列的sgRNA修饰方法相同。若更换表达质粒，则需依据所选质粒线性化后的粘性末端序列确定修饰方法。分别合成上述正向链和反向链后，变性、退火后即可连入表达载体中。

所述纳米载体与所述靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒孵育的比例优选为：1:1～30:1，其中最佳地为5:1～20:1；孵育的时间优选为：10-30min，其中最佳地为15min；孵育的温度为4-37℃，其中最佳地为25℃。

步骤4)中所述的T细胞包括但不局限于CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、 NKT细胞等原代T细胞，或Jurkat等T细胞株。

根据本发明的第二方面，提供一种根据上述制备方法制得的磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统。

根据本发明的第三方面，还提供一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统在T细胞目的基因编辑中的应用。

该应用包括对常规T细胞中任意目的基因的编辑。

虽然众所周知的是，Fe₃O₄等磁性纳米材料具有良好的生物相容性，在磁场作用下，可作为载体向多种细胞内实现高效递送基因。但是，现有技术中应用磁性纳米载体向T细胞内递送基因的工作却还从未见过报道，主要原因可能是T细胞对常规磁性纳米材料的摄取效率较低以及常规磁性纳米颗粒的磁场响应力较低。

然而，根据本发明，发明人首次采用具有团簇结构且粒径在50～200nm 范围内的磁性纳米颗粒。首先，团簇结构能显著提高磁性纳米颗粒的磁场响应力并提高磁性纳米颗粒对质粒DNA的负载量。其次，合适的团簇粒径能显著提高T细胞对磁性纳米载体的摄取效率，预期能得到一种有效的磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统，并将其应用于T细胞中目的基因的高效的以及安全的编辑。因此，对于本领域技术人员来说，本发明相对现有技术均是非显而易见的。

本发明的积极进步效果还在于：

本发明制备的磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统，在磁场作用下，快速高效地将CRISPR/Cas9系统表达质粒运送至人T细胞内。在实际应用中，最优地，该磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统对目的基因的编辑效率达到48％，从而彻底解决目前向T细胞内递送 CRISPR/Cas9系统表达质粒难的问题。

总之，本发明提供了一种能对T细胞内目的基因进行简单、安全且高效编辑的方法，在肿瘤免疫治疗中具有良好的应用前景。

附图说明

图1是pX458质粒的图谱；

图2A是Fe₃O₄-PEI纳米颗粒的TEM表征图(左)及对磁场的响应能力 (右)；

图2B是Fe₃O₄-DNA复合物的TEM表征图(左)及对磁场的响应能力 (右)；

图3A是Fe₃O₄纳米单分散颗粒的TEM表征图(左)及对磁场的响应能力(右)；

图3B是Fe₃O₄纳米团簇的TEM表征图(左)及对磁场的响应能力(右)；

图4是Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9质粒T细胞内递送的荧光成像图，从左至右依次为对照组，无磁场组，有磁场组；

图5是Fe₃O₄纳米单分散颗粒和团簇介导的CRISPR/Cas9质粒T细胞内递送效果比较的荧光成像图；

图6A和图6B分别是大团簇的Fe₃O₄纳米颗粒和小团簇的Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9质粒T细胞内递送效果的荧光成像图；

图7A是T7E1酶切鉴定Fe₃O₄纳米颗粒递送CRISPR/Cas9在不同磁场下进入T细胞靶向敲除PD-1基因的切割效率比较，从左至右依次为对照组，无磁场组，有磁场组；

图7B是Fe₃O₄纳米颗粒递送CRISPR/Cas9进入T细胞靶向敲除PD-1 基因的测序结果，其中，灰色框指示碱基缺失位置；

图8是T7E1酶切鉴定Fe₃O₄纳米颗粒和Lipo3000递送CRISPR/Cas9进入T细胞靶向敲除PD-1基因的切割效率比较，从左至右依次为对照组，Lipo 组，Fe₃O₄组；

图9是磁场、Fe₃O₄-DNA复合物以及两者共同作用于人原代CD4⁺T细胞 48h的细胞存活率比较。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明内容。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明主要选择磁性Fe₃O₄纳米颗粒为代表，颗粒表面修饰的阳离子聚合物以聚乙烯亚胺(PEI)为代表，递送的CRISPR/Cas9系统表达质粒以共表达Cas9蛋白和sgRNA并带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的pX458为主，细胞选择人原代CD4⁺T细胞，目的基因以PD-1为代表，以下实施例具体说明本发明的实施效果。

实施例1 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD-1基因质粒载体的构建

获取sgRNA双链(与目的sgRNA互补的DNA双链)片段。靶向人PD-1 基因的sgRNA序列选用自文献(Shu Su.et al.CRISPR-Cas9mediated efficient PD-1disruption onhuman primary T cells from cancer patients.Scientific Reports 2016；6:20070)，正向链：5’-GCAGTTGTGTGACACGGAAG，反向链：5’-CTTCCGTGTCACACAACTGC。根据选择的sgRNA靶点序列，合成一对序列互补的DNA寡核苷酸链(Takara公司合成)：

正向链S1：5’-CACCGCAGTTGTGTGACACGGAAG(SEQ ID No：1)；

反向链S2：5’-AAACCTTCCGTGTCACACAACTGC(SEQ ID No：2)。

将一对DNA寡核苷酸链退火成双链DNA，退火体系(20μL)如下：正向链(100μM)1μL；反向链(100μM)1μL；灭菌水18μL。退火程序如下： 1)95℃保持5min；2)95℃到25℃，以-1℃/s的速率降低温度，共执行70个循环；3)25℃保持7min；4)4℃保存。

线性化质粒pX458(Addgene plasmid#48138)。酶切体系(10μL)如下： pX458质粒2μg；10X NEB 2.1buffer,5μL；BbsI 100/U,1μL；灭菌水补齐至50μL，37℃孵育20min。用PCR产物纯化试剂盒(Clontech,639615)纯化回收线性化的质粒至30μL灭菌水中。

连接退火双链DNA和线性化质粒。体系如下：线性化pX458质粒50ng，退火双链DNA2μL，T4DNA连接酶0.2μL，10X ligase buffer 1μL，灭菌水补齐至10μL,25℃孵育3h。获得连接产物后，转化大肠杆菌DH5α感受态，并涂氨苄青霉素平板。过夜培养，挑取单克隆,4mL LB培养基(含0.1％氨苄青霉素)体系扩增培养16h。使用质粒小提试剂盒(天根生化科技有限公司，DP103)提取单克隆质粒，用常规测序方法鉴定阳性克隆。

结果：构建好的质粒测序结果见SEQ ID No：3，表明成功构建了能够特异性靶向敲除人PD-1基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒。

实施例2 Fe₃O₄纳米颗粒介导CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统的制备

Fe₃O₄纳米颗粒(单颗粒粒径10nm，团簇粒径5～200nm，Chemicell)。聚乙烯亚胺修饰该纳米颗粒(具体见文献:蔡元元等，PEI修饰磁性Fe₃O₄纳米粒的制备和表征,科技导报，2010，28，68)。Fe₃O₄纳米颗粒团簇分散于水溶液中，逐滴加入Millipore water稀释的PEI溶液(Sigma-aldrich，average Mw 800，货号408719)，质量比为1:8，1400r/min搅拌30min，得到PEI修饰的Fe₃O₄纳米颗粒(Fe₃O₄-PEI)。在磁场作用下，观察其磁场响应能力。

将Fe₃O₄-PEI和靶向敲除人PD-1基因的质粒以质量比10:1混合于 millipore纯水中，室温孵育15-30min，离心得Fe₃O₄-质粒复合物 (Fe₃O₄-DNA)。在磁场作用下，观察其磁场响应能力。

结果：紫外分光光度计测得Fe₃O₄-PEI对质粒DNA的吸附量为97.6％，吸附质粒DNA后，颗粒表面形成一层透明物质，平均Zeta电位从23.6eV 下降到-15.4eV，Fe₃O₄-DNA团簇的平均粒径为155nm。Fe₃O₄-PEI和 Fe₃O₄-DNA复合物透射电镜成像分别见图2A(左)、图2B(左)，两者均水溶性良好，在磁场作用下表现出很强的磁场响应能力，分别见图2A(右)、图2B(右)。

实施例3 Fe₃O₄纳米颗粒在团簇和单分散情况下的磁场响应力比较

Fe₃O₄纳米颗粒(单分散，杭州纳晶)。将PBS缓冲液和Fe₃O₄纳米颗粒溶液(1mg/mL)等体积混合，350rpm振荡2h，得到Fe₃O₄纳米颗粒团簇，在磁场作用下，观察其磁场响应能力。

结果：Fe₃O₄纳米单分散颗粒平均粒径为13nm，加入PBS缓冲液后，形成的Fe₃O₄纳米团簇平均粒径为179nm。Fe₃O₄纳米颗粒单颗粒和团簇透射电镜成像分别见图3A(左)、图3B(左)，两者水溶性良好。在磁场作用下单颗粒无明显的磁场响应能力，而团簇具有良好的磁场响应能力，分别见图3A(右)、图3B(右)。

实施例4 Fe₃O₄纳米颗粒在团簇和单分散情况下对质粒DNA吸附量比较

Fe₃O₄纳米单分散颗粒的来源和团簇的制备方法同实施例3，纳米材料的修饰及吸附质粒DNA的方法同实施例2。

结果：Fe₃O₄纳米单分散颗粒吸附质粒DNA后，平均粒径为39nm，Fe₃O₄团簇吸附质粒DNA后，平均粒径为196nm。紫外分光光度计测得Fe₃O₄纳米单分散颗粒对质粒DNA的吸附量为60.9％，Fe₃O₄团簇对质粒DNA的吸附量为96.8％。

实施例5 Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9 T细胞内的递送

人原代CD4⁺T细胞的提取和培养。取新鲜抗凝人血5～10mL，与无血清 RPMI-1640培养基(Gibco)按体积比1:1混匀。在离心管中加入淋巴细胞分离液，使得分离液：新鲜血液：培养基＝1:1:1(体积比)。用滴管将血液稀释液沿管壁缓慢加入液面上，保持界面清晰。1500rpm水平离心20min。此时离心管由上至下分为四层。第一层：血浆层；第二层：乳白色淋巴细胞层；第三层：透明分离液层；第四层：红细胞层。用移液枪轻轻吸取淋巴细胞层，收集到离心管中，加入5倍细胞洗涤液，充分混匀后，1500rpm水平离心20min。弃上清，留细胞沉淀。重复洗涤2次，获得淋巴细胞。使用人源CD4⁺T细胞分离试剂盒(Stem Cell，货号19052)，分离纯化得到CD4⁺T 细胞。培养于含血清的RPMI-1640完全培养基，并在培养基中添加IL-2(300 U/mL),IFN-γ(1000U/mL)和OKT-3(50ng/mL)。

Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9 T细胞内的递送。特异性敲除人PD-1 基因质粒载体的构建方法同实施例1。递送系统的制备方法同实施例2。设置有磁场和无磁场作用组，以不做任何处理的细胞为对照。CD4⁺T细胞以10⁵/ 孔密度接种在24孔板中，5000rpm水平离心5min，去除细胞培养基，加入无血清培养基分散的Fe₃O₄-DNA(DNA终量500ng/孔)。磁场作用组将培养皿置于磁板上，37℃孵育25min，移走磁板。无磁场作用组，加入无血清培养基分散的Fe₃O₄-DNA，37℃孵育25min。孵育结束后，均更换为完全培养基继续培养48h，激光共聚焦显微镜(Lecia TCS SP8)成像(激发波长488nm，发射波长505-570nm)。

结果：如图4所示，共聚焦成像结果显示，磁场作用组，大量T细胞表达GFP标签蛋白(其中虚线白色圆圈所指示的就是表达GFP标签蛋白的细胞)，而无磁场作用组，没有T细胞表达GFP标签蛋白。由此说明我们制备的Fe₃O₄纳米载体只有在磁场作用下，才能高效递送CRISPR/Cas9质粒进入 T细胞。

实施例6 Fe₃O₄纳米颗粒在团簇和单分散情况下介导的CRISPR/Cas9 T 细胞内的递送效果比较

Fe₃O₄纳米单分散颗粒来源同实施例3，团簇来源同实施例2，两者介导的CRISPR/Cas9人T细胞内递送系统的制备方法同实施例2。特异性敲除人 PD-1基因CRISPR-Cas9表达质粒的构建方法同实施例1。人原代CD4⁺T细胞的提取和培养方法同实施例5。

设置Fe₃O₄纳米单分散颗粒和Fe₃O₄纳米团簇递送实验组，以不做任何处理的细胞为对照。细胞处理及激光共聚焦显微成像方法同实施例5。

结果：共聚焦成像结果如图5所示，Fe₃O₄纳米团簇实验组，大量T细胞表达GFP标签蛋白(其中虚线白色圆圈所指示的就是表达GFP标签蛋白的细胞)，而Fe₃O₄纳米单分散颗粒实验组，只有少量T细胞表达GFP标签蛋白。由此说明只有具有团簇结构的Fe₃O₄纳米载体能高效递送CRISPR/Cas9 质粒进入T细胞。

实施例7 不同团簇大小的Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9 T细胞内的递送效果比较

Fe₃O₄纳米大团簇(单颗粒平均直径10nm，团簇平均粒径250～1000nm，西安瑞禧生物科技有限公司)和Fe₃O₄纳米颗粒小团簇(来源同实施例2，团簇粒径50～200nm)介导的CRISPR/Cas9人T细胞内递送系统的制备方法同实施例2。特异性敲除人PD-1基因CRISPR-Cas9表达质粒的构建方法同实施例1。人原代CD4⁺T细胞的提取和培养方法同实施例5。

设置Fe₃O₄纳米颗粒大团簇和小团簇递送实验组，以不做任何处理的细胞为对照。细胞处理及激光共聚焦显微成像方法同实施例5。

结果：如图6A，6B所示，共聚焦成像结果显示，Fe₃O₄纳米颗粒小团簇组，大量T细胞表达GFP标签蛋白，其中虚线白色圆圈中所指示的就是表达GFP标签蛋白的细胞(如图6B)，而Fe₃O₄纳米颗粒大团簇组，没有T细胞表达GFP标签蛋白(如图6A)。说明只有具有较小团簇结构的Fe₃O₄纳米载体能高效递送CRISPR/Cas9质粒进入T细胞，大团簇很可能由于不易被细胞摄取而无法有效递送CRISPR/Cas9质粒进入T细胞。

实施例8 Fe₃O₄纳米颗粒介导的T细胞递送系统在特异性靶向敲除人 CD4⁺T细胞PD-1基因中的应用

特异性敲除人PD-1基因CRISPR-Cas9表达质粒的构建方法同实施例1。 Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9人T细胞内递送系统的制备方法同实施例2。人原代CD4⁺T细胞的提取和培养方法同实施例5。

实验组别设置及细胞处理方法同实施例5。转染后48h，收集全部细胞，用基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa，货号No.9765)提取基因组DNA，使用荧光分光光度计(Nanodrop-3300)对基因组DNA进行定量。按PCR试剂盒(NEB,货号M0494L)设置相关程序，扩增基因组中PD-1的片段(长度为390bp)，PCR引物设计为：上游引物S3：ATGCAGATCCCACAGGCG(SEQ IDNo：4)，下游引物S4：TCAGAGGGGCCAAGAGCA(SEQ ID No：5)。 TaKaRa PCR产物回收试剂盒纯化回收产物，取一定量稀释后退火，退火程序如下：1)95℃保持5min；2)95℃到85℃，以-2℃/s的速率降低温度，共执行5个循环；3)85℃到25℃，以-0.1℃/s的速率降低温度，共执行600 个循环；4)25℃保持1min；5)4℃保存。在10μL体系中加入0.4μL的 T7核酸内切酶1(T7E1，NEB，货号M0302L)，37℃，酶切0.5-1h后，加入1μL10X上样缓冲液，65℃水浴10min，2％琼脂糖凝胶电泳检测。另外，将PCR产物送生工公司测序。

结果：琼脂糖凝胶电泳如图7A显示，磁场作用组T7E1酶切割与原基因组不完全匹配的修复基因组，产生片段较小的条带，根据公式计算突变效率 (Indel)，公式为：

其中fcut＝切开条带灰度之和/全部条带灰度之和，灰度值用Gene Tools软件分析。计算结果显示突变效率为48％。此外，测序结果也显示，PD-1基因位于PAM序列处，有 1到41个碱基的缺失(用灰色条带标记)(如图7B所示)。无磁场作用组，T7E1酶切后无任何小片段条带产生。结合实施例5的实验结果，充分说明该 Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统只有在磁场作用下，才能高效递送CRISPR/Cas9质粒进入T细胞，从而特异地对T细胞的目的基因进行编辑。

实施例9 Fe₃O₄纳米颗粒和Lipo3000介导的T细胞递送系统在特异性靶向敲除人CD4⁺T细胞PD-1基因应用中的比较

特异性敲除人PD-1基因CRISPR-Cas9表达质粒的构建方法同实施例1。 Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9人T细胞内递送系统的制备方法同实施例2。人原代CD4⁺T细胞的提取和培养方法同实施例5。

CD4⁺T细胞以10⁵/孔密度接种在24孔板中，设置以下实验组：Fe₃O₄纳米颗粒组，Lipo3000组(购自赛默飞，货号L3000001)，以不做任何处理的细胞为对照。磁转组细胞处理方法同实施例3。Lipo3000组，每孔加0.75μL 的Lipo3000，500ng靶向敲除PD-1基因的质粒和1μL P3000。转染48h后，收集基因组DNA，T7E1酶切法检测靶向敲除PD-1基因的效率方法同实施例 8。

结果：琼脂糖凝胶电泳如图8所示，Fe₃O₄纳米颗粒作用组T7E1酶切割与原基因组不完全匹配的修复基因组，产生片段较小的条带，切割效率约为 36％，而使用商业化的脂质体转染试剂Lipo3000递送质粒，T7E1酶切基因组后无任何小片段条带产生，说明其无法将质粒有效递送至原代T细胞内实现对目的基因的编辑，而本专利中制备的Fe₃O₄纳米颗粒载体能高效递送 CRISPR/Cas9系统进T细胞并对细胞内目的基因进行有效地编辑。这也验证了正如本发明背景技术部分所提到的那样，使用常规脂质体技术(Lipo组) 很难对T细胞进行进行转染，也就无法进行有效的基因编辑。

实施例10 Fe₃O₄纳米颗粒介导CRISPR/Cas9人T细胞内递送系统的安全性评估

特异性敲除人PD-1基因CRISPR-Cas9表达质粒的构建方法同实施例1。 Fe₃O₄纳米颗粒介导的CRISPR/Cas9人T细胞内递送系统的制备方法同实施例2。人原代CD4⁺T细胞的提取和培养方法同实施例5。

使用MTT比色法测定细胞活力。CD4⁺T细胞以10⁵/孔密度接种在24 孔板中，设置以下实验组，每组三个复孔：磁场组(不加材料，细胞置于磁场处理30min)，材料组(无血清培养基分散的Fe₃O₄-DNA，DNA终量为500 ng)，磁场+材料组，以不做任何处理的细胞为对照。孵育48h后，用MTT (Sigma，货号M5655)染色4h，加入10％酸性SDS溶解生成的甲瓚结晶，于OD570nm处测定每孔的紫外吸收值，细胞存活率以OD(处理组)/OD (对照组)的百分比表示。

结果：细胞存活率实验结果如图9所示，磁场本身、Fe₃O₄-DNA复合物以及两者共同作用对T细胞均不显示任何毒性效应，表明该Fe₃O₄纳米颗粒介导CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统具有良好的安全性。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

序列表

<110> 中国科学院上海应用物理研究所

<120> 一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 人工序列描述：合成引物(Description of Artificial Sequence:Synthetic primer)

<400> 1

caccgcagtt gtgtgacacg gaag 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 人工序列描述：合成引物(Description of Artificial Sequence:Synthetic primer)

<400> 2

aaaccttccg tgtcacacaa ctgc 24

<210> 3

<211> 9291

<212> DNA

<213> 未知(unknown)

<220>

<221> misc_feature

<400> 3

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg cagttgtgtg acacggaagg ttttagagct agaaatagca agttaaaata 300

aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt tgttttagag 360

ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgtttttag cgcgtgcgcc aattctgcag 420

acaaatggct ctagaggtac ccgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 480

gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 540

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 600

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attgtgccca 660

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 720

taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 780

acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 840

gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg 900

gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag 960

gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac 1020

gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac 1080

tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt 1140

agctgagcaa gaggtaaggg tttaagggat ggttggttgg tggggtatta atgtttaatt 1200

acctggagca cctgcctgaa atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggacta 1260

taaggaccac gacggagact acaaggatca tgatattgat tacaaagacg atgacgataa 1320

gatggcccca aagaagaagc ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccgacaagaa 1380

gtacagcatc ggcctggaca tcggcaccaa ctctgtgggc tgggccgtga tcaccgacga 1440

gtacaaggtg cccagcaaga aattcaaggt gctgggcaac accgaccggc acagcatcaa 1500

gaagaacctg atcggagccc tgctgttcga cagcggcgaa acagccgagg ccacccggct 1560

gaagagaacc gccagaagaa gatacaccag acggaagaac cggatctgct atctgcaaga 1620

gatcttcagc aacgagatgg ccaaggtgga cgacagcttc ttccacagac tggaagagtc 1680

cttcctggtg gaagaggata agaagcacga gcggcacccc atcttcggca acatcgtgga 1740

cgaggtggcc taccacgaga agtaccccac catctaccac ctgagaaaga aactggtgga 1800

cagcaccgac aaggccgacc tgcggctgat ctatctggcc ctggcccaca tgatcaagtt 1860

ccggggccac ttcctgatcg agggcgacct gaaccccgac aacagcgacg tggacaagct 1920

gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca gctgttcgag gaaaacccca tcaacgccag 1980

cggcgtggac gccaaggcca tcctgtctgc cagactgagc aagagcagac ggctggaaaa 2040

tctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa gaatggcctg ttcggaaacc tgattgccct 2100

gagcctgggc ctgaccccca acttcaagag caacttcgac ctggccgagg atgccaaact 2160

gcagctgagc aaggacacct acgacgacga cctggacaac ctgctggccc agatcggcga 2220

ccagtacgcc gacctgtttc tggccgccaa gaacctgtcc gacgccatcc tgctgagcga 2280

catcctgaga gtgaacaccg agatcaccaa ggcccccctg agcgcctcta tgatcaagag 2340

atacgacgag caccaccagg acctgaccct gctgaaagct ctcgtgcggc agcagctgcc 2400

tgagaagtac aaagagattt tcttcgacca gagcaagaac ggctacgccg gctacattga 2460

cggcggagcc agccaggaag agttctacaa gttcatcaag cccatcctgg aaaagatgga 2520

cggcaccgag gaactgctcg tgaagctgaa cagagaggac ctgctgcgga agcagcggac 2580

cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat ccacctggga gagctgcacg ccattctgcg 2640

gcggcaggaa gatttttacc cattcctgaa ggacaaccgg gaaaagatcg agaagatcct 2700

gaccttccgc atcccctact acgtgggccc tctggccagg ggaaacagca gattcgcctg 2760

gatgaccaga aagagcgagg aaaccatcac cccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa 2820

gggcgcttcc gcccagagct tcatcgagcg gatgaccaac ttcgataaga acctgcccaa 2880

cgagaaggtg ctgcccaagc acagcctgct gtacgagtac ttcaccgtgt ataacgagct 2940

gaccaaagtg aaatacgtga ccgagggaat gagaaagccc gccttcctga gcggcgagca 3000

gaaaaaggcc atcgtggacc tgctgttcaa gaccaaccgg aaagtgaccg tgaagcagct 3060

gaaagaggac tacttcaaga aaatcgagtg cttcgactcc gtggaaatct ccggcgtgga 3120

agatcggttc aacgcctccc tgggcacata ccacgatctg ctgaaaatta tcaaggacaa 3180

ggacttcctg gacaatgagg aaaacgagga cattctggaa gatatcgtgc tgaccctgac 3240

actgtttgag gacagagaga tgatcgagga acggctgaaa acctatgccc acctgttcga 3300

cgacaaagtg atgaagcagc tgaagcggcg gagatacacc ggctggggca ggctgagccg 3360

gaagctgatc aacggcatcc gggacaagca gtccggcaag acaatcctgg atttcctgaa 3420

gtccgacggc ttcgccaaca gaaacttcat gcagctgatc cacgacgaca gcctgacctt 3480

taaagaggac atccagaaag cccaggtgtc cggccagggc gatagcctgc acgagcacat 3540

tgccaatctg gccggcagcc ccgccattaa gaagggcatc ctgcagacag tgaaggtggt 3600

ggacgagctc gtgaaagtga tgggccggca caagcccgag aacatcgtga tcgaaatggc 3660

cagagagaac cagaccaccc agaagggaca gaagaacagc cgcgagagaa tgaagcggat 3720

cgaagagggc atcaaagagc tgggcagcca gatcctgaaa gaacaccccg tggaaaacac 3780

ccagctgcag aacgagaagc tgtacctgta ctacctgcag aatgggcggg atatgtacgt 3840

ggaccaggaa ctggacatca accggctgtc cgactacgat gtggaccata tcgtgcctca 3900

gagctttctg aaggacgact ccatcgacaa caaggtgctg accagaagcg acaagaaccg 3960

gggcaagagc gacaacgtgc cctccgaaga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg 4020

gcagctgctg aacgccaagc tgattaccca gagaaagttc gacaatctga ccaaggccga 4080

gagaggcggc ctgagcgaac tggataaggc cggcttcatc aagagacagc tggtggaaac 4140

ccggcagatc acaaagcacg tggcacagat cctggactcc cggatgaaca ctaagtacga 4200

cgagaatgac aagctgatcc gggaagtgaa agtgatcacc ctgaagtcca agctggtgtc 4260

cgatttccgg aaggatttcc agttttacaa agtgcgcgag atcaacaact accaccacgc 4320

ccacgacgcc tacctgaacg ccgtcgtggg aaccgccctg atcaaaaagt accctaagct 4380

ggaaagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcggaaga tgatcgccaa 4440

gagcgagcag gaaatcggca aggctaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa 4500

ctttttcaag accgagatta ccctggccaa cggcgagatc cggaagcggc ctctgatcga 4560

gacaaacggc gaaaccgggg agatcgtgtg ggataagggc cgggattttg ccaccgtgcg 4620

gaaagtgctg agcatgcccc aagtgaatat cgtgaaaaag accgaggtgc agacaggcgg 4680

cttcagcaaa gagtctatcc tgcccaagag gaacagcgat aagctgatcg ccagaaagaa 4740

ggactgggac cctaagaagt acggcggctt cgacagcccc accgtggcct attctgtgct 4800

ggtggtggcc aaagtggaaa agggcaagtc caagaaactg aagagtgtga aagagctgct 4860

ggggatcacc atcatggaaa gaagcagctt cgagaagaat cccatcgact ttctggaagc 4920

caagggctac aaagaagtga aaaaggacct gatcatcaag ctgcctaagt actccctgtt 4980

cgagctggaa aacggccgga agagaatgct ggcctctgcc ggcgaactgc agaagggaaa 5040

cgaactggcc ctgccctcca aatatgtgaa cttcctgtac ctggccagcc actatgagaa 5100

gctgaagggc tcccccgagg ataatgagca gaaacagctg tttgtggaac agcacaagca 5160

ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgagttctcc aagagagtga tcctggccga 5220

cgctaatctg gacaaagtgc tgtccgccta caacaagcac cgggataagc ccatcagaga 5280

gcaggccgag aatatcatcc acctgtttac cctgaccaat ctgggagccc ctgccgcctt 5340

caagtacttt gacaccacca tcgaccggaa gaggtacacc agcaccaaag aggtgctgga 5400

cgccaccctg atccaccaga gcatcaccgg cctgtacgag acacggatcg acctgtctca 5460

gctgggaggc gacaaaaggc cggcggccac gaaaaaggcc ggccaggcaa aaaagaaaaa 5520

ggaattcggc agtggagagg gcagaggaag tctgctaaca tgcggtgacg tcgaggagaa 5580

tcctggccca gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 5640

gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 5700

cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 5760

gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 5820

catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 5880

catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 5940

caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 6000

ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca 6060

gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 6120

gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 6180

caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 6240

catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 6300

caaggaattc taactagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 6360

tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 6420

ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 6480

gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagagaatag caggcatgct 6540

ggggagcggc cgcaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc 6600

tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc 6660

tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg caggggcgcc tgatgcggta ttttctcctt 6720

acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta 6780

gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 6840

gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 6900

ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 6960

acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 7020

agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 7080

aaactggaac aacactcaac cctatctcgg gctattcttt tgatttataa gggattttgc 7140

cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 7200

acaaaatatt aacgtttaca attttatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg 7260

catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 7320

tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 7380

ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 7440

tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa 7500

atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 7560

tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 7620

aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 7680

acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 7740

acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 7800

ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 7860

ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 7920

caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 7980

ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 8040

aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 8100

aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 8160

tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 8220

aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 8280

cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtggaagc cgcggtatca 8340

ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 8400

gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 8460

agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 8520

atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 8580

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 8640

cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 8700

cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 8760

tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 8820

tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 8880

ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 8940

aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 9000

cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 9060

ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 9120

agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 9180

ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 9240

acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg t 9291

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 人工序列描述：合成引物(Description of Artificial Sequence:Synthetic primer)

<400> 4

atgcagatcc cacaggcg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<223> 人工序列描述：合成引物(Description of Artificial Sequence:Synthetic primer)

<400> 5

tcagaggggc caagagca 18

Claims (6)

1.一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）采用阳离子聚合物对一定大小的磁性纳米颗粒团簇进行修饰获得一种纳米载体，所述磁性纳米颗粒团簇的粒径为50~200 nm，所述磁性纳米颗粒选自：Fe₃O₄纳米颗粒，γ-Fe₂O₃纳米颗粒或CoFe₂O₄纳米颗粒；

2）提供靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒，所述的靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统包括表达Cas9蛋白和/或sgRNA的质粒，其中，表达Cas9蛋白的质粒有pMJ920和pCAG-T3-hCAS-pA，表达sgRNA的质粒有SP6-sgRNA-scaffold，Cas9蛋白和sgRNA共表达质粒有pX330、pX458或pX459；

3）将步骤1）所得纳米载体与所述靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒共孵育获得一种纳米复合物；以及

4）在磁场作用下，将步骤3）所得纳米复合物与T细胞共孵育，制得一种磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统，其中，所述的T细胞包括：CD4⁺T 细胞、CD8⁺T细胞、NKT细胞的原代T细胞，或Jurkat T细胞株。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中的磁场包括均匀磁场和非均匀磁场。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述的阳离子聚合物选自：聚丙烯氯化铵、L-多聚赖氨酸、D-多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、阳离子聚丙烯酰胺、聚乙二醇或壳聚糖中的一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纳米载体与所述靶向目标基因的CRISPR/Cas9系统表达质粒孵育的质量比例为：10:1~30:1，孵育的时间为：10~30 min，孵育的温度为25~37°C。

5.一种根据权利要求1-4中任意一项所述的制备方法制得的磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统。

6.一种根据权利要求5所述的磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统在非治疗目的的T细胞目的基因编辑中的应用。

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