CN111870581B - 一种利用单链dna纳米结构辅助分选脂质体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用单链DNA纳米结构辅助分选脂质体的方法，该方法利用胆固醇修饰的单链DNA纳米结构，将其与脂质体连接形成这脂质体复合体，通过碘克沙醇梯度密度离心分出不同的组分，在不同的组分中最终得到大小均一的脂质体库。同时，本发明还提供了一种脂质体复合体，利用该复合体可以有效的进行脂质体不同大小的分选。本发明中ssDNs辅助分选技术容易产生平均直径约为40‑140nm的脂质体，从而为系统探索与ssDNs包覆的脂质体被活细胞吸收有关的大小和形状提供了一个有吸引力的平台。

Description

一种利用单链DNA纳米结构辅助分选脂质体的方法

技术领域

本发明属于脂质体调控技术领域，涉及一种利用单链DNA纳米结构辅助分选脂质体的方法。

背景技术

DNA折纸术(DNA origami)是DNA纳米自组装的一种主流方法,通常一条DNA主链在成百上千条合成的DNA短链辅助下,通过碱基互补配对原则折叠并锁定生成所设计的纳米结构。而单链DNA折纸术(single-stranded DNA origami,ssDNA origami)是传统DNA折纸术的一种进化和衍生，它摒除了传统折纸术对众多短序列的需求，通过高度集成序列信息于一条长单链DNA中,实现了由一条DNA序列自组装成复杂可控的纳米结构。与多链DNA折纸术相比，单链DNA折纸术避免了多条DNA折纸术形成过程中可能形成的缺陷和错误，提高了整个纳米结构的局部寻址能力和分辨率，同时由于形成完整的单链DNA纳米结构中没有缺口，因此，比多链DNA纳米结构(msDNs)在生物条件下更加稳定。

脂质体是一类经过充分研究的用于药物递送的纳米颗粒。由于DNA纳米结构在某些癌细胞中具有增强的细胞传递性能，因此具有成为下一代分子传递媒介的潜力。传统的控制脂质体大小的经典方法取决于脂质体形成条件(例如脂质组成和溶剂与水的混合比)以及形成后的均质化(例如挤压和超声处理)和纯化(例如离心和体积排阻色谱)。生产结果与凭经验确定的参数有关，因此限制了用户选择性改变脂质体大小和组成的能力。基于微流体的系统提供了调节脂质体大小和分散性，但通常需要内部使用非标准设备。

自组装DNA纳米结构已经以多种非常规方式与脂质双层相接，以实现可编程膜工程的目标。第一种方法是使用DNA模板形成脂质体支架，精度极高，但任何现有膜都需要在重新组装之前进行胶束化处理。第二种策略是通过按需寡聚或重新配置的DNA装置重塑脂质体的膜结构，这可能会保留某些先前存在的膜特征(例如脂质组成，内部含量)，但最终产物往往不太均匀。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供了一种利用ssDNs辅助的脂质体分选技术可以轻松生成具有不同大小的脂质体，这种复合物在生物状态下具有更好的稳定性，并且比裸脂质体在几种癌细胞有更好的摄取。我们的ssDNs辅助分选技术(与ssDNs的形状无关)容易产生平均直径约为40-140nm的脂质体，从而为系统探索ssDNs包覆的脂质体被活细胞吸收有关的大小和形状提供了一个有吸引力的平台。

一方面，本发明提供了一种利用单链DNA纳米结构辅助分选脂质体的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤S1：制备单链DNA纳米结构；

步骤S2：将所述步骤S1制备的单链DNA纳米结构与待分选的脂质体混合、孵育，得到单链DNA纳米结构包裹的脂质体复合体溶液；

步骤S3：将所述步骤S2中得到的脂质体复合体溶液等密度梯度离心，得分层液；

步骤S4：分别自上而下收集分层液。

在某些实施例中，所述步骤1中单链DNA纳米结构经过胆固醇或生育酚修饰。

在某些实施例中，所述步骤1中单链DNA纳米结构为长单链DNA经过辅助噬菌体法制得。

在某些实施例中，所述长单链DNA纳米结构基因序列的5'和3'端分别添加依赖Zn²⁺的I类DNA切割脱氧核酶识别序列。

在某些实施例中，所述步骤1中单链DNA纳米结构为三角形、四边形、菱形或方结形。

在某些实施例中，所述步骤2中单链DNA纳米结构与待分选的脂质体的混合比例为1:350-1:390，优选为1:375。

在某些实施例中，所述步骤2中的孵育条件为40℃下孵育1-3h，优选地，孵育2小时。

在某些实施例中，所述步骤2中的等密度梯度离心的介质为碘克沙醇溶液，优先地，所述碘克沙醇溶液的密度梯度包括20％，18％，15％，12％，9％，6％，3％和0％(v/v)。

在某些实施例中，所述步骤2中的等密度梯度离心的条件为55,000rpm、20℃离心5h。

另一方面，本发明还提供了一种脂质体复合体，所述脂质体表面连接有单链DNA纳米结构。

在某些实施例中，所述单链DNA纳米结构经过胆固醇或生育酚修饰。

在某些实施例中，所述单链DNA纳米结构为单链DNA纳米结构为长单链DNA经过辅助噬菌体法制得。

在某些实施例中，所述长单链DNA纳米结构基因序列的5'和3'端分别添加依赖Zn²⁺的I类DNA切割脱氧核酶识别序列。

在某些实施例中，所述单链DNA纳米结构的具体形状不限，优选为三角形、四边形、菱形或方结形等单链DNA折纸术能够合成的常规立体结构。

本发明相对于现所有技术的技术效果：

1、本发明提供了一种高效制备单链DNA结构的方法，利用辅助噬菌体法获得含有单链DNA纳米结构序列的单链噬菌粒，并在长单链DNA纳米结构基因序列的5'和3'端分别添加依赖Zn²⁺的I类DNA切割脱氧核酶识别序列，通过这种生物方法富集的单链噬菌体在DNA脱氧核酶的酶切作用下以低成本、高产量的优势获得单链DNA纳米序列，同时，获得的单链DNA序列在适当的体系中自组装成最终的单链三角形结构，不需要纯化，直接进行下一步脂质体的分选。而多条链组装形成的纳米结构(三点星状结构以及六螺旋束)，组装所使用的DNA链一般通过化学合成，成本高，产率低，并且组装后的结构纯化较麻烦，并且纯化过程会进一步损失结构的最终产量。根据本发明的实验测试，获得的单链DNA纳米结构(ssDNs)比多链DNA纳米结构(msDNs)更能抵抗核酸外切酶的降解，具有更好的稳定性。

2、利用本发明的单链DNA纳米结构包被的脂质体，与裸脂质体相比显著提高了其在癌细胞的摄取率，同时，本发明改进了利用DNA结构分选liposome的工艺，本发明中ssDNs辅助分选技术容易产生平均直径约为40-140nm的脂质体，从而为系统探索与ssDNs包覆的脂质体被活细胞吸收有关的大小和形状提供了一个有吸引力的平台，为大规模制备DNA-liposome奠定了基础。

3、本发明在三种不同的细胞系中检测了三种不同大小的脂质体(520-nt三角形包被)的细胞摄取情况，其平均直径分别为40nm，72nm和96nm。通过实验证实了单链三角形涂层在HeLa和MDA-MB-231细胞中增加脂质体的吸收中起着重要作用。同时在两种癌细胞(HeLa和MDA-MB-231)中，三角形包裹的脂质体比较容易摄入，并且脂质体大小与有效摄取之间呈正相关，而在HEK 293T细胞中三种不同大小的脂质体均表现出弱的摄取。本发明中脱氧核酶催化有效生产ssDNs和ssDNs辅助分选脂质体的策略使我们能轻松研究ssDNs包被的脂质体的摄取在所有癌细胞系与正常细胞系中是否有区别，每种癌细胞系是否都具有唯一的最佳脂质体大小，内在的ssDNs包被的脂质体的细胞命运如何以及包裹在脂质体上的ssDNs的形状和表面积对质量的比率如何影响摄取等问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1 520nt单链DNA自组装成三角形结构图

图2构建重组噬菌体及脱氧核酶催化获得三角形单链序列示意图

图3 ssDNA噬菌粒中一系列可切割DNA的脱氧核糖酶底物和相应的酶

图4 AFM表征的单链组装三角形结构

图5不同的DNA纳米结构在核酸酶处理之后的凝胶电泳和统计

其中，图(a-b)2％的天然琼脂糖凝胶，分别显示了多链矩形折纸和ssDNA菱形的DNase I消化产物；图(c-d)1％的天然琼脂糖凝胶，分别显示了三点星形和ssDNA三角形的DNase I消化产物。

图6不同的DNA纳米结构在核酸酶处理之后未消化的纳米结构的百分比与时间的关系图

图7单链三角形辅助脂质体分选的示意图和结果

其中，图(a)SDS-琼脂糖凝胶显示出回收后的组分中的成分，实心和空心箭头分别表示592-nt三角形(用Cy5修饰)和脂质(用罗丹明修饰)的条带；图(b)脂质体的代表性TEM图像.左边显示的是通过50纳米孔挤出的脂质体，右边是相应脂质体的大小直方图(通过高斯函数拟合)；(c)三角形包被脂质体梯度离心分选后不同组分(F)的TEM图像，每张TEM图右边为相应脂质体的大小直方图(通过高斯函数拟合)，脂质体的直径显示为D＝平均值±SD。比例尺为100nm。

图8在HEK 293T，HeLa和MDA-MB-231细胞内对三角形包被的不同尺寸脂质体进行摄取研究

其中，图(a)具有三个不同直径的脂质体摄取的代表性共聚焦图像，用Hoechst染色细胞核，并用罗丹明标记脂质体。所有比例尺均为10μm；图(b)孵育3小时后，内化脂质体的平均荧光强度；(c)与三角形包被的脂质体孵育24小时后检查细胞活力。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。

实施例1单链DNA纳米结构的序列设计

根据PX结构的设计原理，以三角形为例，每条边中两个平行的双螺旋在彼此靠近的点通过交叉连接到另一条链上面去，这种结构可以由一条单链DNA组装形成。PX的长度设计每条边在10至20nm之间，以便其形态可以清晰在原子力显微镜下看到。然后将三个PX分子通过5'-3'至5'-3'连接的方式头尾共价连接以形成三角形，以确保待生成的纳米结构可以从长度大约520nt的长ssDNA自组装(如图1)，其序列如SEQ ID NO:1序列所示。在某些顶端处放置了几个TN(N＝5或7)循环，以放松边缘-边缘连接过程中的约束。

实施例2包含完整DNA纳米结构序列和脱氧核酶切割底物的噬菌粒的构建

插入噬菌粒载体的完整序列由两部分组成：脱氧核糖酶识别位点和纳米结构序列位点。其中纳米结构序列排在中间，两侧是脱氧核酶识别位点。随机选择约10至20个核苷酸作为间隔序列，并将其分配在脱氧核酶和DNA纳米结构的位点之间，以避免两者之间存在空间位阻，从而确保前者在ssDNA扩增子即使在附近具有大结构的情况下正常形成发夹结构从而正常切割。以三角形结构为例，长度为45nt(序列：5'-GATGTACAGCCATAGTTGAGCATTAAGTTGA/AGTGGCTGTACATC-3')的高活性自切割脱氧核酶(I-R1a)被埋在纳米结构位点的两侧。当DNA变成单链形式时，I-R1a形成发夹二级结构，并在保守5'-GTTGAAG-3'区域的两个A之间自我切割。或者，该自切割脱氧核酶(I-R1a)也可被脱氧核酶底物序列5'-X16-GTTGAAG-Y16-3'(39nt)取代，通过外源加入过量的脱氧核糖酶(E)链5'-Y'16-TAGTTGAGCT-X'16-3'与底物区域杂交并完成切割(X'16和Y'16代表与X16和Y16互补的16个核苷酸)。化学合成待插入噬菌粒载体的完整序列(GeneRay合成)，然后通过同源重组方法构建重组质粒，将完整序列构建到噬菌粒载体p3024上(pBluescript变体)。通过测序验证重组的p3024-triangle序列正确，编码四边形组装的序列如SEQ ID NO:2所示，编码菱形组装的序列如SEQ ID NO:3所示，编码方结组装的序列如SEQ ID NO:4，重组的p3024-triangle全长序列如SEQ ID NO:5所示。

实施例3辅助噬菌体辅助扩增单链DNA

将p3024-triangle转化的单个菌落在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的20ml LB培养基中于37℃过夜生长。300mL体积的2x YT培养基(16.0g/L胰蛋白,10.0g/L酵母提取物，5.0g/L NaCl，5mM MgCl₂)分别接种3mL过夜培养物，并以250r/min的速度振摇。当培养物的OD600达到约0.4-0.5时，向其中加入VCSM13辅助噬菌体使MOI为20。30分钟后，将卡那霉素(终浓度50μg/mL)添加到培养物中以选择感染的细胞。约4.5小时后，收集培养物，并在4℃以4000rcf离心15分钟去除菌体。将上清液转移至干净的瓶中，并用PEG 8000(40g/L)和NaCl(30g/L)溶解。将混合物在冰上温育30分钟，然后在4℃以5000rcf离心30分钟。弃去上清液，将噬菌粒沉淀重悬于10ml Tris(10mM，pH 8.5)中，将其在4℃以16000rcf离心10分钟以除去任何细菌残留物。然后将得到的噬菌粒颗粒上清液转移到干净的瓶子中，准备进行噬菌粒蛋白剥离。

为了剥离噬菌粒蛋白，将两倍体积的NaOH(0.2M，具有1％SDS)与噬菌体收集物轻轻地混合。之后，将混合物在室温下孵育3分钟。然后将1.5倍体积的KOAc(3M，用冰醋酸滴定至pH 5.5)与样品轻轻颠倒混合。将样品在冰水浴中进一步孵育10分钟，然后在4℃下以16000rcf离心30分钟。收集上清液，并与2倍体积的100％乙醇混合。在冰水浴中孵育30分钟后，将混合物在4℃下以16000rcf的转速再次离心30分钟。弃去上清液，并用75％乙醇洗涤沉淀物(具有三角形结构序列的重组p3024单链DNA)以除去另外的盐。将干燥的重组单链DNA序列溶于1ml Tris(10mM，pH 8.5)或ddH₂O中，以进行进一步分析。

实施例4脱氧核酶切割富集目的单链DNA纳米结构序列

将来自噬菌粒扩增的大约20-400nM ssDNA扩增子溶解在含有50mM HEPES(22℃，pH 7.0)和100mM NaCl的缓冲液中。对于可以通过反式切割设计的那些ssDNA扩增子，将相应合成DNA酶链(如图3，其中E1-E4，序列如SEQ ID NO:6、7、8、9所示，E1、E2是用于切割三角形，E3、E4是用于切割菱形)约5倍摩尔比与扩增单链DNA混合。将样品加热到90℃3分钟，然后冷却到75℃5分钟，60℃5分钟，45℃5分钟和22℃5分钟。快速退火后，加入等体积的缓冲液2，其中包含50mM HEPES(22℃下的pH 7.0)，100mM NaCl和4mM ZnCl₂，并将样品在37℃下温育，以使脱氧核酶催化的DNA处理几个小时。然后将切割产物与3倍体积的100％乙醇(在4℃下预冷却)剧烈混合，并在4℃下以16000rcf离心30分钟。将沉淀物进一步用75％乙醇(在4℃下预冷却)洗涤，以去除残留的盐，在4℃下以16000rcf离心10分钟，然后重悬于1x变性加载缓冲液(40mM Tris，40mM硼酸盐)中，6M尿素，0.5mM EDTA，pH 8.0、10％(w/v)蔗糖，0.05％SDS，0.01％(w/v)苯酚蓝，0.01％(w/v)二甲苯氰。根据ssDNA的大小和切割产物的大小，选择变性PAGE或变性琼脂糖凝胶以纯化靶DNA。对于大规模纯化，我们使用琼脂糖凝胶纯化所有四个结构的ssDNA。通过使用DNA回收试剂盒(Omega BioTek)来回收ssDNA。

实施例5单链DNA纳米结构的组装和原子力显微镜表征

由于ssDNs是由一条长的单链DNA组装而成的，因此不需要添加额外的辅助DNA链。为了组装三角形，使用了快速退火方案，将相应的ssDNA样品加热至90℃3min，然后冷却至75℃5min，60℃5min，45℃5min，然后在22℃下放置5min完成组装。

所有的样品都是在Multimode VIII显微镜下使用ScanAsyst Fluid+针(Bruker)以ScanAsyst模式在液相中进行成像。结构组装完成后，取样品5μl(1-4nM)沉积到新撕过的云母表面(Ted Pella，Inc.)，吸附2min。然后将25μl 1x TAE/Mg缓冲液(40mM Tris-HCl，22℃下pH 7.5，20mM乙酸，2.5mM EDTA和12.5mM MgCl₂)和5μl 10mM NiCl₂添加到云母上，然后将25μl 1x TAE/Mg缓冲液沉积到针尖，以排出悬臂梁和支架之间的空气。然后以～0.01N的峰值力，50nm的峰值力振幅和2kHz的峰值力频率扫描样品，扫描结果如图4所示，可以清晰看到三角形结构的轮廓。

实施例6核酸酶降解测试

利用核酸降解测试比较单链DNA纳米结构和多条链DNA纳米结构的稳定性。根据分子量和构象，将ssDNA三角形与多链三点星状结构进行比较，并将单链形成菱形与多链矩形折纸进行比较，以了解它们在核酸酶消化下的稳定性。分别用DNase I(9U/mL)孵育等量的组装纳米结构(大约15pmol的三角形与15pmol的三点星状结构，以及大约5pmol的菱形与5pmol的矩形)，在100μl溶液中于37℃放置一定时间。在不同的时间点(t＝0、5、10、20、40和60min)，取出15μl样品并与15μl终止缓冲液10mM EGTA(乙二醇bis(2-氨基乙基醚)-N，N，N'，N'-四乙酸)，20％β-巯基乙醇)终止消化。得到反应后的样品，将其上样在1-1.5％1xTAE/Mg缓冲液配置的GelRed预染的琼脂糖凝胶中，70V下电泳3-5小时。电泳后，将凝胶用GelDoc XR+系统(Biorad)成像并在Quantum One软件下进行分析(如图5-6)，如琼脂糖凝胶电泳所观察到的，两种单链DNA纳米结构在核酸酶消化下均是稳定的，在约9U/mL的DNase I中处理约1h之后结构仍剩下90％以上。相比之下，三点星状的降解程度为34％，而矩形在1小时后几乎完全被降解。这些结果表明，ssDNs本质上比msDNs更耐核酸酶降解，这可能是由于ssDNs中不存在缺口。

实施例7脂质体制备

脂质体制备的整个过程包括三个阶段。第一个阶段包括溶剂蒸发和脂质再水化。为了制备最终脂质浓度为5mM，组成为59.2％DOPC，30％DOPE，10％DOPS和0.8％Rho-PE的600μl脂质体，将适当体积的脂质原液(溶于氯仿)混合放入圆底玻璃管中。将该混合物用氮气吹干至少半小时，直到在管的底部形成脂质膜，然后将其置于干燥器中并进一步真空干燥过夜。之后，将600μl 1x水合缓冲液(HB，25mM HEPES，400mM KCl，10mM MgCl₂，pH 7)添加到试管中，搅拌半小时以重新悬浮脂质并重新水化。第二个阶段，按照顺序挤出以生产直径为50-200nm的脂质体。将重新水化的脂质转移到1mL试管中，通过液氮浴和37℃水浴冷冻解冻5-10次，以将巨大的脂质聚集体分解成较小的碎片。然后按照制造商的建议，使用MiniExtruder(Avanti Polar Lipids)将脂质悬浮液依次挤出到孔径为400nm，200nm，100nm和50nm的聚碳酸酯膜中。将挤出的200nm，100nm和50nm脂质体转移到新试管中，以在4℃下保存。在阶段三(可选)中，进行超声处理以产生较小的脂质体(平均直径约为30nm)。将至少100μl 50nm挤出脂质体添加到试管中，并置于冰水浴中，然后将其用超声波清洗器SB-80(SCIENTZ)超声处理约2小时。最终得到一系列大小不同的脂质体。

实施例8单链DNA纳米结构辅助脂质体分选

首先制备用于脂质体分选的ssDNA纳米结构。选择了两个单链DNA纳米结构，即三角形和菱形，以协助脂质体分选。对于这两个结构，在两端分别有一个单链突出端，一个在5'端，另一个在3'端。以三角形为例，我们设计并合成了Cy5修饰的ssDNA与5'突出端杂交以标记三角形，以及胆固醇修饰的ssDNA与3'突出端杂交以允许三角形附着在脂质双分子层表面，其中Cy5修饰链为SEQ ID NO:10/3Cy5/，胆固醇修饰链为：/5CholTEG/SEQ ID NO:11。以菱形为例，合成原理与三角形类似，其中Cy5修饰链为/5Cy5/SEQ ID NO:12，胆固醇修饰链为SEQ ID NO:13/3CholTEG/。为了准备用于脂质体分选的组装体，将ssDNA三角形与2倍摩尔比的Cy5修饰的和胆固醇修饰的链在1x TAE/Mg缓冲液中，以浓度为20-100nM快速退火组装。组装后，用50kD MWCO超滤管(Millipore)除去多余的胆固醇/Cy5修饰的ssDNA链。通过6％的非变PAGE凝胶进一步检查组装体的完整性，其中将胆固醇/Cy5修饰的三角形与裸三角形进行比较时，观察到清晰的主带移位(运行较慢)。而菱形的组装体准备与三角形的组装相似，只是调整了退火方案以使其与菱形的折叠相适应，并且使用了1％的天然琼脂糖凝胶来检查所制备产品的质量。

对于三角形辅助分选，我们通过将不同尺寸(200nm：5％，100nm：45％，50nm：45％和超声：5％)的挤出/超声处理的脂质体汇集在一起，制成脂质体混合物。而对于菱形的辅助分选，将脂质体的比例进行了微调，去除超声处理的脂质体并添加更多的200nm挤出脂质体。以三角形为例，将约280μl胆固醇/Cy5修饰的三角形(1μM)与21μl脂质体样品(5mM脂质)在500μl管中混合，在40℃下持续不断的搅拌下孵育2h。其中纳米结构和脂质的比例为1：375，根据经验确定该比率足以使纳米结构完全包被脂质体。同时，用1x HB(25mM HEPES，400mM KCl，10mM MgCl₂，pH 7)缓冲液将60％的商业OPTI储备液稀释成一系列的稀释液(包括20％，18％，15％，12％，9％，6％，3％和0％(v/v))制备碘克沙醇密度梯度)。将301μl三角形包裹的脂质体与180μl 60％的碘克沙醇混合以形成～22.5％的碘克沙醇溶液，将其置于4ml超速离心管的底部。然后将碘克沙醇稀释液(从20％到0％)小心地添加到试管中(从重到轻，一个接一个地稀释)，不同浓度的稀释液体积都为460μl。将载有样品的离心管在SW60Ti转子中以55,000rpm、20℃离心5h。超速离心后，从上至下以每份200μl(总共约20个组分)收集试管中的样品。移液时需要注意避免梯度污染。将回收的组分回收在不透光的96孔板中，并保存在室温进行进一步表征。

实施例9分选后的脂质体质量检测

为了检查分选的效果，将约2μl的每层组分上样至3.5％琼脂糖凝胶(含0.05％SDS)中，并在70V下运行约2h。凝胶由Typhoon 9500扫描仪(GE)成像，其中Cy5通道用于跟踪DNA，Cy3通道用于观察脂质。为了除去碘克沙醇，将某些选定的组分合并，使用30kD MWCO(Amicon)离心(在10,000rcf下10-15分钟)浓缩至～50μl。然后将样品用1x HB(25mMHEPES，400mM KCl，10mM MgCl₂，pH 7)洗涤至少三次。同时根据琼脂糖凝胶电泳中脂质体的分布挑选组分进行TEM成像。将约5μL脂质体样品沉积在辉光放电的碳涂层铜栅板上(Electron Microscopy Sciences)。将样品滴加在碳膜表面室温下孵育约3分钟，然后滤纸吸干。然后将碳膜用2％(w/v)甲酸铀酰染色液短暂洗涤，并再次用铀盐染色1分钟。然后将样品在120kV操作下的FEI Talos L120C显微镜进行成像。分别使用ImageJ和OriginPro 8软件进行脂质体大小的测量和统计分析。

三角形分选结果如图7所示,在SDS-琼脂糖凝胶上发现，三角形和脂质体在许多组分中是同时存在的。而在最后一个组分(F20)中，最亮的Cy5和几乎看不见的罗丹明信号表明在最底部有多余的三角形，表明脂质体的表面包被是饱和的。TEM成像证实，每个组分(F10-F18)中的脂质体均具有独特的大小均一性(图7c)，F10的平均直径估计为96.9nm，F13的平均直径为75.7nm，在F15、F18分别为61.7nm、39.8nm。同时，所有四个组分中脂质体直径的变异系数均落在11％-12％的狭窄范围内(图7c)。总之数据表明，三角形辅助脂质体分选与多条链纳米结构辅助脂质体的分选具有可比性。另外，作为对照，我们准备了一个挤出的(50nm)脂质体样品，并通过TEM将其与三角辅助分选脂质体进行了比较(图7b)。显然，前者的尺寸均一性相对较差，平均直径为61.9nm，变异系数约为33％。

实施例10不同尺寸的均一脂质体在不同细胞的摄取

用添加了10％FBS(Gibco)、1％青霉素-链霉素的DMEM(HyClone)在含有5％的CO₂，37℃的培养箱中培养三种不同的细胞HEK 293T，MDA-MB-231和HeLa。然后在三种细胞上用不同直径(40、72和96nm)的DNA包被的脂质体进行比较性的细胞摄取研究。将每种类型的不同细胞以约300,000个细胞/毫升的密度接种在具有完全生长培养基的12孔板中，并在37℃下用脂质体(约500pmol脂质)处理3h。之后，将细胞用1x PBS洗涤三次，用胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶，在37℃下1-3分钟)，离心(1,000rpm，3分钟)以去除上清液，然后重悬于300μl PBS中。在BD LSRFortessa仪器上，使用PE-A通道(在561nm激发，以检测脂质中的罗丹明染料)对细胞进行流式细胞检测。收集门控细胞的细胞荧光分布，并计算MFI(平均荧光强度)。使用来自三个不同复孔的荧光信号的标准偏差来测量误差线。每个实验至少重复两次。同时将HEK 293T，MDA-MB-231和HeLa细胞分别接种在35毫米培养皿中，并在37℃下孵育过夜，以达到接近流式细胞术细胞密度的细胞密度。将每种类型的不同细胞在37℃下用脂质体(约500pmol脂质，三种不同大小，40、72和96nm)处理3h。然后除去培养基，并将细胞用1x PBS洗涤3次，并在23℃下用4％多聚甲醛固定15分钟。除去多聚甲醛，并将细胞在1x PBS中再水化以进行成像。用Hoechst 33342(Beyotime Biotechnology)对细胞核进行染色。在TCS SP8 STED 3X显微镜(Leica)上以63x和63x3或63x4放大率对这些细胞进行共聚焦显微镜成像。流式和共聚焦检测结果如图8所示，对于两种癌细胞(HeLa和MDA-MB-231)在3小时的孵育后，三角形包裹的脂质体容易大量进入细胞，脂质体大小与有效摄取之间呈正相关，估计96nm脂质体的吸收量比40nm脂质体大3倍。共聚焦成像还显示了两个癌细胞中内化脂质体的不同分布模式，脂质信号在MDA-MB-231中显得更密集且更靠近细胞核。这可能表明内部化脂质体的区室化或细胞命运在HeLa和MDA-MB-231细胞中有所不同。而三种不同大小的脂质体在HEK 293T细胞中均表现出弱的摄取(约占HeLa和MDA-MB-231摄取的十分之一)。

然后进行ssDNA-纳米结构包被的脂质体在细胞中的毒性测试。将HEK293T，MDA-MB-231和HeLa细胞接种在96孔板中，并一式三份在37℃下孵育过夜。接下来，用不同大小的脂质体(～500pmol脂质)处理细胞，并进一步孵育24小时。然后除去培养基，并将细胞用1xPBS洗涤3次。向每个孔中添加约100μl补充有10μl MTT溶液(5mg/mL)的新鲜细胞培养基(DMEM，10％FBS，1％P/S)，并将细胞再孵育4小时。小心地从孔中除去上清液，再加入150μlDMSO溶解MTT生成的甲酰胺。之后，使用酶标仪测量在570nm/655nm(样品/参比)的吸收，并计算相对于对照细胞的细胞毒性。对于所有细胞毒性测试，证实添加脂质体(约500pmol脂质)对三种细胞细胞无明显毒害作用(图8c)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属肿瘤医院

<120> 一种利用单链DNA纳米结构辅助分选脂质体的方法

<130> 2020

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

ctcaggtcta acaagtcaca tatctgtgat gatctagtat ttttactagg tcgcaacaga 60

cacaatactt gaccgatttt tcggtgccta attgtggcat ttgcgacacc actacattca 120

ctgttagttc tggctttaac acctctctat cgcatccaac caagatcgct ggagactata 180

cagtcgtatc tgaagctcga catcttttga tgtccgaagt cagattgagt tgtataagga 240

acagcgatct tgtttttttg ttggatgcgg ttggtaggtg cgtagaccag agccgagttt 300

tctcggcagc actctacgct tggaccaacc accattttta tggtgataga gccaagttaa 360

aggtgctact aacagtgatt tttttatgta gtggtatcat caatgctatg tgtaggctta 420

gacctgagca gtgctcgcag agctaacgac acgacaatgt tgtctctctc atttttatga 480

gattcctaac attactcagt cgttcttcgt gcgagcactg 520

<210> 2

<211> 683

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

ctagtgtgtc agagagctga gtacggatag gtagaaggct tttgccttca cctgatccgt 60

cgcagtctct cctcagtttt ctgagtcatg actgcgatgt gtcaggttcc aatgcactcc 120

tgttgacgac tagcgacacc aacgcacctg tgtaacgatc gacttcggtc atcatggacc 180

agtagacgta ctagtgtctg actctgaagc ttagcagtct ctatgctgac agcagcaact 240

cgctcgtttt tacgagctgt acgctgctat ggacatagac gttactaagc ttcagttttt 300

agtcagacac gtctcagtct aacctgtcat gacagtggtt ttccactgtt gtcacaggtc 360

acgttgagac gaagtctttt gacttctagt acacgtgctg gtcgacaatg accgaagtct 420

ttttgatcgt tacaatgtag cgttgagcac tctagtcctg tgttttcaca ggtgctaagt 480

gctctcgtct acatcgcacg ttttcgtgcg caggtgacga ggtgtcgtag cacgtcaaca 540

ggatttttgt gcattggata cctacacata ctcagcatga tgacacacta ggacttcacg 600

gtgagttatg accgtcagag agctgactga cctcttttta gaggttaacg agctcttcca 660

tggtcatgta caaccgtgaa gtc 683

<210> 3

<211> 2268

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

tacggcacgt aagccttgca ttgactagcc ctcccccaca actgactgat tgctgaatct 60

tgcggtgtgt ggagttcatc tgcatcctgc ccaactccgg cggcggttgc acgatcaaca 120

ttttctttct ttctttcttt tatgaaaggc agttgggcca gtaggcggtc cacctatgag 180

caccaaagga tcctggtcgt cgggccagcc accacgtatt gctattacga tttttctttc 240

tttctttctt ttacgtatgc taactcattg ctcctaagac cagtataagt tccatggctg 300

gactccggca atgagcggga accgctgatt caacgaccag cattttcttt ctttctttct 360

tttaccattc cgcgtcgagg gacgaattgg atctatctct gtgtcattct ggaccgtaag 420

cgcgcgtcag aatttgaaga ggacaatcga cgtttttctt tctttctttc ttttcgctct 480

tcaaacgagt cggttgcaat gttgcgcctc ggcgtgatcc tgcttactcg actgctctaa 540

tggacaaggc ttaaccgcgc tttcttcttt atctctcttg ttaagcagtc tgcgaaatcg 600

gggtagaacc aatgaatcct caagcactgc ccgggtagag atgagcaacc ttcttgtcct 660

ttttctttct ttctttcttt ttctgaagca gactatctga cgcaggggtg gacgaaaccg 720

aggtgccgaa gacaagggct agatcggatt tctccggtcc ggatcacgcg tttttctttc 780

tttctttctt ttggacaatc agcaggatta agttcaacct tgaatcgact ccggcagcca 840

cagatctcta caggacgaac gacacctgaa ctacgctacc tcttttcttt ctttctttct 900

tttgaaagtg cttatctaga cgaaacatag cccgagccga agcgtatgtc gcgtgccccg 960

aacgcgccgt acaaccacag gttttggaaa atcttttctt tctttctttc ttttcctttc 1020

ctcaactcgt gtacgggtct aaaccatcag gacagtatga gtacaggaag ggctcgaagg 1080

catgttcagt cagtagcccc cgcaacagcg actagataat cgaccgcgtc ccatacagcg 1140

actagataat cgaccgcgtc ccattgcggg ggctagtctt tgaacatgcc caatacccct 1200

tcctgtgggt gtactgtcct gatcctctag acccgtaccg tgggtgagga aaggttttct 1260

ttctttcttt cttttgattt tccaacgcaa ctggttgtac gaagtgctcg gggcacgact 1320

ggtacgcttc ggcggtcttt atgtttcgtc aagataagca ctttcttttc tttctttctt 1380

tcttttgagg tagcgttttc ctggtgtcgt tccctttgta gagatctggc cagaccggag 1440

tcgacagaat gttgaactta cgcattctga ttgtcctttt ctttctttct ttcttttacg 1500

cgtgatcaga gcaggagaaa tccaattctg cccttgtctg ctcatcctcg gtttcagaat 1560

cccctgcgtc attgggcctg cttcagattt tctttctttc tttcttttag gacaagaaac 1620

ggcttcatct ctaccccaac agtgcttgag cggtagttgg ttctacctcg acttcgcaga 1680

ctcacgctca agagagattt ctttgaaagc gcggagcgtg cttgtccatt cggaccgtcg 1740

agtaagaatg cgcacgccga ggaacctgat tgcaaccgcc cacgttgaag agcgttttct 1800

ttctttcttt cttttacgtc gattgtggtt ttcaaattct ggcacttgct tacggtcttc 1860

aaggacacag agaagaattc aattcgtccc ccgatgcgga atggtttttc tttctttctt 1920

tctttttgct ggtcgtctac cgagcggttc cctcggcatg ccggagtctc tggctggaac 1980

ttatcgacat cttaggagca acaccctagc atacgttttt ctttctttct ttcttttatc 2040

gtaatagttc gaggtggtgg ctgaagaccc gaccaggatg tcctggtgct cataggattc 2100

tcgcctactg gccgggctgc ctttcatttt tctttctttc tttctttttg ttgatcgtag 2160

ccgtgccgcc ggaggatagt aggatgcaga aggaaaccac acaccgctag attcagcaat 2220

caaagacttg tgggggagat ccggcatcgc gattcatctt cgcgaatc 2268

<210> 4

<211> 1673

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

atccaggaag ggctatggtt ttcatcgaag atagacaaat agacagcatg ccaatgatga 60

tcagaagagg acgagttttg gccatatctg gcatgttttt catgccgatt ctatctgagt 120

tcgccaacct actttttgta ggtcgaggag agcttttagc tcatcgaact cttaccagtc 180

atcttatttc ccagcaataa cgaggttggg ttttaggact tgcttcgact aggaacggga 240

gggagaaggg aacgagatac tcgtagattt tgttgaccga aacaaaccaa accgcagcta 300

cgacgcacca tgatggtatc tcgattttag ctcagggcac tagtggtagg tagtggtggg 360

gtggcgaact acctgtctat cttttcctca agactagaat cctcatcgtg atgagtacag 420

gaacagtagg acagctgatt ttggattccc agagtgactt tttgtcacta ggcacctcag 480

cgaaatctat ctcggttttt ccgagaacag taccagtttt aggctcgcgg ttcttggaac 540

cttggcagta gacaaccttt ccagggaacg tgcttttgac ctaacttgga tgctttttgc 600

atcctgttag tagcggcctc cgtgacgtag tttttctacg tagctgatgg attttgtacc 660

gctgcagtct gctacatcag ggacggactg attcacctct agctcacatt ttctagcggg 720

tggtgagctt tttgctcacg agtggaattc aacggccctt tcaatctttt tgattgaagc 780

atccgttgtt ttaattccac tcgcagtaca tctatgtgct cagtctccgt ttttcggagt 840

agtcgcacat agatgtactg ccacccgcta gtgtgagcta gatcatgatc agtccgtccc 900

tgatgtaggt ttgtgcagcg gtactccatc agctagtaac acgcaagtgg tacctcctgg 960

ctttttgcca ggctaagcca cttgcgtgtt actcacggag gccttttgct actaacagct 1020

tcgtttttcg aagcaagtta ggtcgcacgt tccctctcgt ggttgtctac tgccaaggtt 1080

cagtcgaccg cgagcctctg gtactgttga aactttttgt ttcatagatt tcgctttttg 1140

aggtgcctac acgatctcat caacgctaag gccacttttt gtggctacct cgttgatgag 1200

atcgtgtctg ggaatcctca gctgtcctta ttgtcctgta ctcagatgaa tgaggattct 1260

tcgattgagg gatagacagg tctgatgcca ccccaccact acctaccttg tctgccctga 1320

gcttcgagat accaggtgag tgcgtcgtag ctgcggtttg cagactttcg gtcaactcta 1380

cgagtatgga aatcccttct ccctcccgtt cctcaagaaa gcaagtcctc ccaacctcgt 1440

actgtctggg aaataatcac gctggtaaga gtagtctgag ctgctctcct cgagtagctc 1500

gtcgactcta gtcggtgtgt ttttcacacc tcagtgagtc gacgagctac ttggcgaact 1560

cttttagata gaatcgctct ctttttgaga gcagatatgg ccctcgtcct cttagttcca 1620

tcattggcat gctgtctata ctagtatctt cgatgccata gatgctcctg gat 1673

<210> 5

<211> 8568

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

ctcgagatac tgactgacct cagcgttgaa gtcgcacgtt cggtagcttt tttctcaggt 60

ctaacaagtc acatatctgt gatgatctag tatttttact aggtcgcaac agacacaata 120

cttgaccgat ttttcggtgc ctaattgtgg catttgcgac accactacat tcactgttag 180

ttctggcttt aacacctctc tatcgcatcc aaccaagatc gctggagact atacagtcgt 240

atctgaagct cgacatcttt tgatgtccga agtcagattg agttgtataa ggaacagcga 300

tcttgttttt ttgttggatg cggttggtag gtgcgtagac cagagccgag ttttctcggc 360

agcactctac gcttggacca accaccattt ttatggtgat agagccaagt taaaggtgct 420

actaacagtg atttttttat gtagtggtat catcaatgct atgtgtaggc ttagacctga 480

gcagtgctcg cagagctaac gacacgacaa tgttgtctct ctcattttta tgagattcct 540

aacattactc agtcgttctt cgtgcgagca ctgtttttag agttacgtat tcactcgaat 600

gcggctacgc gacagcgttg aagagtgtag ttacctcagc ttgatgctca cgtttttcta 660

gtgtgtcaga gagctgagta cggataggta gaaggctttt gccttcacct gatccgtcgc 720

agtctctcct cagttttctg agtcatgact gcgatgtgtc aggttccaat gcactcctgt 780

tgacgactag cgacaccaac gcacctgtgt aacgatcgac ttcggtcatc atggaccagt 840

agacgtacta gtgtctgact ctgaagctta gcagtctcta tgctgacagc agcaactcgc 900

tcgtttttac gagctgtacg ctgctatgga catagacgtt actaagcttc agtttttagt 960

cagacacgtc tcagtctaac ctgtcatgac agtggttttc cactgttgtc acaggtcacg 1020

ttgagacgaa gtcttttgac ttctagtaca cgtgctggtc gacaatgacc gaagtctttt 1080

tgatcgttac aatgtagcgt tgagcactct agtcctgtgt tttcacaggt gctaagtgct 1140

ctcgtctaca tcgcacgttt tcgtgcgcag gtgacgaggt gtcgtagcac gtcaacagga 1200

tttttgtgca ttggatacct acacatactc agcatgatga cacactagga cttcacggtg 1260

agttatgacc gtcagagagc tgactgacct ctttttagag gttaacgagc tcttccatgg 1320

tcatgtacaa ccgtgaagtc tttttcttat actcagagaa ttcgtatgga tcacgttgaa 1380

ggagacccaa gctggctagc gtttaaactt aagcttggta cccctcagcg acgttgaagg 1440

atcagtggca atcgtcatac ggcacgtaag ccttgcattg actagccctc ccccacaact 1500

gactgattgc tgaatcttgc ggtgtgtgga gttcatctgc atcctgccca actccggcgg 1560

cggttgcacg atcaacattt tctttctttc tttcttttat gaaaggcagt tgggccagta 1620

ggcggtccac ctatgagcac caaaggatcc tggtcgtcgg gccagccacc acgtattgct 1680

attacgattt ttctttcttt ctttctttta cgtatgctaa ctcattgctc ctaagaccag 1740

tataagttcc atggctggac tccggcaatg agcgggaacc gctgattcaa cgaccagcat 1800

tttctttctt tctttctttt accattccgc gtcgagggac gaattggatc tatctctgtg 1860

tcattctgga ccgtaagcgc gcgtcagaat ttgaagagga caatcgacgt ttttctttct 1920

ttctttcttt tcgctcttca aacgagtcgg ttgcaatgtt gcgcctcggc gtgatcctgc 1980

ttactcgact gctctaatgg acaaggctta accgcgcttt cttctttatc tctcttgtta 2040

agcagtctgc gaaatcgggg tagaaccaat gaatcctcaa gcactgcccg ggtagagatg 2100

agcaaccttc ttgtcctttt tctttctttc tttctttttc tgaagcagac tatctgacgc 2160

aggggtggac gaaaccgagg tgccgaagac aagggctaga tcggatttct ccggtccgga 2220

tcacgcgttt ttctttcttt ctttcttttg gacaatcagc aggattaagt tcaaccttga 2280

atcgactccg gcagccacag atctctacag gacgaacgac acctgaacta cgctacctct 2340

tttctttctt tctttctttt gaaagtgctt atctagacga aacatagccc gagccgaagc 2400

gtatgtcgcg tgccccgaac gcgccgtaca accacaggtt ttggaaaatc ttttctttct 2460

ttctttcttt tcctttcctc aactcgtgta cgggtctaaa ccatcaggac agtatgagta 2520

caggaagggc tcgaaggcat gttcagtcag tagcccccgc aacagcgact agataatcga 2580

ccgcgtccca tacagcgact agataatcga ccgcgtccca ttgcgggggc tagtctttga 2640

acatgcccaa taccccttcc tgtgggtgta ctgtcctgat cctctagacc cgtaccgtgg 2700

gtgaggaaag gttttctttc tttctttctt ttgattttcc aacgcaactg gttgtacgaa 2760

gtgctcgggg cacgactggt acgcttcggc ggtctttatg tttcgtcaag ataagcactt 2820

tcttttcttt ctttctttct tttgaggtag cgttttcctg gtgtcgttcc ctttgtagag 2880

atctggccag accggagtcg acagaatgtt gaacttacgc attctgattg tccttttctt 2940

tctttctttc ttttacgcgt gatcagagca ggagaaatcc aattctgccc ttgtctgctc 3000

atcctcggtt tcagaatccc ctgcgtcatt gggcctgctt cagattttct ttctttcttt 3060

cttttaggac aagaaacggc ttcatctcta ccccaacagt gcttgagcgg tagttggttc 3120

tacctcgact tcgcagactc acgctcaaga gagatttctt tgaaagcgcg gagcgtgctt 3180

gtccattcgg accgtcgagt aagaatgcgc acgccgagga acctgattgc aaccgcccac 3240

gttgaagagc gttttctttc tttctttctt ttacgtcgat tgtggttttc aaattctggc 3300

acttgcttac ggtcttcaag gacacagaga agaattcaat tcgtcccccg atgcggaatg 3360

gtttttcttt ctttctttct ttttgctggt cgtctaccga gcggttccct cggcatgccg 3420

gagtctctgg ctggaactta tcgacatctt aggagcaaca ccctagcata cgtttttctt 3480

tctttctttc ttttatcgta atagttcgag gtggtggctg aagacccgac caggatgtcc 3540

tggtgctcat aggattctcg cctactggcc gggctgcctt tcatttttct ttctttcttt 3600

ctttttgttg atcgtagccg tgccgccgga ggatagtagg atgcagaagg aaaccacaca 3660

ccgctagatt cagcaatcaa agacttgtgg gggagatccg gcatcgcgat tcatcttcgc 3720

gaatcggtac cgagctcgga tccactagtc cagtgtggtg gaattctgcg ttgaaggatc 3780

tcgaggcgtg tgaattccct ggcttctcct gagaaacccg gtaccgaagt cgcacgttcg 3840

tttttgtatg ctatttttat ccaggaaggg ctatggtttt catcgaagat agacaaatag 3900

acagcatgcc aatgatgatc agaagaggac gagttttggc catatctggc atgtttttca 3960

tgccgattct atctgagttc gccaacctac tttttgtagg tcgaggagag cttttagctc 4020

atcgaactct taccagtcat cttatttccc agcaataacg aggttgggtt ttaggacttg 4080

cttcgactag gaacgggagg gagaagggaa cgagatactc gtagattttg ttgaccgaaa 4140

caaaccaaac cgcagctacg acgcaccatg atggtatctc gattttagct cagggcacta 4200

gtggtaggta gtggtggggt ggcgaactac ctgtctatct tttcctcaag actagaatcc 4260

tcatcgtgat gagtacagga acagtaggac agctgatttt ggattcccag agtgactttt 4320

tgtcactagg cacctcagcg aaatctatct cggtttttcc gagaacagta ccagttttag 4380

gctcgcggtt cttggaacct tggcagtaga caacctttcc agggaacgtg cttttgacct 4440

aacttggatg ctttttgcat cctgttagta gcggcctccg tgacgtagtt tttctacgta 4500

gctgatggat tttgtaccgc tgcagtctgc tacatcaggg acggactgat tcacctctag 4560

ctcacatttt ctagcgggtg gtgagctttt tgctcacgag tggaattcaa cggccctttc 4620

aatctttttg attgaagcat ccgttgtttt aattccactc gcagtacatc tatgtgctca 4680

gtctccgttt ttcggagtag tcgcacatag atgtactgcc acccgctagt gtgagctaga 4740

tcatgatcag tccgtccctg atgtaggttt gtgcagcggt actccatcag ctagtaacac 4800

gcaagtggta cctcctggct ttttgccagg ctaagccact tgcgtgttac tcacggaggc 4860

cttttgctac taacagcttc gtttttcgaa gcaagttagg tcgcacgttc cctctcgtgg 4920

ttgtctactg ccaaggttca gtcgaccgcg agcctctggt actgttgaaa ctttttgttt 4980

catagatttc gctttttgag gtgcctacac gatctcatca acgctaaggc cactttttgt 5040

ggctacctcg ttgatgagat cgtgtctggg aatcctcagc tgtccttatt gtcctgtact 5100

cagatgaatg aggattcttc gattgaggga tagacaggtc tgatgccacc ccaccactac 5160

ctaccttgtc tgccctgagc ttcgagatac caggtgagtg cgtcgtagct gcggtttgca 5220

gactttcggt caactctacg agtatggaaa tcccttctcc ctcccgttcc tcaagaaagc 5280

aagtcctccc aacctcgtac tgtctgggaa ataatcacgc tggtaagagt agtctgagct 5340

gctctcctcg agtagctcgt cgactctagt cggtgtgttt ttcacacctc agtgagtcga 5400

cgagctactt ggcgaactct tttagataga atcgctctct ttttgagagc agatatggcc 5460

ctcgtcctct tagttccatc attggcatgc tgtctatact agtatcttcg atgccataga 5520

tgctcctgga ttttttctag cgtgattgag ctcgaattcg taatcatggt catagctgtt 5580

tccgttgaag caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt 5640

tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc 5700

cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt 5760

tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg 5820

tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg 5880

ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg 5940

ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt 6000

agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt 6060

tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta 6120

tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa 6180

atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg cttacaattt 6240

aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca 6300

ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 6360

aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt 6420

ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca 6480

gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag 6540

ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc 6600

ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca 6660

gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt 6720

aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct 6780

gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt 6840

aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga 6900

caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact 6960

tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc 7020

acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga 7080

gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt 7140

agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga 7200

gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact 7260

ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga 7320

taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt 7380

agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca 7440

aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct 7500

ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta 7560

gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 7620

aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 7680

aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 7740

gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 7800

aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 7860

aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 7920

cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 7980

cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 8040

tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 8100

tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 8160

ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 8220

atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 8280

tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 8340

gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 8400

cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctcc accgcggtgg 8460

cggccgctct agaactagtg gatccgtaaa tcaatgactt acgcgcaccg aaaggtgcgt 8520

attgtctata gccccctcag ccacgaattc gtctgacgac gacaagac 8568

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

gctaccgaac gtgcgatagt tgagctgctg aggtcagtca gt 42

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

ctgaggtaac tacacttagt tgagctgctg tcgcgtagcc gc 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence)

<400> 8

agccagcttg ggtctctagt tgagctgtga tccatacgaa tt 42

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

cacacgcctc gagatctagt tgagctgcag aattccacca ca 42

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

aagctaccga acgtgcgact 20

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

tcaacgctgt cgcgtagccg cattcgagtg aatacgtaac 40

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

tcaacgcaga attccaccac a 21

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

accaagctta agtttaaacg ctagccagct tgggtctcct 40

Claims (6)

1.一种利用单链DNA纳米结构辅助分选脂质体的方法，其特征在于，所述方法由以下步骤组成：

步骤1：制备单链DNA纳米结构，所述单链DNA纳米结构的序列选自SEQ ID NO.1-4中任一，且所述单链DNA纳米结构经过胆固醇或生育酚修饰；

步骤2：将所述步骤1制备的单链DNA纳米结构与待分选的脂质体混合、孵育，得到单链DNA纳米结构包裹的脂质体复合体溶液，其中，所述单链DNA纳米结构与待分选的脂质体的混合体积比例为1:350-1:390，孵育1-3h；

步骤3：将所述步骤2中得到的脂质体复合体溶液等密度梯度离心，得分层液；

步骤4：分别自上而下收集分层液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中单链DNA纳米结构为长单链DNA经过辅助噬菌体法制得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述长单链DNA纳米结构的基因序列的5'和3'端分别添加依赖Zn²⁺的I类DNA切割脱氧核酶识别序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中单链DNA纳米结构包括三角形、四边形、菱形或方结形。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中单链DNA纳米结构与待分选的脂质体的混合体积比例为1:375。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的孵育条件为40℃下孵育2h。

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