CN112852875A - 示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用，设计sgRNA，以Cas9质粒为模板，Cas9质粒和sgRNA形成同源重组载体质粒，将同源重组载体质粒经受精卵显微注射后获得F0代小鼠，经测序获得F0代阳性小鼠，F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代杂合子小鼠；将雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代，即为小鼠动物模型。本发明CD3定点插入IRES‑EGFP的人源化动物携带了人类DNA，且携带绿色荧光可示踪肿瘤T淋巴细胞浸润情况，对肿瘤转移的肿瘤微环境变化提供研究模型。

Description

示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法 及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

原核生物衍生的CRISPR-Cas基因编辑系统改变了操纵，检测，成像和注释不同物种的活细胞中特定DNA和RNA序列的能力。 该技术的易用性和稳健性彻底改变了从基础科学到转化医学的研究的基因组编辑。基于CRISPR/Cas系统的原理，相关人员在体外人工合成了sgRNA序列，以介导Cas蛋白对靶基因的识别和编辑。在sgRNA的指导下，Cas9位于特定的脱氧核糖核酸序列上进行脱氧核糖核酸双链切割，实现基因组的靶向编辑。该基因编辑技术简便、高效、低成本、编辑范围广。

Cd3e 基因CD3是一种T细胞共受体复合体，对TCR信号转导和T细胞分化至关重要。CD3亚基在绝大多数成熟T细胞瘤细胞上表达。T细胞受体基因（例如，CD3D，CD3E，CTLA4和GZMA是驱动许多对癌症免疫力至关重要的基因转录激活的主要因素。

目前利用转基因技术或基因敲除技术进行小鼠的基因修饰 ，在肿瘤免疫治疗中已得到广泛应用。越来越多的转基因小鼠表达一个或多个完全人类基因或人性化敲入编码正面和负面的免疫调节受体和配体，如PD-L1 CD47, BTLA, CD137, TIM3, LAG-3等等,已经生成并商业化。这些小鼠对免疫-肿瘤检查点组合的评估有重要价值。现有研究表达人源PD-1分子的小鼠已用于表征临床候选抗PD-1抗体。Hu-PBL和Hu-CD34+小鼠模型被描述概括了抗CTLA -4给药后的一些不良自身免疫反应，但仍不能分离免疫相关不良事件和抗癌作用。

经典的免疫缺陷动物模型的发展主要经历3次重要的突破。重症联合免疫缺陷小鼠 (Severecombinedimmunodefi-ciency，SCID)，非肥胖型糖尿病一重症联合免疫缺陷小鼠(NOD-SCID)，IL-2受体链基因突变的免疫缺陷小鼠(NOD-SCID IL2rg)，在前期化学抗肿瘤药物研发中发挥了重要的作用，且适用于多个肿瘤细胞系，常应用于早期药物研发中的体内药效筛选 。但其存在一些限制及缺陷，如①使用体外连续传代 的肿瘤细胞株进行移植，由于肿瘤细胞株在体外培养环境中缺乏肿瘤微环境，丢失了原代肿瘤的特性以及生长特性，因此不能客观地反映原代肿瘤的情况，②移植方法往往为局部皮下注射 ，局部注射大量的肿瘤细胞可能导致局部的炎症反应，也可能限制肿瘤的微环境，③由于宿主动物为免疫缺陷动物，因此无法评价以免疫系统为靶点的肿瘤免疫药物。目前用于肿瘤免疫治疗研究的3种人源化动物模型(重建人免疫系统动物模型、重建人免疫系统+人源肿瘤组织异种移植动物模型和基因修饰的人源化动物模型)，（1）重建人免疫系统人源化小鼠在建模后不同时间均会发生致命的 GVHD，且小鼠内源性免疫系统会限制移植人源细胞的扩增等。（2）重建人免疫系统+人源肿瘤组织异种移植动物模型直接将新鲜的人肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，具有良好的临床预测性，不仅能够重建癌症患者肿瘤免疫微环境 ，并且能较为准确的反应肿瘤患者的肿瘤状态，在肿瘤生理学研究和靶向药物的临床前评价方面具有独特的优势，但其仍有一些限制因素，用于移植的人源肿瘤必须是通过手术方式取下的新鲜肿瘤 ，移植成功率低，且移植后肿瘤成活需较长时间。（3）基因修饰的人源化动物模型，具有免疫活性的C57BL/6或BALB/c小鼠的人源化靶标敲入小鼠主要优势是临床候选对象可以在这个模型中进行评估，有一个完全的小鼠免疫系统。基因修饰后的人源化动物在部分或全部细胞内携带了人类 DNA，人源的序列可调节基因表达及编码蛋白。是免疫治疗的抗免疫检查点研究的一种方法。且本设计CD3定点插入IRES-EGFP，携带绿色荧光，可通过流式分析，活体成像但如何保持动物模型本身免疫系统的完整性及减少动物个体差异性，是该模型需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法，具体包括如下步骤：

（1） sgRNA的设计和寡核苷酸链合成：根据实验需要设计两个sgRNA，其所在位置在CD3e基因的第8个外显子上，与EcoRI酶切后形成的黏性末端互补；

（2）载体构建：以Cas9质粒为模板，Cas9质粒和sgRNA形成同源重组载体质粒；

（3）F0代小鼠获得：将同源重组载体质粒经受精卵显微注射后获得F0代小鼠；通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的F0代阳性小鼠；

（4）F1代小鼠获得：F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代杂合子小鼠；

（5）将步骤（4）中的雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代，即为小鼠动物模型。

所述sgRNA为AGGAAAGGGCTTAGCTATGAGGG和TAGGAAAGGGCTTAGCTATGAGG。

本发明的优点在于：

（1）CD3定点插入IRES-EGFP的人源化动物携带了人类 DNA，且携带绿色荧光可示踪肿瘤T淋巴细胞浸润情况，对肿瘤转移的肿瘤微环境变化提供研究模型。

（2）具有免疫活性的C57BL/6小鼠的人源化靶标敲入小鼠有一个完全的小鼠免疫系统，相较于传统的免疫缺陷动物模型更有利于观察肿瘤微环境变化。

（3）基因修饰的人源化动物模型相较于人源肿瘤组织异种移植动物模型，观察周期短，成瘤率更高。

附图说明

图1 CRISPR/Cas9基因敲除设计策略示意图。通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和gRNA；通过无缝克隆的方法构建同源重组载体（donor vector），该载体包含3.0kb5’同源臂、IRES-EGFP和3.0kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。经长片段PCR鉴定正确同源重组的F0代小鼠，与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠。

图2 体外转录Cas9、gRNA电泳结果，其中左图为两个sgRNA电泳图，右图为成功合成Cas9载体的电泳图。

图3 Cas9质粒和sgRNA形成同源重组载体质粒。

图4 F0代小鼠鉴定策略示意图。

图5 同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定结果，4,7,9为阳性，M：1kb DNA marker,marker左侧为5’同源臂鉴定结果，marker 右侧为3’同源臂鉴定结果。WT：野生型对照。

图6 F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定，其中2、3、4、5、8、10号经测序确认均为阳性，Marker左侧为F1代小鼠5’同源臂，Marker右侧为F1代小鼠3’同源臂PCR鉴定电泳图。

图7 F1代小鼠5’同源臂1#PCR鉴定测序比对结果。

图8 F1代小鼠5’同源臂2#PCR鉴定测序比对结果。

图9 F1代小鼠3’同源臂3#PCR鉴定测序比对结果。

图10 F1代小鼠3’同源臂4#PCR鉴定测序比对结果。

图11 F1代野生型、阳性小鼠4、10号流式细胞术检测结果。

图12 F2代纯合子小鼠经颅内原位种植非小细胞肺癌PC-9细胞形成原位转移瘤模型，转移瘤灶生物素发光图，显示绿色荧光，提示可指示T淋巴细胞浸润。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，其它可以参考本领域相应的PCR和基因测序的实验手册。

实施例1

一、 采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，在Cd3e基因3’UTR位点定点敲入IRES-EGFP表达框。

二、确实敲除基因的基本信息

目的基因名称（MGI号）：Cd3e（88332）。

目的基因MGI网址链接：http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:88332。

目的基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summaryg=ENSMUSG00000032093;r=9:44998740-45009627。

方案针对的转录本（Ensembl号）：Cd3e-201（ENSMUST00000102832.2）。

敲入位置：3’UTR；

敲入片段名称：IRES-EGFP；

三、敲入位点上下游序列信息，如下表所示。

四、确定小鼠Cd3e基因定点敲入IRES-EGFP的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2，制备环状Cas9核酸酶体（序列如SEQ ID NO.1所示），使用MEGAclear Transcription Clean-UpKit（Invitrogen，AM1908）纯化DNA和环状Cas9核酸酶体。纯化DNA并与环状Cas9核酸酶体外转录成mRNA；纯化sgRNA至适合转基因注射的纯度（纯度要求：琼脂糖凝胶电泳，需条带清晰；浓度大于400ng/ul；OD260/280在2.1-2.3之间 ） 。所述sgRNA1、sgRNA2的序列如下表所示；体外转录Cas9、sgRNA电泳结果如图2所示，其中左图为两个sgRNA电泳图，右图为成功合成Cas9载体的电泳图。

五、将步骤四所述的sgRNA与Cas9核酸酶mRNA用MEGAshortscript Kit试剂盒体外转录后，将有活性的sgRNA和Cas9RNA的重组质粒（图3）显微注射到受精卵中 （sgRNA1（1.0ng/μl） ，sgRNA2（1.0 ng/μl），载体（10 ng/μl）），注射剂量由卵的膨胀程度决定，注射量至卵刚好开始膨胀。取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，胚胎移植的小鼠出生即为F0代小鼠。

六、经受精卵显微注射，共获得40只F0代小鼠。通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，该项目共获得3只正确同源重组的F0代阳性小鼠（4,7,9号），F0代小鼠鉴定策略示意图如图4所示。

七、F0代阳性小鼠PCR鉴定方法：

同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案：5’臂同源重组阳性基因组应扩增出4.1kb片段，阴性基因组无产物； 3’臂同源重组阳性基因组应扩增出3.7kb片段，阴性基因组无产物。同源重组阳性F0代小鼠PCR鉴定电泳图如图5所示。4,7,9为阳性，M：1kb DNA marker, marker左侧为5’同源臂鉴定结果，marker 右侧为3’同源臂鉴定结果。WT：野生型对照。

5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定方法：

1 .引物信息：

2 .反应体系：

3 .反应条件：

3’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定方法：

引物信息：

反应体系：

*PrimeStar GXL （TaKaRa，Code No：R050A）

反应条件：

八、F1代小鼠获得及基因型鉴定

F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代小鼠信息如下表。经PCR鉴定及测序确认，共获得F1代阳性小鼠6只，号码为：2、3、4、5、8、10号。

F1代阳性小鼠基本信息

九、F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定

PCR鉴定策略及方法同 F0代小鼠鉴定部分，F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果如图6所示。PCR鉴定阳性小鼠为：2、3、4、5、8、10号；经测序确认均为阳性。F1代小鼠5’同源臂（Marker左侧）和3’同源臂（Marker右侧）PCR鉴定电泳图。（数字：F1代小鼠编号；wt：野生型对照；M：1kb DNA ladder）。

十、 F1代小鼠PCR鉴定测序比对结果

F1代阳性小鼠PCR鉴定产物测序，共进行了4个测序反应。测序反应对应的区域，如图7-10所示，Sbjct为目的序列（Cd3e-e(IRES-EGFP)1 Recombinated Genomic DNAsequence），Query为测序结果，可见产物序列与目的序列结果一致。其中，5’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：1#、2#；3’同源臂鉴定，PCR产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：3#、4#。

十一、F1代小鼠尾静脉血流式细胞术观察

F1代野生型、阳性小鼠4、10号流式细胞术检测结果如图11所示。CD3e在F1代野生型中呈现阴性表达（0.00%），而F1阳性小鼠4、10号呈现阳性表达(4号72.97％、10号62.45％)。

十二、将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠动物模型。

十三、F2代纯合子小鼠经颅内原位种植非小细胞肺癌PC-9细胞1x10⁶/ml，100ul，定期观察小鼠体重变化及活动改变，待其出现行走不稳，明显消瘦，进性活体成像，取出肿瘤灶，生物发光可见肿瘤灶内出现明显绿色荧光（红色即为绿色荧光）（图12），提示肿瘤灶内存在CD3⁺T细胞，构建的CD3e转基因小鼠模型可用于示踪肿瘤T淋巴细胞浸润。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省立医院

<120> 示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用

<130> 8

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10161

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 900

gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 960

ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgacgc 1020

tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg 1080

accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag 1140

ctgagcaaga ggtaagggtt taagggatgg ttggttggtg gggtattaat gtttaattac 1200

ctggagcacc tgcctgaaat cacttttttt caggttggac cggtgccacc atggactata 1260

aggaccacga cggagactac aaggatcatg atattgatta caaagacgat gacgataaga 1320

tggccccaaa gaagaagcgg aaggtcggta tccacggagt cccagcagcc gacaagaagt 1380

acagcatcgg cctggacatc ggcaccaact ctgtgggctg ggccgtgatc accgacgagt 1440

acaaggtgcc cagcaagaaa ttcaaggtgc tgggcaacac cgaccggcac agcatcaaga 1500

agaacctgat cggagccctg ctgttcgaca gcggcgaaac agccgaggcc acccggctga 1560

agagaaccgc cagaagaaga tacaccagac ggaagaaccg gatctgctat ctgcaagaga 1620

tcttcagcaa cgagatggcc aaggtggacg acagcttctt ccacagactg gaagagtcct 1680

tcctggtgga agaggataag aagcacgagc ggcaccccat cttcggcaac atcgtggacg 1740

aggtggccta ccacgagaag taccccacca tctaccacct gagaaagaaa ctggtggaca 1800

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ggggccactt cctgatcgag ggcgacctga accccgacaa cagcgacgtg gacaagctgt 1920

tcatccagct ggtgcagacc tacaaccagc tgttcgagga aaaccccatc aacgccagcg 1980

gcgtggacgc caaggccatc ctgtctgcca gactgagcaa gagcagacgg ctggaaaatc 2040

tgatcgccca gctgcccggc gagaagaaga atggcctgtt cggaaacctg attgccctga 2100

gcctgggcct gacccccaac ttcaagagca acttcgacct ggccgaggat gccaaactgc 2160

agctgagcaa ggacacctac gacgacgacc tggacaacct gctggcccag atcggcgacc 2220

agtacgccga cctgtttctg gccgccaaga acctgtccga cgccatcctg ctgagcgaca 2280

tcctgagagt gaacaccgag atcaccaagg cccccctgag cgcctctatg atcaagagat 2340

acgacgagca ccaccaggac ctgaccctgc tgaaagctct cgtgcggcag cagctgcctg 2400

agaagtacaa agagattttc ttcgaccaga gcaagaacgg ctacgccggc tacattgacg 2460

gcggagccag ccaggaagag ttctacaagt tcatcaagcc catcctggaa aagatggacg 2520

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ggcaggaaga tttttaccca ttcctgaagg acaaccggga aaagatcgag aagatcctga 2700

ccttccgcat cccctactac gtgggccctc tggccagggg aaacagcaga ttcgcctgga 2760

tgaccagaaa gagcgaggaa accatcaccc cctggaactt cgaggaagtg gtggacaagg 2820

gcgcttccgc ccagagcttc atcgagcgga tgaccaactt cgataagaac ctgcccaacg 2880

agaaggtgct gcccaagcac agcctgctgt acgagtactt caccgtgtat aacgagctga 2940

ccaaagtgaa atacgtgacc gagggaatga gaaagcccgc cttcctgagc ggcgagcaga 3000

aaaaggccat cgtggacctg ctgttcaaga ccaaccggaa agtgaccgtg aagcagctga 3060

aagaggacta cttcaagaaa atcgagtgct tcgactccgt ggaaatctcc ggcgtggaag 3120

atcggttcaa cgcctccctg ggcacatacc acgatctgct gaaaattatc aaggacaagg 3180

acttcctgga caatgaggaa aacgaggaca ttctggaaga tatcgtgctg accctgacac 3240

tgtttgagga cagagagatg atcgaggaac ggctgaaaac ctatgcccac ctgttcgacg 3300

acaaagtgat gaagcagctg aagcggcgga gatacaccgg ctggggcagg ctgagccgga 3360

agctgatcaa cggcatccgg gacaagcagt ccggcaagac aatcctggat ttcctgaagt 3420

ccgacggctt cgccaacaga aacttcatgc agctgatcca cgacgacagc ctgaccttta 3480

aagaggacat ccagaaagcc caggtgtccg gccagggcga tagcctgcac gagcacattg 3540

ccaatctggc cggcagcccc gccattaaga agggcatcct gcagacagtg aaggtggtgg 3600

acgagctcgt gaaagtgatg ggccggcaca agcccgagaa catcgtgatc gaaatggcca 3660

gagagaacca gaccacccag aagggacaga agaacagccg cgagagaatg aagcggatcg 3720

aagagggcat caaagagctg ggcagccaga tcctgaaaga acaccccgtg gaaaacaccc 3780

agctgcagaa cgagaagctg tacctgtact acctgcagaa tgggcgggat atgtacgtgg 3840

accaggaact ggacatcaac cggctgtccg actacgatgt ggaccatatc gtgcctcaga 3900

gctttctgaa ggacgactcc atcgacaaca aggtgctgac cagaagcgac aagaaccggg 3960

gcaagagcga caacgtgccc tccgaagagg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc 4020

agctgctgaa cgccaagctg attacccaga gaaagttcga caatctgacc aaggccgaga 4080

gaggcggcct gagcgaactg gataaggccg gcttcatcaa gagacagctg gtggaaaccc 4140

ggcagatcac aaagcacgtg gcacagatcc tggactcccg gatgaacact aagtacgacg 4200

agaatgacaa gctgatccgg gaagtgaaag tgatcaccct gaagtccaag ctggtgtccg 4260

atttccggaa ggatttccag ttttacaaag tgcgcgagat caacaactac caccacgccc 4320

acgacgccta cctgaacgcc gtcgtgggaa ccgccctgat caaaaagtac cctaagctgg 4380

aaagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg tgtacgacgt gcggaagatg atcgccaaga 4440

gcgagcagga aatcggcaag gctaccgcca agtacttctt ctacagcaac atcatgaact 4500

ttttcaagac cgagattacc ctggccaacg gcgagatccg gaagcggcct ctgatcgaga 4560

caaacggcga aaccggggag atcgtgtggg ataagggccg ggattttgcc accgtgcgga 4620

aagtgctgag catgccccaa gtgaatatcg tgaaaaagac cgaggtgcag acaggcggct 4680

tcagcaaaga gtctatcctg cccaagagga acagcgataa gctgatcgcc agaaagaagg 4740

actgggaccc taagaagtac ggcggcttcg acagccccac cgtggcctat tctgtgctgg 4800

tggtggccaa agtggaaaag ggcaagtcca agaaactgaa gagtgtgaaa gagctgctgg 4860

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agggctacaa agaagtgaaa aaggacctga tcatcaagct gcctaagtac tccctgttcg 4980

agctggaaaa cggccggaag agaatgctgg cctctgccgg cgaactgcag aagggaaacg 5040

aactggccct gccctccaaa tatgtgaact tcctgtacct ggccagccac tatgagaagc 5100

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acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttctccaa gagagtgatc ctggccgacg 5220

ctaatctgga caaagtgctg tccgcctaca acaagcaccg ggataagccc atcagagagc 5280

aggccgagaa tatcatccac ctgtttaccc tgaccaatct gggagcccct gccgccttca 5340

agtactttga caccaccatc gaccggaaga ggtacaccag caccaaagag gtgctggacg 5400

ccaccctgat ccaccagagc atcaccggcc tgtacgagac acggatcgac ctgtctcagc 5460

tgggaggcga caaaaggccg gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagt 5520

aagaattcct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 5580

tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 5640

ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 5700

tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag aatagcaggc atgctgggga 5760

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gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 5880

cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 5940

tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 6000

catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 6060

gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 6120

gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 6180

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gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 6840

gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 6900

cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 6960

ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 7020

ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 7080

gtaaggatcc gggatgcaga aattgatgat ctattaaaca ataaagatgt ccactaaaat 7140

ggaagttttt cctgtcatac tttgttaaga agggtgagaa cagagtacct acattttgaa 7200

tggaaggatt ggagctacgg gggtgggggt ggggtgggat tagataaatg cctgctcttt 7260

actgaaggct ctttactatt gctttatgat aatgtttcat agttggatat cataatttaa 7320

acaagcaaaa ccaaattaag ggccagctca ttcctcccac tcatgatcta tagatctata 7380

gatctctcgt gggatcattg tttttctctt gattcccact ttgtggttct aagtactgtg 7440

gtttccaaat gtgtcagttt catagcctga agaacgagat cagcagcctc tgttccacat 7500

acacttcatt ctcagtattg ttttgccaag ttctaattcc atcagaagct ggtcgacctg 7560

caggggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 7620

cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 7680

ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 7740

tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 7800

ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg 7860

atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 7920

ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 7980

gctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 8040

tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca attttatggt 8100

gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa 8160

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 8220

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 8280

gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 8340

cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 8400

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 8460

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 8520

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 8580

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 8640

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 8700

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 8760

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 8820

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 8880

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 8940

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 9000

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 9060

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 9120

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 9180

gagccggtga gcgtggaagc cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 9240

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 9300

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 9360

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 9420

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 9480

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 9540

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 9600

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 9660

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 9720

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 9780

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 9840

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 9900

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 9960

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 10020

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 10080

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 10140

gctggccttt tgctcacatg t 10161

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aggaaagggc ttagctatga ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taggaaaggg cttagctatg agg 23

<210> 4

<211> 848

<212> DNA

<213> Exon 8序列

<400> 4

cccatccgca aaggccagcg ggacctgtat tctggcctga atcagagagc agtctgacag 60

ataggagaga catcgccttc tgtggaccca gatccagccc tccgagcacc ctgctactcc 120

ttgttctctg gacagactgc agactccaca gcttgctctt cagcctcctg gtgaacacgt 180

gtcctagaac cttgctctcc tgcctcctct gctagtagcc agtgctggga cattgctgac 240

tcaacagcct ttgaaagaat caggctgctc agattgtctg ccagccacct tgtggggata 300

cttttttcag ccgccctgct gccagctccc cgctgcctca ccagtgtcct ctctgcctca 360

gttcctttcc tctcctaatt ggccctcata gctaagccct ttcctacagc tttctgtttt 420

ttctttttct ttctttttag gttttctttc ttttcttttt tattcctttt tatttaatct 480

ttttttttta aacactccag attttattcc cttcccggcc catcctccga ctgttacaca 540

ccccatacct cctccctgcc cccttgtctc tacgagaatg tcccccaccc ccatccccca 600

cctgctttct ggtttttggt ttttggtttg tttttttttt ttaaactctg tgttttacac 660

tcttctctgg gatggattct gtaatcattg gcacaggtcc tgccccattt atagatcctg 720

gcccagcccc tgccacaggt gcctctccag atttcccctt agatcctcgg atggtcatct 780

ccatctccat gaatacacca gccccctctc tgctaatgca aaaggcaata aagtgtattg 840

gctgggaa 848

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caatcgggtc ttgtagccct t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctcggcggg gtcttgtagc 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccgcgagac aaatgaggtg aag 23

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acaggcccca agatgccg 18

Claims (2)

1.示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

（1） sgRNA的设计和寡核苷酸链合成：根据实验需要设计两个sgRNA，其所在位置在CD3e基因的第8个外显子上，与EcoRI酶切后形成的黏性末端互补；

（2）载体构建：以Cas9质粒为模板，Cas9质粒和sgRNA形成同源重组载体质粒；

（3）F0代小鼠获得：将同源重组载体质粒经受精卵显微注射后获得F0代小鼠；通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的F0代阳性小鼠；

（4）F1代小鼠获得：F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代杂合子小鼠；

（5）将步骤（4）中的雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代，即为小鼠动物模型。

2.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述sgRNA为AGGAAAGGGCTTAGCTATGAGGG和TAGGAAAGGGCTTAGCTATGAGG。

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