CN115212321B - 一种可降解纳米颗粒及其介导的Cas9/sgRNA递送系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒，所述高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键后，与不带电单体和阳离子单体在自由基引发剂存在下原位聚合形成。所述纳米颗粒由于胞质中阴离子分子的结合竞争和聚合物壳中阳离子基团的水解，能够在细胞内化后触发Cas9/sgRNA从自组装复合物中释放，从而实现高达40%的基因编辑效率。本发明还提供了上述纳米颗粒的制备方法，装载有药物分子的所述纳米颗粒以及其在制备基因治疗药物中的应用。

Description

一种可降解纳米颗粒及其介导的Cas9/sgRNA递送系统
技术领域
本发明公开了一种可降解纳米颗粒及其介导的Cas9/sgRNA递送系统，属于纳米材料领域。
背景技术
Cas9蛋白和sgRNA是近年来出现的颠覆性生物技术——CRISPR（规律成簇间隔的短回文重复）/Cas9基因编辑中最关键的两个生物大分子，Cas9和sgRNA组成的复合物能够对基因进行手术刀般精确切割。与递呈需要在胞内表达Cas9和sgRNA的重组病毒或质粒相比，直接递呈Cas9/sgRNA复合物，可以实现对基因编辑系统的胞内含量和作用时间的定量调控，减少外源DNA整合突变以及基因持续表达导致脱靶的风险，增强了基因编辑的特异性和安全性。然而，与其它蛋白类生物大分子类似，Cas9/sgRNA胞内稳定性差、递送效率低使得将其递送至细胞核发挥功能成为一项巨大挑战。目前已有的递送载体通常存在编辑效率低下或合成路线复杂等问题。此外，对于原代T细胞这类尺寸很小的悬浮细胞，使用现有的递送载体很难进行转染，而电转过程会对细胞膜造成不可逆的损伤而产生较大的细胞毒性。因此，开发一个能解决上述限制的递送系统对于促进CRISPR基因编辑系统向临床上应用和发展意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种新型的可降解纳米颗粒作为Cas9/sgRNA的递送载体，在细胞内化后能够有效地从其纳米自组装体中释放Cas9/sgRNA，从而实现较高的基因编辑效率。
基于上述目的，本发明首先提供了一种由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒，所述高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键后，与不带电单体和阳离子单体在自由基引发剂存在下原位聚合形成。
在一个优选的技术方案中，所述阳离子单体为2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯，所述不带电单体为丙烯酰胺，所述自由基引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺，所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰为丙烯酰化修饰。
在一个更为优选的技术方案中，使用N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰。
更为优选地，所述蛋白质为具有两个以上赖氨酸残基的任意多肽。
在本发明一个具体的实施方案中，所述蛋白质为牛血清白蛋白。如本领域技术人员所周知的，只要修饰不干扰纳米颗粒的合成，化学修饰（如荧光分子标记）的多肽也被包括在本发明的实施方案之中。
再为优选地，所述纳米颗粒的红外光谱图具有以下波段的特征吸收峰：3317cm-1、2950cm-1、2820cm-1、2780cm-1、1730cm-1、1680cm-1、1540cm-1、1460cm-1、1395cm-1和1148cm-1。
尤为优选地，所述牛血清白蛋白：丙烯酰胺：2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯：过硫酸铵：四甲基乙二胺的摩尔比为1：3000：3000：250：1000。
其次，本发明提供了上述纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）对作为纳米颗粒内核的蛋白质进行改性，使所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键；
（2）由不带电单体和阳离子单体在自由基引发剂存在下和蛋白质表面双键发生原位聚合，生长出包裹着蛋白质内核的高分子外层。
在一个优选的技术方案中，步骤（1）所述蛋白质为具有两个以上赖氨酸残基的任意多肽，所述修饰为使用N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行的丙烯酰化修饰。
在另一个优选的技术方案中，步骤（2）所述不带电单体为丙烯酰胺，所述阳离子单体为2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯，所述自由基引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺。
第三，本发明提供了一种装载有药物分子的上述纳米颗粒。
在一个优选的技术方案中，所述药物分子为Cas9/sgRNA。
在一个更为优选的技术方案中，所述纳米颗粒：Cas9：sgRNA的摩尔比为1:1:1。
第四，本发明提供了上述装载有Cas9/sgRNA的纳米颗粒的制备方法，所述方法包括：
（1）将所述Cas9蛋白与所述sgRNA混合形成Cas9/sgRNA复合物的步骤；
（2）将所述纳米颗粒与所述Cas9/sgRNA复合物混合形成自组装复合物的步骤。
最后，本发明提供了上述装载有Cas9/sgRNA的纳米颗粒在制备基因治疗药物中的应用。
同现有的Cas9/sgRNA递送载体相比较，本发明所述的可降解纳米颗粒具有以下突出优势：
（1）本发明利用蛋白质原位聚合高分子，材料制备方法简单、绿色、成本低。以蛋白为内核的设计思路使得材料的生物相容性好，细胞毒性低。
（2）本发明所述的纳米颗粒只需要通过简单的混合就可以很好的负载Cas9/sgRNA复合物，在不需要任何其他转染试剂的情况下，能高效地将Cas9/sgRNA递送至细胞内。
（3）所述纳米颗粒的高分子外壳的阳离子单体设计为具有叔胺基和酯键的2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯，叔胺基结构产生质子海绵效应有助于内体逃逸，连接叔胺基的酯键在生理温度下发生水解反应使阳离子基团降解，促进了Cas9/sgRNA从自组装复合物上的释放。同时，胞质中的组分如带负电蛋白和氨基酸对纳米颗粒上与Cas9/sgRNA的结合位点产生竞争，进一步加速了细胞内Cas9/sgRNA从自组装复合物上的解离。本发明所述的纳米颗粒可实现高水平的Cas9/sgRNA释放，显著提高基因编辑效率。
（4）在实际应用中，所述纳米颗粒介导的Cas9/sgRNA复合物对细胞内目的基因的编辑效率可达到40%。同时，直接递呈Cas9/sgRNA复合物的方法有利于实现对其胞内含量和作用时间的定量调控，降低脱靶效应。
（5）除了电转，现有的Cas9/sgRNA递送系统都不能用于原代T细胞等难转染的细胞类型。基于可降解纳米颗粒的Cas9/sgRNA递送系统为原代T细胞提供了一种新的基因敲除方法，为下一代免疫治疗如通用型CAR T细胞的制备奠定了基础。
附图说明
图1为纳米颗粒及其Cas9/sgRNA递送系统的制备示意图。
图2为纳米颗粒的形貌尺寸图。（a）透射电子显微镜图；（b）原子力显微镜图。
图3为纳米颗粒与内核蛋白的结构性质对比。（a）动态光散射图；（b）Zeta电势图；（c）傅立叶红外光谱图；（d）离子色谱图。
图4为纳米颗粒和Cas9/sgRNA不同摩尔比下的自组装复合物转染至HEK293T细胞的摄取效率和基因编辑效率。摄取效率用12h后细胞摄取Cas9-AF647的平均荧光强度表示，基因编辑效率用4天后EGFP阴性细胞百分比表示，其中，Cas9-AF647为AF64标记的Cas9。
图5为纳米颗粒/Cas9/sgRNA转染HEK293T细胞的（a）流式结果、（b）荧光显微镜观察结果以及（c）细胞基因组靶向位点附近DNA片段的测序及单克隆测序分析结果。
图6为纳米颗粒/Cas9/sgRNA转染A549细胞的（a）流式结果、（b）荧光显微镜观察结果以及（c）细胞基因组靶向位点附近DNA片段的测序及单克隆测序分析结果。
图7为Cas9/sgRNA及其与纳米颗粒的自组装复合物的透射电子显微镜形貌图。（a）Cas9/sgRNA；（b）纳米颗粒/Cas9/sgRNA；（c）纳米颗粒-37/Cas9/sgRNA，其中，纳米颗粒-37为在37°C放置10天后的纳米颗粒。
图8（a）为纳米颗粒在37°C放置10天前后的Zeta电势变化图；（b）为不同介质中NP-FITC/Cas9-RBITC/sgRNA的荧光光谱图。其中，蛋白介质浓度为0.4mg/ml；NP-FITC表示FITC标记的纳米颗粒；RNP-RBITC表示RBITC标记的Cas9与sgRNA形成的复合物。
图9为纳米颗粒/Cas9/sgRNA在不同条件下的体外CRISPR酶切反应。
图10为用纳米颗粒/Cas9-AF647/sgRNA转染未激活T细胞6h后流式细胞仪测得的细胞Cas9-AF647内化效率。
图11为不同激活条件下T细胞的细胞内化和基因组编辑效率。（a）纳米颗粒/Cas9-AF647/sgRNA转染激活T细胞6h后流式细胞仪测得的细胞Cas9-AF647内化效率；（b）转染纳米颗粒/Cas9/CD7-sgRNA后继续培养7天，用流式细胞仪测得的CD7的APC表达。
图12为靶向（a）CD7和（b）PD1基因的T细胞的单克隆Sanger测序结果。PAM为原间隔序列临近基序。
图13为纳米颗粒/Cas9/CD7-sgRNA转染T细胞后的深度测序分析。（a）各位点插入碱基的频率，以每个位点的插入Reads数/总Reads数表示；（b）特定长度的插入Reads数占总插入Reads数的百分比；（c）各位点缺失碱基的频率，以每个位点的缺失Reads数/总Reads数表示；（d） 特定长度的缺失Reads数占总缺失Reads数的百分比。
图14为纳米颗粒/Cas9/CD7-sgRNA转染T细胞后主要缺失或插入的序列及频率。
图15为纳米颗粒/Cas9/PD1-sgRNA转染T细胞后的深度测序分析。（a）各位点插入碱基的频率，以每个位点的插入Reads数/总Reads数表示；（b）特定长度的插入Reads数占总插入Reads数的百分比；（c）各位点缺失碱基的频率，以每个位点的缺失Reads数/总Reads数表示；（d） 特定长度的缺失Reads数占总缺失Reads数的百分比。
图16为纳米颗粒/Cas9/PD1-sgRNA转染T细胞后主要缺失或插入的序列及频率。
图17为纳米颗粒递送系统对T细胞的活度影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
实施例1：可降解纳米颗粒的制备方法
1）将牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich #SRE0096）溶于pH 8.5，100mM硼酸盐缓冲液中，并通过30kD的超滤管（Amicon #UFC5030BK）在此缓冲液离心换液四次后，二喹啉甲酸（BCA）法测浓度并用此缓冲液稀释蛋白至10mg/ml，得到反应蛋白原液。
2）将N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯（Sigma-Aldrich #A8060）溶于二甲亚砜（Sigma-Aldrich #276855）配成20mg/ml的溶液，取5.1μl与100μl反应蛋白原液混合均匀（其中N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯：牛血清白蛋白 = 40：1摩尔比），室温25°C反应6h，得到表面双键修饰的蛋白溶液A。
3）将丙烯酰胺（Sigma-Aldrich #A8887）溶于去离子水配成200mg/ml的溶液B；过硫酸铵（Sigma-Aldrich #A3678）溶于去离子水现配成100mg/ml的溶液C；2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯（Sigma-Aldrich #234907）和四甲基乙二胺（Sigma-Aldrich #T9281）均为液体试剂，可直接用于反应。
4）在所述的溶液A体系中加入300μl pH 7.4，100mM磷酸缓冲液后，再加入16μl溶液B、7.6μl 2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯、8.6μl 溶液C、2.1μl 四甲基乙二胺混合均匀（其中，牛血清白蛋白：丙烯酰胺：2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯：过硫酸铵：四甲基乙二胺= 1：3000：3000：250：1000摩尔比），室温25°C反应4h。
5）反应的示意图参见图1的前两步。聚合反应后，体系中一般残留有非目标反应产物组份，因此需要进行纯化。将产物溶液用pH 7.4，10mM磷酸盐缓冲液（PBS）在30kD的超滤管中离心换液4次得到300μl纳米颗粒溶液。BCA法测浓度为3.28mg/ml，并用PBS将其稀释为1.5mg/ml。
实施例2：可降解纳米颗粒的材料学表征
将纳米颗粒用透射电子显微镜（HT7700，Hitachi）和原子力显微镜（DimensionIcon，Bruker）进行观察（图2），可知颗粒为圆球形，粒径分布在几纳米到20纳米之间。动态光散射（Zetasizer Nano，Malvern）测得纳米颗粒的平均粒径为10nm，远大于其合成原料牛血清白蛋白的5.5nm粒径值（图3之a）。纳米颗粒的平均Zeta电势为9.7mV（图3之b），与Zeta电势为-20.8mV的牛血清白蛋白对比可知，阳离子高分子表面改性的设计使其电性发生改变。图3之c进一步表明纳米颗粒是由2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯和丙烯酰胺的共聚高分子与蛋白偶联构成，因为可以在纳米颗粒的红外光谱图观察到2950cm-1（–CH3和–CH2的C–H伸缩振动峰），2820cm-1和2780cm-1（–N(CH3)2的C–H伸缩振动峰），1730cm-1（酯键中的C=O伸缩振动峰）, 1460cm-1（–CH2–弯曲振动峰），1395cm-1（CH3弯曲振动峰) , 1148cm-1（C–N和C–O伸缩振动峰)，这些都是2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯单元的特征吸收峰。此外，1680cm-1是酰胺键中的C=O伸缩振动峰的特征吸收峰，这属于丙烯酰胺单元和牛血清白蛋白与N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯的连接键。3317cm-1处的宽峰和1540cm-1处的小峰分别属于丙烯酰胺单元中伯胺基的N–H伸缩振动和弯曲振动峰。图3之d为使用Dionex ICS-5000+离子色谱系统和TOSOH TSKgel CM-STAT色谱柱在280nm处检测的洗脱色谱曲线（平衡液为pH 4.5，10mM的醋酸钠溶液，洗脱液为添加0.5M NaCl的pH 4.5，10mM的醋酸钠溶液）。结果进一步表明，阳离子聚合物在内核蛋白表面的原位生长给材料带来了正电属性。此外，纳米颗粒的洗脱曲线中没有明显的分离峰，这也证实了纳米颗粒材料的相对均匀性。
实施例3：纳米颗粒递送Cas9/sgRNA的实验优化和基因编辑结果
本实施例中，Cas9蛋白由Escherichia coli BL21(DE3)表达纯化，pET-NLS-Cas9-6xHis质粒的货号为Addgene #62934。EGFP-sgRNA由DNA模板进行体外转录和纯化，其DNA模板序列为：GTTTTTTTTAATACGACTCACTATAgggcgaggagctgttcaccgGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT。作为对照的不靶向任何基因的cgRNA也由DNA模板进行体外转录和纯化，其DNA模板序列为：GTTTTTTTTAATACGACTCACTATAgggtaaccgtgcggtcgtacGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT。所用细胞为实验室构建的表达单拷贝EGFP- PEST基因的HEK293T和A549细胞系。
上述实施例1制备得到的纳米颗粒可用于制备Cas9/sgRNA递送系统。过程如下：
1）将Cas9蛋白和sgRNA混合，室温静置20 min，即获得Cas9/sgRNA复合物。
2）将纳米颗粒与Cas9/sgRNA复合物溶液混合, 室温静置20min，即获得纳米颗粒和Cas9/sgRNA的自组装复合物。
3）将上述自组装复合物与细胞共孵育，制得一种基于纳米颗粒的Cas9/sgRNA细胞递送系统。
4）评价基于上述纳米颗粒的Cas9/sgRNA递送系统所产生的细胞基因编辑效果。
以下为更具体的实验步骤：
将1.18μl Cas9蛋白（1354μg/ml）和1.59μl靶向EGFP基因的EGFP-sgRNA（200μg/ml）在室温25°C下混合（摩尔比1:1），静置20 min，即获得Cas9/sgRNA复合物。将2.2μl、4.4μl、8.8μl、13.2μl纳米颗粒（150μg/ml）分别与上述条件制备的Cas9/sgRNA复合物在室温25°C混合, 静置20 min，获得纳米颗粒和Cas9/sgRNA不同摩尔比下的自组装复合物（摩尔比分别为1:2、1:1、2:1、3:1）。将纳米颗粒/Cas9/sgRNA复合物加至无血清的DMEM培养基中使其最终体积为100μl，其中Cas9/sgRNA的量100nM。再加至96孔板中长至指数生长期的HEK293T细胞中，转染12h后将培养基换成含10%血清的DMEM培养基，继续培养4天后，用流式细胞仪（Guava easyCyte HT，Merck Millipore）分析细胞EGFP荧光表达情况，EGFP阴性细胞为受到基因编辑导致EGFP不表达的细胞。实验对照为将sgRNA替换为不靶向任何基因的cgRNA（200μg/ml），sgRNA和cgRNA最终产生的EGFP阴性细胞占比的差值表示为基因编辑效率。
同时，在Cas9蛋白（100kD超滤管换液至pH 8.5，100mM硼酸盐缓冲液）与AF647荧光染料（Molecular Probes #A20006）以1:10的摩尔比在黑暗中孵育1h后，将混合物用PBS在100kD的超滤管中离心换液4次以除去游离的AF647，得到荧光染料标记的Cas9-AF647。以同样的过程获得摩尔比为1:2-3:1的纳米颗粒与Cas9-AF647/sgRNA的自组装复合物，并以同样的条件与HEK293T细胞孵育12h，然后用流式细胞仪分析细胞AF647荧光情况，以评价细胞对Cas9/sgRNA的摄取效率。
以上实验结果如图4所示，纳米颗粒比例的增加总体上增强了Cas9/sgRNA的内化效率。然而，内化效率与基因编辑效率并不完全对应。这说明纳米颗粒和Cas9/sgRNA之间的部分互补性对于有效的递呈和CRISPR功能的实现非常重要，这可能是由于Cas9/sgRNA的负载和释放需要达到平衡。纳米颗粒和Cas9/sgRNA的摩尔比为1:1时，基因编辑效果最优。用最优条件分别转染HEK293T和A549细胞，4天后的细胞用流式细胞仪和荧光显微镜表征其胞内EGFP荧光表达情况。流式图表明基因编辑效率分别达到28%（图5之a，靶向和非靶向的纳米颗粒递送系统产生的EGFP阴性细胞占比分别为34.4%与6.04%）和40%（图6之a，靶向和非靶向的纳米颗粒递送系统产生的EGFP阴性细胞占比分别为44.5%与4.45%）。从图5之b和图6之b也可以清楚地看到纳米颗粒/Cas9/sgRNA靶向系统产生了一定数量无EGFP表达的细胞，而纳米颗粒/Cas9/cgRNA非靶向系统递送后对细胞的荧光表达基本没有影响。这样的差距进一步证实了纳米颗粒作为递呈载体能够实现Cas9/sgRNA的基因敲除功能。提取细胞的基因组DNA，PCR扩增编辑位点附近的DNA片段，PCR产物纯化并连接到pCloneEZ TOPO克隆载体（CloneSmarter #C5865）后，转入Escherichia coli DH5a中。对PCR产物的直接Sanger测序和对50个以上克隆的Sanger测序结果如图5之c和图6之c所示，PCR产物的套峰说明含有不同的序列的片段，即靶向区域产生了基因编辑；单克隆测序结果则展示了插入或缺失或单核苷酸变异的基因编辑详情。
实施例4：基于纳米颗粒的Cas9/sgRNA的胞内递送机制研究
1. 纳米颗粒自身稳定性
选择37℃ 10天作为评价纳米颗粒材料自身稳定性的实验条件，将在37度放置10天的纳米颗粒命名为纳米颗粒-37。
通过透射电子显微镜观察可知，Cas9/sgRNA复合物的尺寸与纳米颗粒接近（图7之a），纳米颗粒/Cas9/sgRNA为规则的球形大聚集体（图7之b）。而纳米颗粒-37/Cas9/sgRNA呈现出解离的疏松结构（图7之c），这表明胞内37°C环境可以加速Cas9/sgRNA从聚集体中解离释放。
由电势仪（Zetasizer Nano，Malvern）测量可知，纳米颗粒在37°C下Zeta电势显著下降，从～8.4mV降至～1.9mV（图8之a）。由此可知纳米颗粒自身结构的不稳定性是其在胞内能够释放Cas9/sgRNA的重要因素。
2. 来自其他分子的竞争性结合
用FITC荧光标记试剂（Sigma-Aldrich #F3651）和RBITC（Aladdin #R105502）分别标记纳米颗粒和Cas9蛋白：纳米颗粒（NP）与FITC以1:4的摩尔比在黑暗中孵育1h后，将混合物用PBS在30kD的超滤管中离心换液4次以除去游离的FITC，得到FITC标记的纳米颗粒（NP-FITC）。Cas9蛋白与RBITC以1:5的摩尔比在黑暗中孵育1h后，将混合物用PBS在100kD的超滤管中离心换液4次以除去游离的RBITC，得到RBITC标记的Cas9（Cas9-RBITC）。再与sgRNA混合并静置20min得到RBITC标记的Cas9/sgRNA（RNP-RBITC）。
通过上述荧光分子对，利用荧光共振能量转移来评价纳米颗粒与Cas9/sgRNA的自组装形成和解离释放（图8之b）。荧光光谱由多功能酶标仪（SpectraMax Paradigm,Molecular Devices）记录，激发波长和发射波长分别为470nm和505–750nm。自组装形成时，RNP-RBITC会使NP-FITC荧光部分猝灭，使荧光光谱呈现出双峰的形式。在自组装复合物溶液中加入牛血清白蛋白或含胎牛血清的DMEM可触发Cas9/sgRNA的释放，这表现为荧光光谱中580nm处峰强度减弱。这暗示着丰富的胞质蛋白可以触发Cas9/sgRNA的解离，这可能是由于负电蛋白与Cas9/sgRNA存在与纳米颗粒的结合竞争所致。
3. 体外酶切实验模拟胞内Cas9/sgRNA释放机制
本实施例中，pcDNA3.1-EGFP质粒是通过将EGFP序列（GenBank：DQ389577.1）克隆到质粒pcDNA3.1 (+)（Invitrogen #V79020）的多克隆位点而构建的。由于pcDNA3.1-EGFP含EGFP-sgRNA靶向的序列，可用于Cas9/sgRNA介导的体外DNA酶切实验以模拟胞内RNP释放的条件。体外DNA酶切实验前，先将pcDNA3.1-EGFP用PvuI-HF（NEB #R3150S）酶切使质粒线性化，使Cas9/sgRNA进一步酶切产生的双条带易于检测。
将纳米颗粒/Cas9/sgRNA（摩尔比1:1:1，终浓度50nM）加入250ng线性化的pcDNA3.1-EGFP中，加入无酶水或培养基至20μL最终体积，随后在37℃孵育1 h。加入蛋白酶K（Sigma-Aldrich #P6556）孵育30min以终止反应，用1%琼脂糖凝胶电泳分析DNA的CRISPR酶切情况。图9中，泳道M为DL15000 DNA分子标志物，泳道1为纳米颗粒/Cas9/sgRNA的体外酶切反应，泳道2为纳米颗粒-37/Cas9/sgRNA的体外酶切反应，泳道3为纳米颗粒/Cas9/sgRNA在DMEM中的体外酶切反应，泳道4为纳米颗粒-37/Cas9/sgRNA在DMEM中的体外酶切反应，泳道5为纳米颗粒-37/Cas9/sgRNA在完全培养基中的体外酶切反应。结果表明，纳米颗粒/Cas9/sgRNA不能直接发挥CRISPR酶切活性，这是由于载体和负载物过分紧密地结合；纳米颗粒-37/Cas9/sgRNA展现了Cas9/sgRNA的部分活性，进一步证实在37℃环境对纳米颗粒结构的影响使得负载物与载体的结合减弱。在DMEM（含有负电氨基酸等阴离子分子）存在下，纳米颗粒/Cas9/sgRNA也展示了部分基因编辑活性。当胎牛血清被添加到DMEM中时（富含氨基酸、蛋白质等阴离子分子，作为胞质的粗略模拟），纳米颗粒-37/Cas9/sgRNA保持了Cas9/sgRNA的完全酶切功能，这是由于负电蛋白等阴离子分子也能跟纳米颗粒结合，与Cas9/sgRNA产生了竞争。以上结果模拟了37℃胞质环境触发负载物从载体上解离和释放，从而使靶DNA发生断裂的原理。
实施例5：纳米颗粒递送Cas9/sgRNA至原代T细胞
嵌合抗原受体T细胞（CAR T）是目前治疗恶性肿瘤最有效的方式之一。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的免疫细胞来清除癌细胞。由于T细胞的一些内源基因会影响CAR T免疫效果，基因编辑技术联合CAR T在肿瘤免疫治疗中具有广泛的应用前景。使用基因编辑过的T细胞作为CAR T细胞来源，有潜力加强CAR T治疗癌症和感染性疾病的疗效。
将CAR T推广到T细胞恶性肿瘤的治疗上是有问题的，因为大多数靶抗原在正常细胞和恶性细胞之间共享，导致CAR T细胞自相残杀。CD7是一种在急性T淋巴细胞白血病和外周T细胞淋巴瘤中高度表达的跨膜蛋白，因此CD7是T细胞恶性肿瘤的一个有吸引力的治疗靶点。由于制备CAR T的T细胞自身也会表达CD7，CD7特异性CAR（CD7-CAR）的表达会导致T细胞自相残杀从而阻碍CAR T细胞的扩增。而CD7基因的敲除可以阻止这种自相残杀，利用这种T细胞可以制备靶向治疗T细胞肿瘤的CAR T。因此，靶向CD7的基因编辑系统有明确的临床意义。
另外，由于肿瘤细胞表面通常会高表达PD-L1（程序性死亡配体1），T细胞上的免疫检查点分子PD-1（程序性死亡受体1）和肿瘤细胞上高表达的PD-L1结合，会启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。T细胞上PD1基因的敲除能够减弱免疫抑制信号，从而增强CAR T对肿瘤细胞的杀伤。
Cas9/sgRNA在T细胞上的现有递送技术只有电转方法的报道，本实施例尝试使用本发明的可降解纳米颗粒实现对T细胞CD7 和PD1的基因编辑。
本实施例中，CD7-sgRNA和PD1-sgRNA均由DNA模板进行体外转录和纯化，二者的DNA模板序列分别为：GTTTTTTTTAATACGACTCACTATAggagcaggtgatgttgacggGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT和GTTTTTTTTAATACGACTCACTATAggccaggatggttcttaggtGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT。其中小写字母代表sgRNA靶向T细胞基因组的20bp序列。T细胞在X-VIVO 15培养基（LONZA #04-418Q）中培养，所述X-VIVO 15中另外添加了100U/ml重组人白细胞介素2（PeproTech，#200-02-100）和5%胎牛血清。
将5.9μl Cas9蛋白（1354μg/ml）和15.9μl靶向CD7基因的CD7-sgRNA（200μg/ml）在室温25°C下混合（摩尔比1:2），静置20min，即获得Cas9/sgRNA复合物。将33μl纳米颗粒（150μg/ml）与上述条件制备的Cas9/sgRNA复合物在室温25°C混合, 静置20min，获得纳米颗粒/Cas9/sgRNA的自组装复合物（摩尔比分别为1.5:1:2，这一比例对于T细胞转染更优）。将纳米颗粒/Cas9/sgRNA复合物加至无血清的DMEM培养基中的T细胞中，使其最终体积为500μl，其中Cas9的量100nM。转染6h后将培养基换成X-VIVO 15培养基，继续培养7天后，用APC抗人CD7抗体（BioLegend#343108）染细胞，随后用流式细胞仪检测细胞CD7的表达情况，CD7阴性细胞即为CD7基因敲除后的细胞。由基因组DNA进行单克隆测序（参见实施例3实验方法）。100个以上克隆的Sanger测序结果可用来估算T细胞上的基因编辑效率，并展示编辑的插入或缺失或单核苷酸变异详情。
将Cas9用AF647标记后（参见实施例3制备方法），制备纳米颗粒/Cas9-AF647/sgRNA的自组装复合物，并以同样的条件与T细胞孵育6h，然后用流式细胞仪分析细胞AF647荧光情况，以评价T细胞对Cas9/sgRNA的摄取效率。Dynabeads® CD3/CD28 CTS™（Gibco #40203D）是一种结合了抗CD3和抗CD28抗体的磁珠，提供T细胞激活和扩增所需的刺激信号。为了研究激活对T细胞的影响，我们比较了不同情况激活时细胞的内吞和基因组编辑。细胞以转染时的细胞激活状态命名（例如，“AC-1D”表示对激活24小时的细胞进行转染；激活过一次的细胞冻存并复苏后可进行再一次激活，“RE-3D”表示对重激活3天的细胞进行转染）。
未经过磁珠激活刺激的T细胞在上述条件下转染6h后，细胞内Cas9/sgRNA的摄取效率只有67.7%（图10）。相比之下，所有用磁珠（根据说明书，加入磁珠时细胞数：磁珠数=1:3）激活过的细胞的AF647阳性率接近100%，说明激活可使Cas9/sgRNA摄取量显著增高（图11之a）。同时，重激活细胞的Cas9/sgRNA内化水平高于单次激活细胞，但激活1–3天对内化的影响不大（图11之a）。转染了纳米颗粒/Cas9/sgRNA的细胞继续培养7天后，通过流式计算CD7阴性细胞比例，激活过一次和重激活的细胞均检测到有效的基因编辑，并且基因敲除效率与Cas9/sgRNA的摄取量相关。与未转染的细胞相比，转染的RE-3D细胞中约13.3%的CD7表达降低（图11之b）。对100个克隆进行Sanger测序，发现有15个克隆存在插入或缺失（图12之a），基因编辑效率（15%）与流式检测到的编辑结果相近。
当使用以PD1为靶点的PD1-sgRNA时，也会对T细胞的PD1基因产生编辑（图12之b）。200个克隆中有27个插入或缺失，基因编辑效率为13.5%。与293T或A549细胞系中的单克隆测序数据相比，原代T细胞的插入或缺失序列更长（例如，16bp和35bp插入，106bp、127bp和222bp缺失）。
实施例6：纳米颗粒介导基因编辑后T细胞的深度测序结果
本实施例中应用的扩增CD7靶向区域附近片段的PCR引物为5′-AGCTGCCTCAGGTAGATCCCA-3′和5′-GATCTGCTCCATGCCCCGTA-3′；PD1靶向区域附近片段的PCR扩增引物为5′-TCTGGGCGGTGCTACAACT-3′和5′-AAGCCACACAGCTCAGGGT-3′。基因组 DNA 用引物扩增成250-280bp的片段，经末端修复和加 A 碱基尾端后，再在片段两端分别连上接头，构建出DNA文库。运用高通量测序平台（NovaSeq 6000，Illumina）进行双端测序，每端各测150bp。使用BWA工具（https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/）将高通量测序得到的测序序列（Reads）与参考序列进行比对，使用SAMtools 1.9版本（http://www.htslib.org/）进行分析。
对实施例5中转染了纳米颗粒/Cas9/CD7-sgRNA的T细胞（RE-3D）的深度测序序列结果分析可知（图13），PAM上游第5个位点处发生插入的频率最高，其次是PAM上游第4个位点处。插入序列的长度为1时发生的几率最大，占插入Reads总数的87.3%。基因编辑发生缺失的频率比插入频率高很多，CD7-sgRNA靶向的20bp的第6个位点后发生缺失的频率最高，其次是20bp的第5个位点后和第15个位点后。缺失长度为12时的Reads数占缺失Reads总数的比例最高，达到了62.6%。图14列出了发生频率最高的前6种特定插入或缺失序列及占比，分别为12bp缺失、1bp插入、15bp缺失、不同位置的两种1bp缺失以及4bp缺失。
对转染了纳米颗粒/Cas9/PD1-sgRNA的T细胞（RE-3D）的深度测序序列结果分析可知（图15），PAM上游第5个位点处发生插入的频率最高，其次是PAM上游第4个位点处，这与靶向CD7时的插入情况一致。同样地，插入序列的长度为1时发生的几率最大，占插入Reads总数的75.6%。基因编辑发生缺失的频率比插入频率高很多，PD1-sgRNA靶向的20bp的第9个位点后发生缺失的频率最高，其次是20bp的第4个位点后。缺失长度的Reads数分布相对均匀，缺失长度为8、12、16和1时的Reads数占缺失Reads总数的比例在8%-20%之间。从发生频率最高的前6种特定插入或缺失序列及占比可以得知（图16），比起靶向CD7的基因编辑，靶向PD1的编辑的特定偏好性降低。以上结果有助于更清楚地获悉纳米颗粒介导的Cas9/sgRNA递送对T细胞编辑的详细情况。
实施例7：纳米颗粒递送系统对T细胞活力的影响
纳米颗粒/Cas9/sgRNA转染原代T细胞后继续培养7天，使用吖啶橙/碘化丙啶染料（AO/PI，Nexcelom Bioscience #CS2-0106）对细胞进行染色，通过自动细胞计数器（Cellometer Auto 2000，Nexcelom Bioscience）进行细胞活力评估（图17）。单次激活细胞在递送系统处理后的活细胞占比为85.3%，与未处理的单次激活细胞的活度差别为6.2%；而重激活细胞在递送系统处理后的活细胞占比为80.5%，与未处理的重激活细胞的活度也仅差6.3%。这些数据表明，无论是采用单次激活细胞还是重激活细胞，纳米颗粒递送系统对原代T细胞的毒性都较小，是一种很有潜力的T细胞转染方法。
以上实施例显示使用本发明对T细胞内源基因CD7 和PD1进行的基因编辑，本发明的递送系统也可用于T细胞其他内源基因敲除，可使CAR T细胞能够定向于各类T系抗原，从而扩大可靶向肿瘤的范围；或修饰T细胞中信号通路，增强细胞的活化信号或减弱抑制信号，进一步增强CAR T细胞的功能；或通过敲除T细胞中参与免疫监视的基因，来减少异种来源CAR T的免疫排斥反应，制备的通用型CAR T细胞可以克服病人自身T细胞存在的质量与数量缺陷，还可降低制造自体T细胞产品的时间和费用成本。综上所述，本发明在肿瘤免疫治疗中具有非常广泛的应用前景。

Claims (3)

1.一种由作为内核的蛋白质和作为外壳的高分子形成的可降解纳米颗粒作为Cas9/sgRNA载体的应用，其特征在于，所述高分子是在所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基被修饰引入双键后，与不带电单体和阳离子单体在自由基引发剂存在下原位聚合形成，所述阳离子单体为2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯，所述不带电单体为丙烯酰胺，所述自由基引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺，所述蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰为丙烯酰化修饰，使用N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯进行所述的蛋白质中赖氨酸的伯胺基的修饰，所述蛋白质为牛血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述牛血清白蛋白：丙烯酰胺：2-(二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯：过硫酸铵：四甲基乙二胺的摩尔比为1：3000：3000：250：1000。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米颗粒：Cas9：sgRNA的摩尔比为1:1:1。
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