CN113621578B - 细胞毒性t细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用 - Google Patents
细胞毒性t细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113621578B CN113621578B CN202110911178.1A CN202110911178A CN113621578B CN 113621578 B CN113621578 B CN 113621578B CN 202110911178 A CN202110911178 A CN 202110911178A CN 113621578 B CN113621578 B CN 113621578B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell
- cytotoxic
- tumor
- homologous recombination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title abstract description 40
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims abstract description 26
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 26
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101150087313 Cd8a gene Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 claims description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 abstract description 32
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 abstract description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 25
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 8
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 abstract description 7
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 abstract description 7
- ULTVSKXCSMDCHR-GGWOSOGESA-N 2-[(1E,3E)-4-[4-(dimethylamino)phenyl]buta-1,3-dienyl]-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound CN(C)c1ccc(\C=C\C=C\C2=NC(CS2)C(O)=O)cc1 ULTVSKXCSMDCHR-GGWOSOGESA-N 0.000 abstract description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 55
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 47
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 11
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 9
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 9
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 7
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 4
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 4
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 208000037966 cold tumor Diseases 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 3
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 3
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000003198 gene knock in Methods 0.000 description 2
- 208000037967 hot tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 239000012275 CTLA-4 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 101710200526 DNA polymerase 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000002454 Nasopharyngeal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 240000002033 Tacca leontopetaloides Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000023077 detection of light stimulus Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 201000011216 nasopharynx carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 1
- 229940055760 yervoy Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
- G01N21/763—Bioluminescence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Mycology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种细胞毒性T细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用,细胞毒性T细胞示踪系统包括同源重组载体、Cas9 mRNA、gRNA、模式生物目的细胞,所述同源重组载体包括重组左臂、核糖体接入位点、第一报告基因、自剪切多肽、第二报告基因、重组右臂,以及基于T细胞示踪系统获得的动物模型。该模型可以实现小鼠内源CD8基因驱动Akaluciferase(Akaluc)荧光素酶和绿色荧光蛋白表达;在活体成像系统下,可通过给予小鼠底物AkaLumine,检测生物发光,实现对CD8分子表达,即细胞毒性T细胞的示踪。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种细胞毒性T细胞示踪系统和动物模型的构建方法及其在T细胞功能及药物药理、药效研发中的应用。
背景技术
细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cell, Tc或CTL),又称为杀手T细胞(Killer Tcell)或CD8+ T细胞,属于T细胞的一种,可以杀死癌细胞、病毒感染的细胞,以及其他原因受损的细胞,其在器官移植的免疫排斥中也发挥作用,该类细胞的特点是细胞表面表达CD8蛋白,因此也被称为CD8+ T细胞。CD8+ T细胞表达的CD8分子通过识别细胞表面的MHC-I分子递呈的短肽抗原,来区分正常细胞和应杀伤的异常细胞。细胞毒性T细胞作为杀伤细胞,在CD8+T细胞免疫应答中起重要作用,其杀伤活性具有直接性、连续性和特异性的特点,在抗肿瘤、抗病毒等免疫过程中发挥重要作用。
在抗肿瘤免疫过程中,细胞毒性T细胞被视为抗肿瘤免疫的主要驱动因素。CD8+肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)通过识别肿瘤抗原和直接杀死转化细胞来介导抗肿瘤反应。肿瘤微环境中的效应性CD8+ T细胞可生成IL-2、IL-12和IFNγ,提高CD8+ T细胞的细胞毒能力,靶向肿瘤细胞杀伤。目前肿瘤免疫治疗中最为成功的免疫检查点抑制剂分子的抗肿瘤作用,都与提高CD8+ T细胞活性相关,如:最早获批上市针对CTLA4靶点的伊匹木单抗(Yervoy)的抗肿瘤作用,是通过增强T细胞的活化、增殖,同时抑制Treg细胞介导的免疫抑制环境,提高CD8+ T细胞活性增强对肿瘤的杀伤作用。另外,肿瘤微环境中的细胞毒性CD8+ T细胞水平高低与病人对免疫检查点抑制剂的响应情况和预后改善密切相关,CD8+ T细胞含量的高低已经成为免疫治疗药物用药伴随诊断的标记物之一。因此,对肿瘤发生、发展过程以及药物治疗过程中CD8+ T细胞的动态变化,对于理解CD8+ T细胞的功能和药物作用机制研究具有重要意义。但目前对CD8+ T细胞含量的检测,主要还是基于抗体反应,如通过免疫组化方法、流式细胞分选方法等,无法直接在活体动物水平对CD8+ T细胞的分布和动态变化进行实时跟踪。
当前的动物活体成像技术是指应用影像学方法,对活体状态下的生物过程进行组织、细胞和分子水平的定性和定量研究的技术。其中的生物发光成像 (Bioluminescenceimaging,BLi)基于酶(荧光素酶)催化底物(荧光素)的氧化反应所产生的光的检测来反映标记的目的分子或者细胞的表达,常用的荧光素酶和底物为萤火虫荧光素酶(FireflyLuciferase,Fluc)和天然底物D-荧光素(Luciferin)。2018年日本的Atsushi Miyawaki实验室报道了一个通过定向进化获得的荧光素酶生物发光成像系统(AkaBLI):Akaluciferase(荧光素酶)和AkaLumine(底物),该系统体内荧光亮度约为传统的Fluc和Luciferin系统的100-1000倍,具有更好的组织穿透性和灵敏度。
综上所述,细胞毒性T细胞在抗肿瘤、抗病毒等T细胞免疫应答过程中发挥重要作用,当前的方法和手段无法在活体状态下,对其在体内的动态变化进行跟踪,限制了对细胞毒性T细胞体内功能和相关药物作用机制的研究。如能通过活体成像系统对细胞毒性T细胞示踪,则有可能解决上述问题。
本发明研发及申请过程中,发明人对已有相关动物模型及示踪方法进行了比对,本发明在方法和应用方便较已有专利具有明显的优越性,具体描述如下:1)徐州医科大学申请的CN111500628A描述了一种CD8定点基因敲入2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠模型,该模型利用CD8内源基因启动子驱动CreERT2的表达,CreERT2是一个Cre重组酶本身不具有示踪性,需要和其他报告基因小鼠交配后在给予小鼠他莫昔芬药物后才可能实现对细胞的示踪性,而且因为细胞毒性T细胞在体内处于不断的分化、更新替代过程中,如要通过CD8- 2A-CreERT2-Wpre-pA小鼠和其他报告基因小鼠交配后给予小鼠他莫昔芬药物实现对细胞毒性T细胞的示踪,需要不间断给予他莫昔芬药物,而本发明的Cd8a-Akaluci小鼠既不需要和其他报告基因小鼠交配,也不需要给予药物刺激,就可以实时对细胞毒性T细胞进行示踪;2)华东师范大学申请的CN110747227A描述了一种蓝光照射PA-Cre转基因小鼠,同上类似,Cre重组酶本身不具有示踪性,该专利中申请人通过给药小鼠报告病毒的方式,对示踪性进行了验证,相较于本申请,其示踪一方面需要通过蓝光照射激活,一方面细胞毒性T细胞处于动态变化中,长期示踪需要不间断进行蓝光激活,更重要的是AAV病毒本身在体内能否感染细胞毒性T细胞、感染效率等未知,具有很大的不确定;3)SLOAN KETTERING INST CANCER申请的WO2004033640A2描述了利用特异性启动子驱动Luciferase表达制备转基因小鼠进行体内示踪的方法,本申请相较于该申请具有明显的优势,本申请采用定点敲入的方式制备,Akaluciferase的表达完全受Cd8a内源启动子的驱动具有更好的准确性,同时避免了常规转基因方式需要对多个founder鼠进行筛选建系的弊端;4)INSTITUTE FOR MEDICALRESEARCH申请的WO2020017948A1方法描述了一种利用病人鼻咽癌组织进行细胞建系,通过慢病毒感染,使肿瘤细胞表达GFP和Luciferase进行示踪和药物筛选的方法,该方法仅能对肿瘤细胞进行示踪,无法对肿瘤接种宿主自身的细胞如免疫细胞进行示踪,和本发明是截然不同的示踪方向。综上比对的各种方法,虽然可用于体内示踪,但和本发明功能及示踪对象完全不同,无法用于对细胞毒性T细胞的示踪。
发明内容
本发明的目的在于提供一种构建细胞毒性T细胞的小鼠模型的构建方法及其在体内抗肿瘤研究和药物研发中的应用。本发明所采用的构建载体及方法相较于已有模型具有明显的优越性;在具体实施中,本发明构建的动物模型,成功对正常生理状态下、肿瘤生长状态下,体内细胞毒性T细胞的动态变化进行了示踪,对抗肿瘤药物的作用机制进行了分析,这是已有模型无法实现的。
本发明涉及一种T细胞示踪系统,包括同源重组载体、Cas9mRNA、gRNA、模式生物目的细胞,所述同源重组载体包括重组左臂、核糖体接入位点、第一报告基因、自剪切多肽、第二报告基因、重组右臂。并可以进一步在重组左臂和核糖体接入位点之间添加蛋白标签,所述蛋白标签可以为V5 tag,也可以为Myc、His、GST、HA、Flag、MBP、Avi Tag、SUMO tag等,其目的在于增加一个可识别表达小鼠Cd8分子细胞的标记物,通过识别V5 tag的抗体,可以将示踪后的动物器官进行摘除并进行免疫学检测,如流式细胞术检测、ELISA检测、免疫组化、免疫荧光、免疫共沉淀等,用于对标记细胞进行定性和定量检测,评估示踪效果等。所述第一报告基因可以为荧光素酶Luciferase,所述第二报告基因可以为绿色荧光蛋白EGFP,所述自剪切多肽可以为2A,包括但不限于P2A、T2A、F2A中的一种;对于报告基因,在实际运用中,可采用其他报告基因,只要能够实现发光检测位置功能即可,并不局限于具体实施使用的基因。上述元件片段,通过基因工程方法获得,包括但不限于PCR扩增、基因合成等,共同导入基因工程载体中获得同源重组载体。基因工程表达载体包括但不限于质粒表达载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体、EB病毒载体、或单纯疱疹病毒载体。
进一步的,本发明还涉及一种动物模型构建方法,在插入位点附近设计并合成识别靶位点的gRNA,将前述同源重组载体、Cas9 mRNA和前述的gRNA混合,导入动物模型的细胞,从而通过gRNA的引导,将前述同源重组载体插入动物模型的Cd8a基因终止密码子的C端。导入的方式包括显微注射、共转染等,动物模型包括但不限于小鼠、大鼠、兔、猪等哺乳类动物,优选小鼠;所述细胞为具有能发育成完整生物体的全能性体细胞,优选受精卵。
本发明进一步提供了前述的同源重组载体以及动物模型在细胞示踪中的用途。所述细胞为细胞毒性T细胞。具体方法为:给予动物模型发光底物,在活体成像系统下,检测生物发光的状态,采集影像学进行分析。
本发明进一步提供了一种T细胞示踪方法,采用前述同源重组载体,导入动物模型中,检测生物发光。进一步的,利用T细胞示踪方法,可用于药物机理研究、药物效果研究、CTL细胞分布研究等。
本发明的有益效果
本发明利用CD8分子是细胞毒性T细胞的标记分子这一特性,通过将高灵敏度的Akaluciferase荧光素酶和绿色荧光蛋白定点插入到CD8分子基因表达框,构建Cd8a-V5-IRES-Akaluc-EGFP(简称:Cd8a-Akaluci)基因修饰小鼠模型,该模型可以实现小鼠内源Cd8基因驱动Akaluciferase(Akaluc)荧光素酶和绿色荧光蛋白表达;在活体成像系统下,可通过给予小鼠底物AkaLumine,检测生物发光,实现对Cd8分子表达,即细胞毒性T细胞的示踪。利用该模型,发明人对正常生理状态下和肿瘤接种状态下,细胞毒性T细胞在体内的组织分布进行了研究;并且通过给予荷瘤小鼠免疫检查点抗体药物,对药物的作用机制进行了验证,说明该模型可以应用于对细胞毒性T细胞的示踪和药物药效作用机制的分析。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或现有方法和实验中的技术方案,下面将对实施例中所需使用的附图做简单的介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1:小鼠Cd8a基因结构和Cd8a-Akaluci基因修饰后的Cd8a基因结构。
图2:gRNA活性T7核酸内切酶I酶切检测电泳图,数字为对应的gRNA;Con为对照;M为DNA marker。
图3: Cd8a-Akaluci小鼠构建策略示意图及鉴定结果,图3中的A图为Cd8a-Akaluci小鼠构建策略示意图;P1,P2,P3,P4为重组PCR鉴定引物位置示意;图3中的B图为F0代小鼠左臂同源重组PCR鉴定电泳图;图3中的C图为F0代小鼠右臂同源重组PCR鉴定电泳图;数字为小鼠编号:wt为野生型对照;M为1kb DNA marker。
图4:正常生理状态下,Cd8a-Akaluci小鼠荧光及V5 tag表达检测,图4中的A图为小鼠整体荧光检测结果;图4中的B图为小鼠解剖组织荧光检测结果;图4中的C图为流式细胞术检测Cd8a阳性细胞EGFP荧光表达结果;图4中的D图为流式细胞术检测Cd8a阳性细胞中V5 tag表达结果。
图5:不同类型肿瘤接种Cd8a-Akaluci小鼠,细胞毒性T细胞在肿瘤中的浸润情况检测,图5中的A图为肿瘤接种不同时间点,活体成像检测Akaluci表达情况,框内为肿瘤所在部位;图5中的B图为MC38和B16两种类型肿瘤细胞接种后的生长曲线;图5中的C图为MC38和B16两种类型肿瘤细胞接种后不同时间点肿瘤部位的荧光信号值。
图6:MC38肿瘤接种Cd8a-Akaluci小鼠后,给予CTLA4抗体治疗,不同时间点Akaluci荧光检测结果,图6中的A图为给予CTLA4抗体治疗和荧光检测时间点示意图;图6中的B图为对照组和给药组肿瘤生长曲线;图6中的C图为不同时间点荧光表达检测结果;图6中的D图为不同时间点对照组和给药组单位肿瘤体积荧光强度统计结果。
具体实施方式
实施例一
Cd8a-Akaluci小鼠模型构建
为了避免破坏小鼠内源Cd8a的表达,Cd8a-Akaluci小鼠模型的构建设计策略为将V5 tag-IRES-Akaluciferase-2A-EGFP插入到小鼠Cd8a基因终止密码子前野生型Cd8a基因结构和Cd8a-Akaluci基因修饰后基因结构如图1所示。
1)gRNA靶位点筛选
gRNA靶序列决定了其靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。Cas9切割目的基因的效率越高,发生同源重组的效率就越高。因此,高效特异的靶序列选择和设计是成功构建Cd8a-Akaluci小鼠模型的前提。
根据重组方案,在插入位点附近设计并合成识别靶位点1-10(SEQ ID NO:1-10)的gRNA(gRNA1-gRNA10)。使用T7核酸内切酶 I检测试剂盒检测,从酶切后凝胶电泳结果可见不同的gRNA活性不同,检测结果参见图2所示。从中优先选择靶向位点6的gRNA6为后续小鼠受精卵注射实验的gRNA。
2)同源重组载体构建
根据获得的gRNA位点及插入位点信息,构建同源重组载体,载体结构如策略图3所示,从左到右结构依次为:重组左臂、V5标签蛋白、核糖体接入位点(IRES)、荧光素酶(Akaluciferase)、自剪切多肽P2A、绿色荧光蛋白(EGFP)和重组右臂,序列依次为SEQ IDNO:11-17。重组左臂和重组右臂,通过以小鼠基因组为模板,PCR扩增获得,其余片段通过全基因合成获得。构建过程中,先通过PCR获得重组左臂、基因敲入片段(V5 tag-IRES-Akaluciferase-2A-EGFP)和重组右臂,利用In-Fusion的方法将3个DNA片段连入PBR322载体,获得最终的PBR322-Cd8a-Akaluci重组载体。载体经酶切及测序验证正确后,进行后续的小鼠制备。
3)Cd8a-Akaluci基因敲入小鼠构建
取C57BL/6小鼠的受精卵,按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将PBR322--Cd8a-Akaluci重组载体、Cas9 mRNA和gRNA混合后,进行受精卵显微注射,注射后的受精卵经培养箱短暂培养后,移植至受体母鼠的输卵管,获得基因修饰小鼠F0代小鼠。共出生11只F0代小鼠,F0代剪尾抽提基因组,分别针对同源重组左臂(引物P1和P2)和同源重组右臂(引物P3和P4)设计引物,对是否发生正确同源重组进行鉴定,引物位置示意如图3中的A图的P1-P4所示。F0代小鼠左臂和右臂同源重组PCR鉴定的条件如下。
引物信息如下:
引物名称 | 序列信息(5’→3’) |
P1 | ATGCCTGCACCCAAGATTCACC(SEQ ID NO: 18) |
P2 | GGGCGCAACTGCAACTCCGATAAA(SEQ ID NO: 19) |
P3 | TCATGGGCCGACAAGCAGAAGAACG(SEQ ID NO: 20) |
P4 | ACTGGGGGCAAGAAATGGGGAACA(SEQ ID NO: 21) |
引物对P1/P2,P3/P4的PCR反应体系相同,具体如下:
PCR反应组成 | 体积 (µl) |
ddH2O | 31 |
PCR Buffer | 10 |
2.5 mM dNTP | 4 |
引物1(20pmol/µl) | 1 |
引物2(20pmol/µl) | 1 |
DNA Polymerase | 2 |
genomic DNA | 1 |
总计 | 50 |
引物对P1/P2,P3/P4的PCR反应程序相同,具体如下:
步骤 | 温度(℃) | 时间 | 备注 |
1 | 98 | 2 min | |
2 | 98 | 15 sec | |
3 | 63 | 15 sec | |
4 | 68 | 4 min | 重复步骤2-4共34个循环 |
5 | 68 | 5 min | |
6 | 12 | 10 min |
F0代小鼠左臂和右臂同源重组PCR鉴定的电泳结果如图3中的B(左臂重组)和C(右臂重组)图所示。左臂发生正确重组的小鼠,引物对P1/P2可以扩增出5.5kb大小的PCR产物,阴性小鼠无PCR产物扩增出;右臂发生正确重组的小鼠引物对P3/P4可以扩增出5.1kb大小的PCR产物,阴性小鼠无PCR产物扩增出。PCR鉴定阳性小鼠的PCR产物送测序进一步确认是否正确。根据PCR和测序鉴定结果,F0代11只小鼠中3,5,7,9,10号小鼠为双臂同源重组阳性小鼠,阳性率为:45.5%,说明该方法为一种高效获得Cd8a基因位点同源重组模型的制备方法。
阳性F0代小鼠成年后与野生型C57BL/6小鼠交配,获得F1代小鼠。F1代小鼠出生后,剪尾抽提基因组,采用和F0代小鼠重组鉴定相同的条件,分别针对同源重组左臂和右臂进行鉴定,验证F0代小鼠是否可以稳定遗传到F1代小鼠。对获得的阳性F1代小鼠进行后续的实验验证。
实施例二
正常生理状态下细胞毒性T细胞小鼠体内位置示踪
根据以前的研究报道,CD8+ T细胞和其他类的T细胞一样起源于骨髓,在胸腺内成熟,成熟后在随着淋巴循环到达全身各处,相当一部分CD8储存于脾脏和淋巴结等免疫器官内。为了验证构建的Cd8a-Akaluci小鼠是否能够反映正常状态下细胞毒性T细胞在小鼠体内的分布,发明人利用珀金埃尔默公司的IVIS Spectrum 设备对体内和离体组织的Akaluciferase表达进行了检测,在测量前3分钟通过腹腔注射给予小鼠5 mM 底物Akalumine-HCl底物,在发射光谱677nm 处测量,曝光时间为 30s,分别对不同体位的小鼠进行成像,检测结果如图4中的A图所示,小鼠胸腺、脾脏和腹腔(肠系膜淋巴结丰富的区域)有较强的荧光信号;为了进一步验证荧光表达的组织类型,将小鼠解剖后,取胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结进行荧光表达的确认,结果如图4中的B图所示,胸腺、脾脏和肠系膜淋巴结均可以检测到较强的荧光信号,说明体内检测观察到的荧光信号确实源自这些组织。Cd8a-Akaluci小鼠构建过程中,根据设计策略表达Akaluciferase的同时,还表达EGFP荧光蛋白,发明人通过流式细胞术对脾脏和淋巴结CD8+ T细胞EGFP荧光表达情况进行了检测。流式细胞术检测结果如图4中的C图所示,在淋巴结中,95%的CD8+ T细胞可以检测到EGFP荧光表达;在脾脏中,82%的CD8+ T细胞可以检测到EGFP荧光表达。这些结果表明,在正常生理状态下,Akaluciferase荧光的表达与预期细胞毒性T细胞的所在位置一致,Cd8a-Akaluci小鼠可以用于细胞毒性T细胞的示踪研究。根据Cd8a-Akaluci小鼠构建策略,在Cd8a分子的C端融合了一个V5 tag,阳性小鼠中表达的Cd8a蛋白C端应同时融合有V5 tag,V5 tag的抗体作为检测Cd8a表达的另外一个标记分子标记Cd8a阳性细胞,通过流式细胞术,利用分别针对Cd8a分子APC标记的抗体和针对V5 tag PE标记的抗体对外周血中Cd8a阳性细胞进行了检测,检测结果(图4中的D图所示)显示,野生型小鼠中只能检测到针对Cd8a分子的信号,Cd8a-Akaluci小鼠既可以检测到针对Cd8a分子的信号,也可以检测到针对V5 tag抗体的信号,说明V5 tag确实和Cd8a分子融合表达,其可以作为检测Cd8a阳性细胞的另外一个标记分子,用于后续的检测。
实施例三
肿瘤生长过程中细胞毒性T细胞在肿瘤中的浸润情况示踪
在肿瘤免疫治疗中,研究人员发现不同肿瘤组织中的浸润淋巴细胞(TILs)数量有很大不同,肿瘤组织中有大量TILs浸润的患者,往往对治疗反应敏感,生存时间长,伴有较好的预后;而肿瘤组织中没有TILs的患者,对治疗反应差,存活期也很短,预后很差。研究者将有广泛TILs浸润的肿瘤称为热性肿瘤(hot tumor),仅有少量甚至没有TILs浸润的肿瘤称为冷性肿瘤(cold tumor)。小鼠结肠癌肿瘤细胞系MC38被认为是一种“hot tumor”,而小鼠黑色素瘤细胞系B16则被认为是一种“cold tumor”。为了验证Cd8a-Akaluci小鼠是否能够用于示踪细胞毒性T细胞在不同肿瘤组织中的浸润情况,用于甄别肿瘤类型,发明人分别将MC38细胞系和B16细胞系接种于Cd8a-Akaluci小鼠皮下,在不同时间点通过活体成像系统检测肿瘤组织的荧光信号,检测结果如图5中的A图所示。活体成像检测结果显示:B16细胞系形成的肿瘤,在肿瘤生长过程中,几乎检测不到明显的荧光信号,说明仅有少量甚至没有TILs浸润,B16形成的肿瘤为冷性肿瘤;MC38细胞系形成的肿瘤,肿瘤生长过程中,荧光信号随着肿瘤体积的增大,信号逐渐增强,说明有大量的TILs浸润,MC38细胞形成的肿瘤为热性肿瘤。对活体成像信号进行定量分析结果(图5中的B图)与成像显示的结果相一致,B16细胞系形成肿瘤的信号值在肿瘤生长过程中几乎没有变化,MC38细胞系形成肿瘤的信号值随着肿瘤的生长,信号不断增强。
与该结果相对比的是,B16细胞形成的肿瘤具有更快的生长速度(图5中的C图)。如上结果显示,Cd8a-Akaluci小鼠可用于对肿瘤生长过程中的细胞毒性T细胞对肿瘤浸润的示踪作用,通过荧光值可以反映肿瘤的免疫类型是热性肿瘤还是冷性肿瘤。
实施例四
细胞毒性T细胞示踪在抗肿瘤药物作用机制研究中的应用
肿瘤免疫治疗中,抗CTLA4抗体是第一个获批上市的免疫检查点抑制剂分子,已有的研究机制表明:其可以活化淋巴组织T细胞,促进更多细胞毒性T细胞浸润到肿瘤组织中,对肿瘤进行杀伤作用。为了验证Cd8a-Akaluci细胞毒性T细胞示踪小鼠是否可用于抗CTLA4抗体的肿瘤治疗作用机制研究,发明人通过在Cd8a-Akaluci小鼠上接种MC38肿瘤细胞,然后给予抗CTLA4抗体治疗,对不同时间点细胞毒性T细胞的肿瘤浸润进行了研究。肿瘤接种、给药和进行活体成像检测的时间点如图6中的A图所示。每只Cd8a-Akaluci小鼠皮下接种1x106的MC38肿瘤细胞,待肿瘤生长到约80-120mm3时,随机分为两组(每组5只小鼠),一组给予生理盐水,一组给予抗CTLA4抗体,分别在肿瘤接种后第6天,第12天和第15天分别给予生理盐水和抗体药物,在第7天,第13天和第16天进行活体成像检测。肿瘤生长曲线检测显示,给予抗CTLA4抗体后,肿瘤接种第13天即显示出显著的MC38肿瘤生长抑制效果(图6中的B图)。对肿瘤接种不同时间点活体成像检测结果(图6中的C图)显示:相较于给生理盐水组,给抗CTLA4抗体组小鼠肿瘤部位自接种肿瘤10天起即可见增强的荧光信号;通过将活体成像信号与肿瘤体积相比较,计算单位体积的荧光信号强度(图6中的D图),随着给药次数的增加和时间的延长,给药组小鼠单位体积肿瘤的信号强度不断增强,在实验终点(接种肿瘤16天)时,给药组荧光信号强度是生理盐水组的5.08倍,显示给予抗CTLA4抗体显著增强了肿瘤内细胞毒性T细胞的浸润能力,更多的细胞毒性T细胞浸润到肿瘤内,发挥抗肿瘤作用,与研究报道的CTLA4抑制剂作用机制相吻合。因此,Cd8a-Akaluci细胞毒性T细胞示踪小鼠模型可用于抗肿瘤药物的药理、药效等肿瘤治疗作用机制研究。
综上所述,发明人提供了一种构建细胞毒性T细胞示踪小鼠模型的构建方法,利用筛选到的高活性gRNA靶位点,基于CRISPR/Cas9系统介导的同源重组构建Cd8a-Akaluci小鼠模型;发明人基于该模型,对细胞毒性T细胞在正常生理状态下体内的分布,细胞毒性T细胞对不同肿瘤的浸润情况以及抗CTLA4抗体抗肿瘤的作用机制进行研究应用,提供了利用该模型进行T细胞功能及药物药理、药效研发中的应用场景。
序列表
<110> 上海南方模式生物科技股份有限公司
上海砥石生物科技有限公司
广东南模生物科技有限公司
<120> 细胞毒性T细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgtgtaaaa tggcaccgcc agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtagtagt tgtagcttcc tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagagatctc ttcttgcaag agg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacttgaaa aaggagggcc tgg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atctcttctt gcaagaggcc agg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tagtagttgt agcttcctgg cgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agggcaatac ataagacagc agg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcatacttgt atgcatacaa tgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catacttgta tgcatacaat ggg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccctactaaa acaatacaga ggg 23
<210> 11
<211> 3583
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctcactctg agttcccagg cccctaaaag gtggttgaca ctctttggtg gggactttgg 60
gtgacatcat atcctcacat aggaaatcag ctctgtctgc agctggctaa aggagcagtt 120
tccccgaccc tacacgcctc ccccaccgca cctcctccgc cctgttcctg ggcccctccc 180
ctagagccct agcttgacct aagctgcttg ctggtggaga gcacaccatg gcctcaccgt 240
tgacccgctt tctgtcgctg aacctgctgc tgctgggtga gtcgattatc ctggggagtg 300
gagaagctaa gccacaggca cccgaactcc gaatctttcc aaagaaaatg gacgccgaac 360
ttggtcagaa ggtggacctg gtatgtgaag tgttggggtc cgtttcgcaa ggatgctctt 420
ggctcttcca gaactccagc tccaaactcc cccagcccac cttcgttgtc tatatggctt 480
catcccacaa caagataacg tgggacgaga agctgaattc gtcgaaactg ttttctgcca 540
tgagggacac gaataataag tacgttctca ccctgaacaa gttcagcaag gaaaacgaag 600
gctactattt ctgctcagtc atcagcaact cggtgatgta cttcagttct gtcgtgccag 660
tccttcagaa aggtttggaa gtggaggttc ccgtctcctg ggttttaggg gtcacatctg 720
aacaagtttc acgcagattc cctcttctta aatctcttgg ggcctcttgg aggtgatttc 780
tatactgtcc ccattttaca gaccaaaaag ttgaggctga ggtgctgggt gggattggaa 840
gtgattttta aacgccctgg atctgggctg gagtctggat gcacgtgtga tcctgcccct 900
gttggctcca ggatagaatt ttggtattga ctccagcttt gggttggtgg agggccgcag 960
tcgcttagct gctggatctg atctaggcac attggcccca aatcacactt ggctccgcgt 1020
gtgcgagcag cggagtagcc cagcacgtat ccaggggttc cttcttcctc tagttaaaag 1080
ctaggaaacg gctccttctt gggtaaaggc taagtggaaa ggggctggtg catccacaat 1140
tccagcttga cccgcaggca ccctattgct tttgcagtga actctactac taccaagcca 1200
gtgctgcgaa ctccctcacc tgtgcaccct accgggacat ctcagcccca gagaccagaa 1260
gattgtcggc cccgtggctc aggttaggtg ctctcaagcg attgagataa gcagatagcc 1320
tggggtggaa aatcctgatc ttggagggag acctggaccg ggagacgtgc tgggggcagg 1380
gttgggggct gtcccagagg gtttctaaat tccattcatt cggatcttgt cagtgaaggg 1440
gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca cccttggccg gaatctgcgt 1500
ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac cacagtaagt tctggggagt 1560
tccccccatc cagcccccca cccacccccc caccccaccc ccgccaagag actgctttgt 1620
gctccaggag gagtctgcac tttgtgcctg ctccagacag cccttcaggg agattacttt 1680
taggttgggg aaaaggggga gggcgttcca gctgacctat aggaccagtg tagtgggttc 1740
tttcttgaag gcaggagaca ggtataccac cccactgctc tttccaccct ctgggaactt 1800
ttcagaacag agccctgttc caggatcccc aagagcagcc aaatcagcag ttagcacagc 1860
caggataact taagcacact aaggaggggt ttacatagcc ctgagaccag ggcccaagaa 1920
ggctgagtca caaccatgac tggcttgaga tttgccttaa tcccacctca caaaccattc 1980
actcctctga gtctatacag gtgattacac caaccaggtc aacagattcc cagagacact 2040
cacatctgca tttacaatgc ctctcccttc ccaagaaagg gtttcctttc atgttgtcta 2100
gactatccta caactagtta ggtagcctag gataacccca aacttctgat ctgatccttc 2160
tgccttcctt cattttggga gtgctgggac aacgggcata ggccaccaaa ccaaatttaa 2220
aatgttttct tttattatgt atttatgcat ttatttattt gggttttttt taaaggcagg 2280
gtttctctgt gtagccctgg ctgtcctgga actcactctg tagaccaggc tggcctcaaa 2340
ctcagaaatc cgcctgcctc tgccttccaa gtgctgggat taaaggcgtg ggtgaccaca 2400
gcctggctga aatgttttat ttttaattgg aacttgagga aagagtaggc aaagtagtgt 2460
tcactccaag tctgaagagt tctgagactc aaagttctgg agcagaggaa gctatagaaa 2520
cggtatctgg caggtattca ttctcccttc ttccttgtct agggagccga aagcgtgttt 2580
gcaaatgtcc caggtgagta acgtctctga tctgtaggtc tgctcacgct gggcagccgt 2640
ggtcccagtg gtgaggtttg ggaatctttc ctagagagag aggtcatgcc agtgaagtcc 2700
tggtggcagg ggaccaggag tcagccagat cctgaactag gagaagcaga aagctggtga 2760
ggtgctggaa ttcattcctg agaaaaggaa ggaccacaga cgtgctcagt gggacagcag 2820
caggactgag ttgcagggga ctagctgaac gaggaaaggt gttcagtatt ttcaggacct 2880
ggagtgagct tggtagcttc tgcaagacaa ttacttatgc ttactttttc tgaatactct 2940
cattttgaaa tgtaaaatag aaaagcccgt ccttgcacta aaccccggag ctatgcaaat 3000
tagttcccta gacagtcaca ggtccaagtc tcagcctaaa ggcagagggt ttctacaggg 3060
ccactcaggt ctctcacttt tcgtgtgaca ttaagctcag cactgtgctt ggttgagggt 3120
gcacctcaca ctcttctgga ttctcagttt tgggctactg ggataagagt caggccaccc 3180
gctgacttaa aacaaccagc ttctaatctc accctcctgg gactcaggaa ggttccagga 3240
agcctaactg ggcatagatg ctacttcagc tgcctaagag ttgtgtgacc tgaggcaggg 3300
tctttaaact ctcctgagca gtgcagaccc ctctttgggt gccttgagga cgaaaggaaa 3360
gggtggctga ggtaattcat tcattaatgt ctaaggacaa attctcaaag ccatcaaaaa 3420
ctgagtgtgt gtgtgtgcgc gcgcgcgtgc gcgcgcgctc gcgtgctggt actactttaa 3480
agaggttcta gccacaatga tagttgatct cttgtgtatc tttgtctctt tcaggccgct 3540
agtcagacag gaaggcaagc ccagaccttc agagaaaatt gtg 3583
<210> 12
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcaagccca tccccaaccc cctgctgggc ctggacagca cctaa 45
<210> 13
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatatgg ccacaacc 588
<210> 14
<211> 1650
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atggaagacg ccaaaaacat aaagaaaggc ccggcgccat tctatccgct ggaagatgga 60
accgctggag agcaactgca taaggctatg aagagatacg ccctggttcc tggagccatt 120
gcttttacag atgcacatat ccaggtggac gtgacttacg ctgagtactt cgaaatgtcc 180
gttcggttgg cagaagctat gcgccgatat gggctgaata caaatcacag aatcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctagcca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggagtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgggcatt 360
tcgcagccta ccgtggtgtt cgtttccaaa aaggggttgc gcaaagtgtt gaacgtgcaa 420
aaaaagctcc caatcatccg caaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccaggga 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccagctttaa tgaatacgat 540
tttgtgccag agtccttcga tagggacaag acaattgcac tgatcatgaa ctcctctgga 600
tctactggtc tgcctaaagg tgtcgctctg cctcatagaa ctgcctgcgt gagattctcg 660
catgccagag atcctatttt tggctaccaa aacattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggaatgttt actacactcg gatatttgat atgtggattt 780
cgagtcgtct taatgtatag atttgaagaa gagctgtttc tgaggagcct tcaggattac 840
aagattcaaa gtgcgctgct ggtgccaacc ctattctcct gcctggccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc tagcttacgc gaaattgctt ctggtggcgc tcccctctct 960
aaggaagtcg gggaagcggt tgccaagagg ttccgcctgc caggtatcag gcaaggatat 1020
gggctcactg agactacaaa cgctgtgatg attacacccg agggggatcg caaaccgggc 1080
agcgtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctggt gaccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcaaag aggcgaactg tgtgtgagag gtcctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggatg gctacattct 1260
ggagacatag cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cctgaagtct 1320
ctgattaagt acaaaggcta tcaggtggct cccgctgaat tggaaggcat cttgctccaa 1380
cacccctaca tcttcgacgc aggtgtcgca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacgga aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gaggagttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccgc gcggtagcac cggaaaactc gacgcaagaa aaatcagaga gatcctcacc 1620
aaggccaaga aggacggaaa gatcgccgtg 1650
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gcgacgtgga ggagaaccct 60
ggtcct 66
<210> 16
<211> 767
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
caagaagcaa aaacacaaaa agactgagtt agcagaaaga gaagcgc 767
<210> 17
<211> 3385
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catgacttca gagatctctt cttgcaagag gccaggccct cctttttcaa gtttcctgct 60
gtcttatgta ttgccctctg tattgtttta gtaggggtgt gatggggaca gttccttttt 120
ctttatgaat tctctttgac acaaagcata cttgtatgca tacaatggga gtaatgagca 180
gactgtaaca ccagagctag ttccagtttc ggggtccatg tcgctggtgg cctcagcacc 240
cacttgatat aaatctcctg tctgcccatc atatagaaga agctgaagat cagaggtgga 300
aacagcagga tctgtagacc cggagagaac ccaagctaga ggaaccctca ctgactggtg 360
cagggatctc acccccatcc cctgagctct ctgtttaggt atgtgtcttt agtatagcat 420
gcttgtgcct caaactgcaa ggaagcaagt ggtatgaatc tgtgatctgc tcagctctgg 480
ctgtgagcat cagatgtaac aaatcaaagt caggagaact gcctttagcg gtgcacctgg 540
acatcagagc cccttgtaag aactgggaaa ttgctggcag tctagtggag cggtacggta 600
aatctggaaa acactcccct ctgtcactga aggctgtagt agaatccaat taaagctatt 660
caaaccactg ccgcagaccc tctgggtccc tgtgtctgcg tggaatgggt ctctcgagca 720
ggtgggcaaa gcgtaggatt aaactgacaa acagatgcac acaggagagg cgttgaatct 780
gaatgtaatg tcaggtcgaa cctcggactt tttataatac agaaaaaatt ccaggggcga 840
tatgtcacac cagacaaggt acactgaaat ttaccagata caagagaatg acttcgaaag 900
gaatttgcag gaactagata aatgtttaca atagagatta tcagccctgc ctaggatcat 960
cagcctagtg ccaggtaaga atttcacact ttagtgttaa aagcaccagg gggtaattac 1020
tcttggcagg cctcaagaat aatgtagtgt cacggacccc taaattccta ggccttgtta 1080
aatcttatct tgtctggaga atccccattt atcaggagag tatctcaact tgctcttggc 1140
atggaatgta gcctgtacta aagattttta tctcagtgag attcccaggc tctttctgca 1200
gaccagatga gctaatggcc ttgtttattg taatgcttaa ttagttactg aataggttaa 1260
actccttgct gttatctggg atcttggaac aatgggggcg ctgggggggg gggcgggggg 1320
gctttagcta tgtcagaatt caatcttaaa aggcacttac aatagggtaa tgcttaatag 1380
agggcacatg gatccataca ctagactaac gcgggagtgg aaaattaatt tatggtttag 1440
agggaacgcc agactccagg agggaatttc tgtgaaactc ttttccttgt gggcagcttc 1500
caagcttccg cttgtcaaac tgacccaact ggagagcgtg gctttcacca gactccagga 1560
gggagctttc gtgaaactct tcctcatgag atagcttcca agctttcgcc tgtcaagctg 1620
actccaccag agtgcgtggc aaaccaccac tgtgaaattc ctgtagaatt atgattctct 1680
ctgctcttgg acagcagagg gtgaggtttg acagatacga ctcaggcatc agagaagctg 1740
caggcaggcc ctctcccatg tctaaacatg agacttggat gtgctcctgg gatcaccagc 1800
atgctttata ctctataaac atagaatcct tggagaacat tccttagcac ccccggaagg 1860
cagatgtaaa gaggcagact agacgtggag gaagacgctg actgtcaaaa ctgctgcccc 1920
agagctaatt tcctctcaca gtaccatata agtaacaaat aataggcaat aaaaacctga 1980
aggaactaag agtcacccat ggtcctctat ctattgttac tatcatttta tacctgatta 2040
tttcctatgc atatatatgt aagaaagatt acaccctggg ttttaaaaca caacagtttt 2100
tgtaagcaga tttagtaaat aaacatgtat attatcattt aatggttaaa tagcatttca 2160
tagtttggtt gtatccattt agtattaaat tgtttcaaac ttccccctac tattacacta 2220
ctaaacttgc acaaatctct ggatttttat tttgtttttt tcatttgttt ttgttgttca 2280
agaaagggtc tcatgtacag ggtagacttg agttccctgt gtagccaaag atgaccttgg 2340
atatatgacc tctctggcac cacctctgag tgttgggatt cgggggcagt gccgctatgc 2400
cctgtttatg tgccgctgtg tgtggctgta ggtgattaac ctctcaaata ttcatgtcag 2460
tggcagctcg agttcctccc tacctgcccc agtgttctgg attcccgaat gaaagatgag 2520
tatgcacaca cacacacaca cacacacaca cagagcctta tatttaatat gccttaatca 2580
gctcaatggt tgggccactc ccaaacttca cattactaac acctcccctc tgatattcct 2640
gaattattac ttactaaaat ctatattcca tctttgctac tctagaccca gtgtgggtga 2700
ggcaattcct agctcttaga tgattggcat gttctctact ctgcagccct caagcctaga 2760
tcttattccc ttcctggcat ggtattcttc ttttctccct ggtccccttg cccttgagtc 2820
ctaaagtcct gcctctgttc tctctctttc tctctgccca gccattggct actggcaact 2880
ttatttaaca atcaaaacca accaagggca gggaccctca gtgtcttaca catgtgattc 2940
tcatgcaatt ttgggaactc aaatgacata atacaagcat taaaccaaat ccacgacact 3000
gcaggtataa accatacaag cattctacca actgtgctac actgcccact cctgacacgt 3060
ctttctttag ggtatgtacc tgaaagtaaa attatcaggt ctttctcctt taccacggtc 3120
cattatcaca ttggtgaaaa tggattgatc aactcttctg ttgccttcct tttctcttgg 3180
tgacagatga aatgacaatt ctcccaccag caatcacaaa atcttcaatt tttagttgag 3240
ataaaatatg catactaggg tagggagcat acatacaagc gccaagtgct cattacagag 3300
ttagatcacc cacataatca ggactgggtc aaaacagaaa ctcaccagca accaccacca 3360
ccagctaact ggtcttccac tacca 3385
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgcctgcac ccaagattca cc 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gggcgcaact gcaactccga taaa 24
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcatgggccg acaagcagaa gaacg 25
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
actgggggca agaaatgggg aaca 24
Claims (5)
1.一种T细胞示踪系统,其特征在于,包括同源重组载体、Cas9mRNA、gRNA、模式生物目的细胞,所述同源重组载体包括重组左臂、核糖体接入位点、第一报告基因、自剪切多肽、第二报告基因、重组右臂;
所述gRNA具有如下所示的核苷酸序列:
TAGTAGTTGTAGCTTCCTGGCGG;
将所述的同源重组载体插入模式生物目的细胞的Cd8a基因终止密码子之前构建动物模型;
所述第一报告基因为荧光素酶,所述第二报告基因为绿色荧光蛋白,所述自剪切多肽为2A,所述同源重组载体为基因工程表达载体。
2.根据权利要求1所述的T细胞示踪系统,所述同源重组载体进一步包括位于重组左臂和核糖体接入位点之间的蛋白标签。
3.根据权利要求1所述的T细胞示踪系统,进一步包括在插入位点附近设计并合成识别靶位点的gRNA的步骤。
4.根据权利要求3所述的T细胞示踪系统,进一步包括将权利要求1-2中任一项所述的同源重组载体、Cas9 mRNA和权利要求3中所述的gRNA混合并导入动物模型的细胞的步骤。
5.根据权利要求4所述的T细胞示踪系统,所述导入方式包括显微注射、共转染;所述动物模型为哺乳动物;所述细胞为具有能发育成完整生物体的全能性体细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110911178.1A CN113621578B (zh) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | 细胞毒性t细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110911178.1A CN113621578B (zh) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | 细胞毒性t细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113621578A CN113621578A (zh) | 2021-11-09 |
CN113621578B true CN113621578B (zh) | 2023-11-28 |
Family
ID=78383810
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110911178.1A Active CN113621578B (zh) | 2021-08-10 | 2021-08-10 | 细胞毒性t细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113621578B (zh) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102936600A (zh) * | 2012-11-08 | 2013-02-20 | 同济大学苏州研究院 | 稳定表达荧光素酶的a549裸鼠模型及其建立与应用 |
CN103160539A (zh) * | 2012-04-13 | 2013-06-19 | 郜发宝 | 一种双报告基因重组腺病毒载体及其构建方法与应用 |
CN111484979A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-08-04 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种可体内示踪的肝肿瘤细胞株及其构建方法 |
CN112852875A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-05-28 | 福建省立医院 | 示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用 |
CN113073113A (zh) * | 2021-04-06 | 2021-07-06 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法及应用 |
-
2021
- 2021-08-10 CN CN202110911178.1A patent/CN113621578B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103160539A (zh) * | 2012-04-13 | 2013-06-19 | 郜发宝 | 一种双报告基因重组腺病毒载体及其构建方法与应用 |
CN102936600A (zh) * | 2012-11-08 | 2013-02-20 | 同济大学苏州研究院 | 稳定表达荧光素酶的a549裸鼠模型及其建立与应用 |
CN111484979A (zh) * | 2019-11-21 | 2020-08-04 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种可体内示踪的肝肿瘤细胞株及其构建方法 |
CN112852875A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-05-28 | 福建省立医院 | 示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用 |
CN113073113A (zh) * | 2021-04-06 | 2021-07-06 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种监测新冠病毒刺突蛋白S1特异性CTLs功能的可视化小鼠模型的构建方法及应用 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
Bioluminescence-based visualization of CD4 T cell dynamics using a T lineage-specific luciferase transgenic model;Joseph等;《BMC Immunology》;20090803;1-14 * |
Imaging of luciferase and GFP-transfected human tumours in nude mice;Gisela等;《Luminescence》;20030815;218-223 * |
Renilla luciferase-Aequorea GFP (Ruc-GFP) fusion protein, a novel dual reporter for real-time imaging of gene expression in cell cultures and in live animals;Wang等;《Mol Genet Genomics》;20020917;160-168 * |
刘保池.2A公知60.《细胞治疗临床研究=CLINICAL STUDY ON CELL THERAPY》.2019, * |
刘春山.毒性T公知110-111.《肿瘤免疫学》.1992, * |
龚燕华.蛋白标签公知217-218.《蛋白质相互作用及亚细胞定位原理与技术》.2009, * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113621578A (zh) | 2021-11-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111304248B (zh) | 人源化细胞因子il15基因改造非人动物的构建方法及应用 | |
CN111549072B (zh) | Vista基因人源化动物细胞及动物模型的构建方法与应用 | |
CN107815465A (zh) | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 | |
CN110055223A (zh) | 一种B2m基因改造的免疫缺陷动物的制备方法及其应用 | |
CN108424928A (zh) | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 | |
JP4845327B2 (ja) | 腫瘍特異的プロモーター | |
US5589392A (en) | Nucleic acid construct encoding a nuclear transport peptide operatively linked to an inducible promoter | |
JP2022522848A (ja) | ゲノム編集された鳥 | |
CN113621578B (zh) | 细胞毒性t细胞示踪系统以及动物模型的构建方法及应用 | |
CN110283851B (zh) | 与恶性胸腔积液相关的靶点myo9b及其应用 | |
JP4832299B2 (ja) | キメラ癌モデル | |
US20040117867A1 (en) | Transgenic cancer models in fish | |
CN112280800B (zh) | 一种构建体及其在制备动物衰老细胞示踪和衰老细胞清除药物中的应用 | |
GB2592776A (en) | Compositions and methods for multiplexed quantitative analysis of cell lineages | |
CN114134183B (zh) | 一种siglec15基因人源化动物模型的构建方法及应用 | |
WO2020074915A1 (en) | Genetically modified sterile avians and method for the reconstitution thereof | |
KR20120121178A (ko) | 루시퍼라아제 유전자를 과발현하는 형질전환 동물 및 이의 제조 방법 | |
CN106399369B (zh) | 构建在海马体区域特异性敲除IKKα基因的小鼠模型的方法及打靶载体和试剂盒 | |
US20040091913A1 (en) | Composition and method for imaging cells | |
US7041869B2 (en) | Transgenic luciferase mouse | |
CN101652148A (zh) | 通过分子成像利用具有反式剪接核酶的腺病毒诊断疾病的方法 | |
US20020016974A1 (en) | Transgenic, non-human animals containing a coxsackie/adenovirus receptor (CAR) | |
JP2019092417A (ja) | 遺伝子改変非ヒト動物及びその使用 | |
Coghlan et al. | Models of Human Cancer | |
US20230000063A1 (en) | System for detecting extracellular purinergic receptor ligand, and non-human animal having the system introduced thereinto |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |