CN108570479B - 一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用CRISPR/Cas9系统介导完成绒山羊VEGF基因定点敲入，其是依据绒山羊的CCR5基因序列，构建基于CRISPR‑Cas9系统的gRNA表达载体及VEGF同源重组载体。然后将优化后的三种载体共同转入绒山羊胎儿成纤维细胞中，获得VEGF基因定点敲入的阳性细胞。利用体细胞核移植技术制备VEGF基因定点整合绒山羊。本发明所构建的基于CRISPR/Cas9系统的打靶载体为山羊VEGF基因的定点敲入提供了一种简单快捷安全的途径。该方法在细胞系筛选过程中没有涉及任何筛选标记基因，从而大大提高了转基因动物的安全性，对绒山羊的遗传育种以及基因功能的研究具有重要价值。

Description

一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的 方法

技术领域

本发明属于动物分子育种领域，尤其涉及利用CRISPR/Cas9技术定点整合VEGF 基因获得转基因绒山羊的方法。

背景技术

最近生物学研究中，基因组编辑(Genome editing)技术是研究者认识特定基因功能的最新研究技术手段。随着越来越多的物种全基因组测序的完成，研究者面临的新挑战就是如何从大量的数据中获得基因相关功能和应用信息。基因编辑技术是完成这个重要目标的强大研究工具，为此也被Science评为2012年十大重要科学进展之一。近年来，基因组定点编辑迅速发展。人工核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)的产生改变了同源重组的基因打靶技术在应用上受到的限制。随着近年基因组定点编辑技术迅速发展，先后出现了锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases，ZFN)、TALE核酸酶(Transcrition activatorlike effector nucleases，TALENs)和CRISPR/Cas9系统(CRISPR/Cas system)等技术。这些人工核酸酶使DNA在靶位点产生双链断裂(Double stand breaks，DSBs)，然后激活细胞内固有的非同源末端(Non-homologous ending-joining，NHE)或同源末端(Homologousrecombination， HR)以便其修复损伤的DNA，完成对基因组的定点编辑。

CRISPR/Cas系统是在大多数古生菌和多数细菌中存在的一种获得性免疫系统，1987 年在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因位点附近首次发现串联间隔重复序列，于2002年被正式命名为成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspacedshort palindrome repeats,CRISPR)。CRISPR/Cas9系统主要由编码Cas9蛋白的基因，一个短的前导区以及一个由间隔序列和重复序列构成的CRISPR的基因座构成。Cas9蛋白是CRISPR/Cas系统的标志性蛋白，具有核酸内切酶活性。CRISPR/Cas9技术通过一段短的RNA序列与DNA靶序列通过碱基互补原则形成双链，结合Cas9蛋白在DNA靶位点诱导形成双链断裂损伤 (double-stranded break，DSBs)。一个DSBs可以通过两种不同的基因修复途径进行修复，一种是非同源末端连接(Non-Homologous End Joining，NHEJ)修复途径，另一种是同源直接修复(Homology Directed Repair，HDR)途径。NHEJ修复途径是一个易错的修复途径，经常会引入插入缺失突变导致移码突变或者提前引入终止密码子，有效的破坏靶基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，导致基因功能失活；HDR修复途径则需要有修复模板的存在，该途径用于DSB的修复时可以完整的将修复模板的序列整合到基因组靶位点上，所以经常用于在基因组靶位点引入特殊的基因突变。这两种修复途径通常分别用于基因定点敲除(site-specific knock out)和定点敲入(site-specific knock in)。HDR途径用于基因组定点编辑的效率相比利用NHEJ途径进行基因敲除的效率低，根据细胞类型和状态以及基因位点和修复模板的不同，引入外源基因的效率也有所差别。

在CRISPR/Cas9系统发挥作用的过程中，sgRNA(single-guide RNA)序列与基因组上的靶序列通过碱基配对原则结合，起着位点特异性的作用。sgRNA引导Cas9蛋白并与其形成sgRNA/Cas9复合物结合到靶位点，切割基因组DNA。所以sgRNA的设计是具有创造性的。

CRISPR/Cas9技术可以应用在动植物及微生物基因组的编码基因和非编码基因的定点敲除或者定点整合外源基因，可以实现在哺乳动物细胞中对特定DNA位点进行编辑(敲除或定点整合)，为转基因动物研究提供了简易、实用的基因组定点编辑技术。

利用CRISPR/Cas9技术在基因组的目标位点产生DSBs后，当修复模板存在的情况下，细胞会激活基因同源重组修复途径(HDR途径)。这种途径会严格的按照修复模板来修复断裂的DNA双链，可以在目标基因的突变位点产生精确的特定突变，常用来在基因组目标位点引入外源基因。利用HDR修复途径对DSB进行修复，修复模板必须与DSB位点上下游的序列高度同源性，在目标位点引入外源基因时需要在外源基因的上下游分别设计一段与DSB位点上下游序列高度同源的同源臂序列。所以同源臂的设计是具有创造性的。

定点整合外源基因，特异性整合位点的选择十分重要，涉及到细胞、胚胎和个体的正常生长发育和外源基因的表达，故靶位点的选择是具有创造性的。

特异性整合位点的选择包括3个方面：其一，sgRNA/Cas9复合物结合到靶位点，切割基因组DNA。修复同时会整合入外源基因，破坏靶位点基因结构，导致靶位点基因失去功能，靶位点基因的选择应保证不会由于其功能失活而影响细胞的正常生理功能和个体的生长发育；其二，插入的外源基因能够高效表达；其三，要构建定点整合载体，整合载体要包括需要定点整合的外源基因表达盒子和两侧的同源臂。所以整合载体的构建是具有创造性的。

定点整合载体同源臂既可以是传统的构建在载体质粒上的双链DNA序列也可以是单链的寡聚核苷酸序列(ssODNs)。对于小片段(<50bp)的外源基因的靶向整合，一般会利用ssODNs作为修复模板，它的同源臂的长度一般在50～80个bp之间。对于大片段(>100 bp)的外源基因的靶向整合，一般会利用供体质粒(donor plasmid)作为修复模板，它的同源臂的长度一般在800bp左右。

CCR5(C-C chemokine receptor type 5)，又称CD195，是白细胞膜蛋白，G蛋白偶联受体，作为趋化因子受体与免疫系统相关，主要在T淋巴细胞、巨噬细胞及树突状细胞等免疫相关细胞表达，因其是HIV-1侵染细胞的辅助受体而受到关注。在对抗HIV-1感染研究中发现，CCR5基因缺失不会对细胞生长代谢和动物的生长发育产生影响，CCR5可以作为基因编辑靶位点。对小鼠和人细胞的研究表明，在CCR5位点插入的外源基因可以得到表达。CCR5基因可以作为基因编辑靶位点使用。

基因组编辑技术对基因功能研究和动物品种改良有着重要意义。长期以来，通过传统的同源重组技术进行基因研究和品种改良，效率低、难度大。CRISPR/Cas9技术结构简单、多位点同时编辑、外源基因整合、不需要任何筛选标记等优点，使得该技术得以广泛应用。有学者利用CRISPR/Cas9技术对牛的诱导多功能干细胞(induced pluripotent stemcell，IPSCs) 基因组进行了基因定点编辑。成功的将外源基因整合到NANOG位点并得到表达。这一结果显示出技术可以在家畜基因组中进行特异的基因编辑，但目前还处于细胞水平，尚无通过 CRISPR/Cas9技术定点整合外源基因并获得转基因家畜的报道。

绒山羊是我国一种独特的生物资源，经过长期的自然选择和人工选育成为目前世界上绒纤维品质最好的品种，但产绒量尚有提高的空间。提高绒山羊产绒量，培育高产、优质的绒山羊新品种是绒山羊育种工作目标。但是，CRISPR/Cas9技术在绒山羊分子育种中的应用还缺乏完整的技术方案，需要解决诸多技术问题，如提高基因编辑的效率，选择合适编辑位点及设计精准高效的sgRNA，定点整合外源基因的模板构建，避免脱靶效应，发生外源基因定点整合细胞的筛选、鉴定、扩增，利用阳性细胞通过体细胞核移植(Somatic cellNuclear Transplantation，SCNT)技术构建重构胚，重构胚体外培养发育，胚胎移植，胚胎移植及妊娠母羊孕期管理，产后羔羊管理，定点整合外源基因子代绒山羊的鉴定与管理等。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种基于CRISPR/Cas9技术定点整合 VEGF基因获得转基因绒山羊的方法。

为实现本发明所述目的，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术在绒山羊基因组CCR5位点定点整合VEGF基因表达盒获得转基因绒山羊的方法，该方法包括下列步骤：

1)CCR5位点的选择。本发明以绒山羊CCR5基因全长基因组序列(Gene ID：102178672) 为基础，根据第二外显子设计了4条长20～21nt的gRNA(gRNA1、gRNA2、gRNA3和gRNA4)，具体序列见表1。

表1

2)构建gRNA表达载体：

在设计的gRNA序列两端分别加上如下下划线标记的序列(5′-3′)，构成片段1：

Gene-F：TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Gene-R：TAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

Gene-F中的下划线序列是U6启动子的3′端序列；Gene-F中的下划线序列是gRNA骨架的5′端序列；N指20nt～21nt的分别与靶基因的DNA双链序列反向互补的gRNA序列，即Gene-F和Gene-R中的NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN序列是反向互补的。

根据表1中4条长20～21nt的gRNA(gRNA1、gRNA2、gRNA3和gRNA4) 序列，在gRNA序列两端分别加上上述下划线序列，通过化学合成方法获得4个片段1 命名为U-gRNAs(U-gRNA1、U-gRNA2、U-gRNA3和U-gRNA4)。

利用逐步降温方法使Gene-F和Gene-R退火形成双链，片段命名为1。以gRNA-T2 为模板用PrimeSTAR保真酶，使用hgRNA5′和hgRNA3′进行PCR扩增，得到hgRNA 5′端片段和3′端片，命名为2和3。然后以1、2、3共同为模板，利用hgRNA5F和 hgRNA3R进行PCR，得到大小为455bp的完整gRNA。将纯化的PCR产物进行末端加 A处理后，与pMD-19T连接，转化大肠杆菌感受态，进行涂板。次日挑取单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃、220rpm揺菌培养后进行菌液PCR鉴定。筛选得到的阳性克隆菌液进行测序。提取测序正确的质粒，命名为“gRNA-CCR5”，-20℃保存备用。

采用重叠PCR方法获得455bp的gRNA及其骨架序列编码片段(图1)

gRNA质粒结构及gRNA二级结构示意图(图2)

构建好的gRNA表达载体包括U6启动子、靶序列、gRNA骨架和终止信号。分别命名为pCCR5-gRNA1、pCCR5-gRNA2、pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4。

3)构建好的gRNA表达载体pCCR5-gRNA1、pCCR5-gRNA2、pCCR5-gRNA3和 pCCR5-gRNA4分别与hCas9质粒(图3)共转绒山羊胎儿成纤维细胞(CFFCS)：将表达gRNA1、gRNA2、gRNA3和gRNA4的表达载体pCCR5-gRNA1、pCCR5-gRNA2、 pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4分别和hCas9载体采用电转方法共转染CFFCS。

48h后提取细胞基因组DNA，使用根据CCR5-1、CCR5-2、CCR5-3和CCR5-4位点序列两侧设计的特异性引物(表2)进行PCR扩增，预期片段长度分别为799bp，800bp， 790bp和789bp。

表2

PCR反应结束后，产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化4个目的产物片段。

使用Surveyor错配酶酶切目的产物片段，对gRNA1/Cas9、gRNA2/Cas9、 gRNA3/Cas9和gRNA4/Cas9分别作用的细胞基因组突变进行检测，验证gRNA的有效性和细胞基因组是否发生突变。如果在CCR5位点发生突变，Surveyor错配酶酶切PCR扩增片段的长度分别为799bp、800bp、790bp和789bp，在电泳图上gRNA4表现为发生突变，其中一个大片段(789bp)和2个小片段(400bp，300bp)。从4个gRNAs中选择有效的gRNA应用于下一步骤。

在确定gRNA特异性和有效性的基础上，构建定点整合VEGF基因载体。

4)构建VEGF外源基因定点整合载体P1-KV-polyA-P2：

本发明所用外源基因VEGF为本实验室前期克隆自阿尔巴斯白绒山羊(GenBankaccession number:JX524883)，包含全部的ORF，编码由190个氨基酸残基组成的VEGF蛋白，具有促进绒毛生长的功能。在前期工作中我们将此VEGF基因亚克隆到绵羊皮肤特异性启动子KAP6.1的下游(参考序列GenBank accession number:M95719.1，克隆第1位核苷酸1042位核苷酸间的片段，共1042p)，构建了VEGF过表达载体pCDsRed2-KV。在这个pCDsRed2-KV载体中，VEGF基因下游没有连接转录终止信号polyA序列，故本发明以VEGF过表达载体：pCDsRed2-KV为模板，设计PCR引物(表3)，克隆polyA序列。上游引物添加了Hind III酶切位点，下游引物添加了Kpn I酶切位点。

表3

应用上述引物，以pCDsRed2-KV为模板，通过PCR方法克隆了224bp的polyA序列片段，连接到pDsRed2-KV载体的VEGF基因下游，构成KAP6.1-VEGF-polyA表达盒，重组载体命名为pCDsRed2-KV-1(图4)

为实现在绒山羊基因组CCR5位点整合入VEGF基因的表达盒 KAP6.1-VEGF-polyA，需要在该表达盒两侧加上与绒山羊CCR5位点两侧序列一致的同源臂。根据确定的CCR5基因序列，在筛选出的突变的靶位点两侧选取上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)。

根据CCR5基因序列和筛选出的靶位点，设计2对引物(表4)，P1上、下游引物5′端引入了Bam HI酶切位点；P2上游引物5′端引入Kpn I酶切位点，下游引物5′端引入Mfe I酶切位点。P1片段为CCR基因核苷酸序列的2837位3895位，预期片段长度1059bp。P2片段为CCR基因核苷酸序列的3972位5052位，预期片段长度1082bp。

表4

PCR扩增上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)。

将扩增得到的P1和P2整合到VEGF过表达载体pCDsRed2-KV-1中，P1位于 KAP6.1-VEGF-polyA表达盒上游，P2位于KAP6.1-VEGF-polyA表达盒下游。考虑到P1 上、下游引物5′端引入了同一个Bam HI酶切位点，可能会出现正、反连接的结果，正向连接的为正确连接。这个问题通过对得到的多个重组质粒进行测序，选出正向连接的质粒，作为定点整合载体(图4)，命名为pP1-KV-PolyA-P2。

5)CRISPR/Cas9介导外源VEGF基因表达盒定点整合入CCR5位点的打靶细胞系的筛选及鉴定：

本发明所用供外源VEGF基因表达盒定点整合入CCR5位点的打靶细胞系为绒山羊胎儿成纤维细胞，通过原代培养获得，实验使用P2-P6代细胞(图5)。细胞性别鉴定采用SRY基因检测方法。

设计SRY基因引物(表5)

表5

提取细胞基因组DNA，PCR扩增SRY基因，阳性为雄性，阴性为雌性。

利用构建好的gRNA4表达载体pCCR5-gRNA4、hCas9质粒和线性化的定点整合载体pP1-KV-PolyA-P2通过电转方法共转染CFFCs，用pCDsRed2-KV作为对照。转染细胞12h和48h时观察生长状况。

将转染48h后生长良好且发出红色荧光的细胞，通过口吸管法获得单细胞，接种96孔细胞培养板培养获得单细胞克隆细胞系。待单细胞克隆长满细胞培养孔，逐一传代、扩增至6孔细胞培养板。待传代培养的6孔细胞培养板长满后，收集部分细胞用于提取基因组DNA用于PCR检测外源表达盒。为了避免检出內源VEGF基因，根据部分KAP6.1片段及上游同源臂侧翼序列设计引物(表6)，PCR扩增部分KAP6.1片段及上游同源臂侧翼序列，预期片段长度1.5Kb(图6)。

表6

PCR扩增产物电泳检测，纯化回收目的片段，测序。根据电泳检测结果和目的片段序列比对获得定点整合KAP6.1-VEGF-polyA表达盒的阳性细胞系D39，可作为后续通过SCNT制备重构胚的供体细胞。

6)在基因组CCR5位点定点整合VEGF基因的转基因绒山羊制备与鉴定：

通过SCNT方法制备转基因绒山羊，需要几个方面的材料准备和操作步骤，包括卵母细胞的采集和体外成熟，准备核供体细胞(上述得到的定点整合KAP6.1-VEGF-polyA表达盒的阳性细胞系D39)，制备重构胚胎，准备受体母羊，体细胞克隆胚胎移植入受体母羊输卵管中，受孕母羊鉴定，孕期母羊管理，产羔管理，新生羔羊管理，鉴定定点整合VEGF基因的绒山羊羔羊，外源VEGF基因的表达检测，转基因绒山羊管理等。整个过程的各个步骤中，定点整合VEGF基因的核供体细胞准备、转基因羊鉴定和外源基因表达检测等内容具有创造性，其它内容为常规技术。

卵母细胞的采集和体外成熟。在商业屠宰场采集绒山羊卵巢，带回实验室，使用生理盐水反复清洗，放入含有20mL采卵液的培养皿中，剖割法取卵，释放出卵泡液和卵丘 -卵母细胞复合体(COCs)。回收的卵母细胞于M199成熟培养液，培养条件为38.5℃， 18h后的COCs置于0.1％的透明质酸酶中，用200μL的移液器轻轻反复吹打去掉成熟的卵母细胞表面的卵丘细胞，在体视镜下挑选排出第一极体的形态良好的卵母细胞用于细胞核移植。

准备核供体细胞(上述得到的定点整合KAP6.1-VEGF-polyA表达盒的阳性细胞系D39)。将定点整合VEGF基因的阳性细胞系D39以不同的梯度接种到二十四孔板中，用含有15％FBS的细胞培养液培养细胞48h，用50μL的0.25％胰蛋白酶消化2min，用含450μL的15％胎牛血清的培养液终止消化，轻轻吹打使细胞悬浮，吸取50μL细胞混合液，准备用于核移植。

制备重构胚胎。将成熟后的卵母细胞脱去颗粒细胞与核供体细胞放入CCB的滴中，采用盲吸法，在显微操作仪下吸除第一极体，同时吸出处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。再将核供体细胞注射到卵周隙中，并使供体细胞与卵质膜接触。将完成的重构胚胎放入成熟液中清洗三遍，然后放入培养箱培养30min后进行电融合(融合参数为90V/mm，一次直流脉冲、30μs/次)。将电融合好的重构胚再放培养箱中恢复30min。然后，挑取融合的胚胎统计计数后，置于A231875μM I中激活5min，然后再将其放入2mM 6-DMAP 培养液中培养4h，之后放到发育液中培养。38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件培养48h后挑选发育到2-8细胞期的胚胎用于移植。

准备受体母羊。九月份成体母羊自然发情，早上试出来的发情母羊随羊群放牧，晚上继续试情，所有发情母羊记录耳号，并打好标记，共150只。单独圈养进行空腹，准备手术。

体细胞克隆胚胎移植入受体母羊输卵管中。手术移植前一天对受体母羊禁食，先对手术受体母羊注射麻药鹿眠灵，腹部靠近乳房部剃毛消毒后，敷已灭菌的创布，在腹中线纵线切，拉出子宫角及卵巢，查看排卵点。用移植枪吸取4-5枚2-8细胞的克隆胚胎，移植入有排卵点一侧的输卵管中。结束后向腹腔内注射20mL抗生素同时肌注5mL抗生素。移植完毕后用缝合线进行双层缝合，撒上消炎粉后间断缝合皮肤，静脉注射苏醒药鹿醒灵。

受体羊的术后管理与受孕母羊鉴定。受体母羊手术后单独进行饲养，待伤口愈合后，进行试情，观察是否反情。如果两个情期均未返情，则该受体羊可能具有妊娠情况，对其进行B超检查，进一步确定是否怀孕。

孕期母羊管理。对已妊娠的受体羊进行集中饲养，并观察其生长发育情况，进入预产期的受体羊进行严密的监控保证其可顺利生产。

产羔与新生羔羊管理。刚出生的羔羊进行特殊的看护和管理确保其安全，每月对初生羔羊的体长、体高、胸围和体重进行测量并记录，待羔羊生长至一个月时，采血样进行初步鉴定。

本发明中接受胚胎移植的150只受体母羊，有3只母羊各产羔羊1只，共3只，为1618号，1625号和1652号。其中1652号羔羊于出生7天后死亡，其余2只存活至今，一只是带有黑色绒毛的1625号羊，另一只是白色1618号羊。

定点整合VEGF基因的绒山羊羔羊鉴定及外源VEGF基因表达检测。本发明对定点整合VEGF基因的绒山羊鉴定及外源VEGF基因表达检测包括3个方面：

第一个方面，定点整合VEGF基因绒山羊PCR鉴定。在牧场分别采集每只新生羔羊的血液，提取基因组DNA作为模板，使用鉴定引物(表6，图6)，PCR扩增目的片段。预期片段长度1500bp。扩增出目的片段的为定点整合VEGF基因的绒山羊。

第二个方面，定点整合VEGF基因绒山羊皮肤组织的实时定量PCR鉴定。在牧场分别剪取新生羔羊耳尖皮肤组织。采集耳尖皮肤时，耳尖剃毛，碘酒消毒，70％酒精脱碘，无菌手术剪剪取整个耳尖(约2～3cm2)置37℃，含青霉素(100IU/ml)、链霉素(100IU/ml) 生理盐水中，1-2h内带回实验室。羔羊耳尖伤口用消炎粉处理。提取绒山羊皮肤组织总 RNA，反转录合成cDNA，以GAPDH基因表达作为内标，定量PCR检测转基因绒山羊皮肤组织中和对照组绒山羊皮肤组织中VEGF基因的表达。所用引物为(表7，图7)。比对VEGF基因mRNA丰度，过表达VEGF基因的为转基因绒山羊，同时确定外源 VEGF基因得到转录。

表7

第三个方面，定点整合VEGF基因绒山羊皮肤组织蛋白的Western Blot检测。提取绒山羊皮肤组织总蛋白，以VEGF抗体采用Western Blot检测转基因绒山羊皮肤组织中和对照组绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白的表达量。比对两种组织中VEGF蛋白量，过表达VEGF 基因的为转基因绒山羊，同时表明外源VEGF基因编码的蛋白质得到表达。

转基因绒山羊管理。两只新生羊生活在内蒙古亿维白绒山羊有限责任公司(原内蒙古白绒山羊种羊场)的转基因羊养殖场，主要以放牧试饲养。

本发明与现有技术相比具有以下优点:

(1)关于CCR5位点选择，近期研究者对以CCR5靶位点的HIV-1受体拮抗剂越来越关注；同时CCR5基因缺失不会对物的生长发育产生影响。CCR5可以作为基因编辑靶位点，使用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、shRNA、small interfering RNAs(siRNA)等方法抑制或者敲除CCR5基因可以防止HIV-1入侵时与之结合。目前未见报道出在CCR5位点整合获得动物(包括小鼠)。

(2)关于gRNA的选择,绒山羊CCR5基因第一外显子较短，仅为112bp，第二外显子较长，为1312bp，而且起始密码子在第二外显子上，所以本发明根据CCR5第二外显子序列设计了4条长20nt～21nt的gRNAs。

(3)定点整合载体P1-KV-polyA-P2构建，本实验设计载体通过本实验已有的pCMV-DsRed进行改造，起到了保护原基因的准确性，同时破坏了药物筛选标记，实现了载体不带有任何标记，大大增加了基因编辑动物的安全性，同源臂的缩短和较短的线性化的整合载体大大提高转染效率，也提高整合效率。后续检测工作也容易进行。而且通过酶切连接上下游同源臂，快速方便缩短实验周期。

(4)定点整合VEGF基因的单克隆转基因细胞系，通过口吸管法挑选得到80株单克隆细胞，通过PCR检测获得1株CCR5位点定点整合VEGF基因的阳性单克隆细胞系D39，效率达到1.25％。效率与其他基因编辑技术显著提高，而且用时较短，缩短实验周期。

(5)CCR5位点定点整合VEGF基因转基因绒山羊的获得，为用于通过PCR 方法鉴定CCR5位点特异性整合外源VEGF基因表达盒所用的扩增引物对转基因羔羊鉴定。

(6)外源VEGF基因的表达检测,通过实时定量PCR检测NT、1618和1625 绒山羊皮肤组织中，VEGF基因mRNA的表达情况，结果显示，1618和1625两只新生羊皮肤组织中VEGF基因mRNA表达量与NT皮肤组织中的表达量相比增高。蛋白质免疫印迹实验检测NT、1618、1625绒山羊皮肤组织中VEGF基因蛋白表达量。结果显示， 1618和1625定点整合绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达量较于NT的表达量增高。

所述步骤[VEGF外源基因整合载体构建]中的VEGF基因为本课题组克隆的阿尔巴斯白绒山羊VEGF164基因的cDNA，包括全长ORF，GenBank收录号为：JX524883。

所述步骤[gRNA表达载体设计]中的CCR5基因为山羊CCR5基因(Gene ID：102178672)。

所述步骤[卵母细胞的采集和体外成熟]中的采卵液、Opti-MEM、M199成熟培养液、15％胎牛血清的培养液、细胞混合液、CCB、6-DMAP培养液、发育液均为常规培养液。

所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的抗生素为宁波二厂。

所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的消炎粉为宁波二厂。

所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的鹿醒灵为宁波二厂。

所述步骤[体细胞克隆胚胎移植]中的鹿眠灵为宁波二厂。

所述步骤[转基因羊的鉴定]中的VEGF抗体为abcam公司。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为扩增455bp的gRNA及其骨架序列编码片段的重叠PCR示意图。这种扩增策略可以实现3个小片段之间互为模板、互为引物，延伸和扩增，最终获得455bp的 gRNA及其骨架序列编码片段。

图2为构建的表达gRNA的载体结构及gRNA二级结构示意图。A：载体结构，由U6启动子驱动gRNA转录，下游有终止子序列；B：gRNA及其骨架二级结构。

图3为所用的表达Cas9蛋白的hCas9质粒。由CMV启动子驱动Cas9基因转录。

图4为CCR5位点特异性整合外源VEGF基因表达盒所用的打靶载体P₁-KV-PolyA-P₂的构建流程示意图。P1为CCR5基因第二外显子3895bp位核苷酸上游1059 bp片段，P2为CCR5基因第二外显子3972bp位核苷酸下游1082 bp片段。2个同源臂的长度可以保证带着外源VEGF基因表达盒实现同源重组，定点整合。整合的KAP6.1-VEGF-polyA表达盒中，KAP6.1是皮肤特异性启动子，VEGF基因包含了全部的ORF，polyA可以提供转录终止信号，终止转录。

图5为通过SCNT制备重构胚的核供体细胞---绒山羊胎儿成纤维细胞。绒山羊胎儿成纤维细胞作为核供体细胞在本实验室使用多年，具有高效特性。

图6为用于通过PCR方法鉴定CCR5位点特异性整合外源VEGF基因表达盒所用的扩增引物设计示意图。扩增片段是绒山羊基因组不存在的、只有外源整合的VEGF 基因表达盒所特有的片段，可以用于转基因细胞和转基因羔羊鉴定。

图7为本发明采用实时定量PCR方法检测绒山羊皮肤组织中VEGF基因过表达所用扩增引物的示意图。皮肤特异性启动子KAP6.1可以在皮肤组织中过表达外源VEGF基因，与对照组相比，转基因羔羊皮肤组织中VEGF基因过表达。

图8为按照图1所示通过重叠PCR分别获得gRNA 5′端(318bp)片段和gRNA 3′端(117bp)片段，最后获得455bp片段的电泳图。表明3个片段成功克隆得到。M:DL1000marker；1:gRNA(455bp)；2:gRNA 5′端(318bp)；3:gRNA 3′端(117bp)。

图9为使用Surveyor错配酶酶切检测可能包含有发生突变的靶序列片段的PCR 扩增产物的电泳图。C：对照；M：DL2000marker；1为转染gRNA4检测结果。结果显示 gRNA4导致细胞基因组发生突变。表明gRNA4是有效的gRNA，作为后续实验使用。

图10为224bp的polyA片段和1059bp的上游同源臂P1和1082bp的下游同源臂P2的PCR产物电泳图。M:200bp marker；1:P1；2:P2；3:PolyA。

图11为将构建好的P1-KV-polyA-P2质粒使用Nhe I单酶切，双酶切Nhe I和 Kpn I双酶切鉴定的电泳图。M：1KbDLodder Maker，1：Nhe酶单酶切，2：Nhe I和Kpn I双酶切。结果显示，Nhe I单酶切目的条带大小7.3kb，Nhe I和KpnI双酶切产生条目的带大小为2.7kb和5.6kb，符合预期结果。

图12为对准备作为核供体的绒山羊胎儿成纤维细胞提取基因组DNA，PCR扩增 SRY基因，PCR产物电泳检测的结果。目的片段大小为497bp。其中M：DL2000marker， C：H2O，1：绒山羊母羊(阴性对照)，2：绒山羊胎儿成纤维细胞，3：绒山羊公羊(阳性对照)。根据PCR产物电泳检测结果可知本发明所使用的细胞系为雌性。

图13为225V/2.5ms条件，10μg pCMV-DsRed-Express2质粒转染1×106个细胞，转染效率可以达到100％。图片为转染后48h的细胞照片。A：普通光射下拍摄，B：蓝关激发的绿色荧光照片。

图14为对转染细胞12h和48h后观察生长状况拍照，结果显示用pCCR5-gRNA4、hCas9和pP1-KV-polyA-P2三个载体共同转染的细胞生长状态良好(图14A，B)；对照实验组pCDsRed2-KV质粒转染的细胞，红荧光较强，转染效率较高(图14C，D)，对30 个视野的统计表明转染效率可以达到100％。

图15为通过口吸管法挑选得到的CCR5位点定点整合VEGF基因的阳性单克隆细胞系D39的PCR鉴定电泳图。图中M：250bp DNA marker，C：对照，1为阳性细胞系D39。

图16为绒山羊卵母细胞形态。其中A:未成熟的卵母细胞；B:去掉卵丘细胞的成熟卵母细胞。

图17为克隆胚的构建及融合图。其中A：克隆胚的构建过程；B克隆胚融合过程。

图18为卵母细胞及重组胚发育过程。其中A：未成熟卵母细胞；B：成熟卵母细胞；C、D、E、F分别为2细胞、4细胞、8细胞和囊胚。

图19为出生后30天的1618号羔羊和出生后30天的1625号羔羊。带有黑色绒毛的为1625号，白色的为1618号。

图20为新生羔羊出生后30天，在牧场分别采集每只新生羔羊的血液，提取基因组DNA作为模板，使用表6中的鉴定引物，PCR扩增目的片段的电泳图。预期片段长度1500bp。其中3、8泳道在预期1500bp出现目的条带，其模板为通过体细胞核移植产生的转基因雌性羊羔1618号和1625号的基因组DNA。12号泳道为定点整合VEGF基因的阳性单克隆细胞系D39基因组DNA为模板的阳性对照组C1，13号泳道为以无酶水为模板的阴性对照组C2，其他泳道为正常饲养的对照组所生的羊羔，均未出现目的扩增条带。说明体细胞核移植受体母羊所产的羊羔1618和1625为CCR5位点定点整合 VEGF基因的转基因绒山羊。

图21为实时定量PCR检测对照组(NT)、1618号和1625号羔羊皮肤组织中 VEGF基因mRNA的表达丰度图。其中1618号和1625号两只新生羔羊皮肤组织中 VEGF基因mRNA表达量与NT皮肤组织中的表达量相比显著增高(p＜0.01)。表明外源VEGF基因在CCR5位点得到高表达。

图22为Western Blot检测NT、1618号和1625号新生羔羊皮肤组织中VEGF 蛋白表达量的图。A：Western Blot图；B：蛋白免疫印迹条带的灰度分析图。相比NT，1618 和1625定点整合绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达量增高(p＜0.01)。表明新生绒山羊皮肤组织中VEGF基因得到高表达。

图23为CRISPR/Cas9介导的外源基因整合示意图

具体实施方式

在下面的实施例中进一步说明了本发明，但这并不限制本发明的范围。在实施例中说明的本发明的制备方法中，本发明所创新的技术方法给予了特别说明，无特别说明的均为常规方法。

实施例1：基于以绒山羊CCR5全长基因组序列(Gene ID：102178672)设计gRNA 基于靶序列设计gRNA是CRISPR/Cas9技术的基本要求。对于定点整合外源基因而言，靶序列的选择十分重要，涉及到细胞、胚胎和个体的正常生长发育和外源基因的表达，故靶位点的选择是具有创造性的。

本发明选择绒山羊CCR5基因为靶位点，既参考了文献数据，又对绒山羊CCR5全长基因组序列(Gene ID：102178672)进行了序列特征分析。绒山羊CCR5基因第一外显子较短，仅为112bp，第二外显子较长，为1312bp，而且起始密码子在第二外显子上，所以本发明根据CCR5第二外显子序列设计了4条长20nt～21nt的gRNAs(gRNA1、 gRNA2、gRNA3和gRNA4)(表1)。

实施例2：构建gRNA表达载体

gRNA表达载体构建需要相应的原件，包括启动子、gRNA序列和骨架序列、转录终止信号等，构成一个gRNA序列和骨架序列的转录盒。故gRNA表达载体构建是需要创造性的。

本发明设计gRNA质粒结构示意图如图2所示，包括U6启动子、gRNA及其骨架序列和终止信号序列。首先按照图1所示通过重叠PCR分别获得gRNA 5′端(318bp) 片段和gRNA 3′端(117bp)片段，最后获得455bp的编码gRNA及其骨架序列的片段(图 8)。然后以gRNA载体为基本骨架，构建成包括U6启动子、gRNA及其骨架序列和终止信号序列，并且在大肠杆菌中可以复制的表达载体pCCR5-gRNAs。

1)中间载体为pMD-19T。

2)gRNA表达载体构建，利用逐步降温方法使Gene-F和Gene-R退火形成双链，片段命名为1。以gRNA-T2为模板用PrimeSTAR保真酶，使用hgRNA5′和hgRNA3′进行PCR扩增。得到hgRNA 5′端片段和3′端片，命名为2和3。然后以1、2、3共同为模板，利用hgRNA5F和hgRNA3R进行PCR，得到大小为455bp的完整gRNA。将纯化的PCR产物进行末端加A处理后，与pMD-19T连接，转化大肠杆菌感受态，进行涂板。次日挑取单菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃、220rpm揺菌培养后进行菌液PCR鉴定。筛选得到的阳性克隆菌液进行测序。提取测序正确的质粒，命名为“gRNA-CCR5(pCCR5-gRNA1、pCCR5-gRNA2、pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4)”-20℃保存备用。

构建的pCCR5-gRNA1、pCCR5-gRNA2、pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4载体经测序正确，各原件按照预定顺序排列。

实施例3：gRNA有效性检测

将pCCR5-gRNA1、pCCR5-gRNA2、pCCR5-gRNA3和pCCR5-gRNA4分别和hCas9载体采用电转方式共转染CFFCS，48h后提取细胞基因组DNA，DNA提取步骤参照Wizard Genomic DNAPurification Kit说明书完成。

使用根据CCR5-1、CCR5-2、CCR5-3和CCR5-4位点两侧序列设计的特异性引物 (表2)进行PCR扩增，PCR反应体系为LATaqTM II 25μL，上游引物(10uM/L)2μL ，下游引物(10uM/L)2μL，模板2μL，d3H2O 19μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃ 1min、57℃30sec，72℃45sec，33个循环；72℃10min，16℃30min。从绒山羊基因组中扩增出含有sgRNA靶位点的片段，电泳检测并将目的片段使用GeneJET Gel Extraction Kit 试剂盒进行胶回收并纯化。

纯化后的目的片段使用Surveyor错配酶酶切检测。如果gRNA1、gRNA2、gRNA3 和gRNA4诱发突变，扩增片段将被Surveyor错配酶切为两段，预期片段长度分别为400bp 和300bp。电泳图上会显示3条带，即PCR扩增片段(700bp)、被Surveyor错配酶切成的两段(400bp、300bp)。结果显示gRNA4导致细胞基因组发生突变(图9)。表明 gRNA4是有效的gRNA，作为后续步骤使用。

实施例4：构建VEGF基因CCR5位点定点整合载体

为实现在绒山羊基因组CCR5位点整合入VEGF基因的表达盒KAP6.1-VEGF-polyA，需在该表达盒两侧加上与绒山羊CCR5位点两侧序列一致的同源臂。根据确定的CCR5基因序列，在筛选出的、发生突变的靶位点两侧选取上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)。同源臂序列决定CCR5位点定点整合的精准性和整合效率，故同源臂序列的选择和CCR5 位点定点整合载体的构建具有创造性。

构建CCR5位点定点整合载体的基本骨架是本实验室之前构建的pCDsRed2-KV，在这个pCDsRed2-KV载体中，VEGF基因下游没有连接转录终止信号polyA序列，故本发明山羊CCR5基因序列为模板，设计PCR引物(表3)。上游引物添加了HindIII酶切位点，下游引物添加了Kpn I酶切位点。

应用上述扩增polyA片段的特异性引物，以pCDsRed2-KV为模板PCR扩增 SV40的polyA片段。PCR反应体系为LATaqTM II 25μL，上游引物(10uM/L)2μL，下游引物(10uM/L)2μL，模板2μL，d3H2O 19μL。PCR反应条件：95℃5min；95℃30sec， 57℃30sec，72℃30sec，33个循环；72℃10min，16℃30min。克隆得到SV40的224bp 的polyA序列片段(图10)，测序正确。将polyA片段连接到pDsRed2-KV载体的VEGF 基因下游，构成KAP6.1-VEGF-polyA表达盒，重组载体命名为pCDsRed2-KV-1，对重组载体测序表明polyA片段正确连接在VEGF基因下游。在pCDsRed2-KV-1的基础上继续构建CCR5位点定点整合载体。

根据CCR5基因序列和筛选出的靶位点(gRNA4互补序列)，设计引物(表4)，同源臂P1上、下游引物5′端引入了Bam HI酶切位点；同源臂P2上游引物5′引入Kpn I酶切位点，下引物5′端引入Mfe I酶切位点。2837位3895位，预期片段长度1059bp。 P2片段为CCR基因核苷酸序列的3972位5052位，预期片段长度1082bp。

PCR扩增上游同源臂(P1)和下游同源臂(P2)：

提取绒山羊胎儿成纤维细胞基因组DNA，DNA提取步骤参照Wizard GenomicDNAPurification Kit说明书完成。

应用表4中扩增同源臂P1的一对特异性引物、扩增同源臂P2的一对特异性引物，以绒山羊基因组DNA为模板分别扩增P1片段和P2片段，PCR反应体系为LATaqTM II 25μL，上游引物(10uM/L)2μL，下游引物(10uM/L)2μL，模板2μL，d3H2O 19μL。 PCR反应条件：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃1min，33个循环；72℃10min， 16℃30min。从绒山羊基因组中扩增出P1片段和P2片段，电泳检测并将目的片段使用 GeneJET Gel Extraction Kit试剂盒进行胶回收并纯化。

电泳检测得到1059bp的上游同源臂P1和1082bp的下游同源臂P2(图10)，测序正确。

将扩增得到的P1和P2整合到VEGF过表达载体pCDsRed2-KV-1中，P1位于 KAP6.1-VEGF-polyA表达盒上游，P2位于KAP6.1-VEGF-polyA表达盒下游。

考虑到P1上、下游引物5′端引入了同一个Bam HI酶切位点，可能会出现正、反连接的结果，正向连接的为正确连接。这个问题通过对得到的多个重组质粒进行测序，选出正向连接的质粒，作为定点整合载体(图4)，命名为pP1-KV-PolyA-P2。

将构建好的P1-KV-polyA-P2质粒使用Nhe I单酶切，Nhe I和Kpn I双酶切鉴定，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，Nhe I单酶切目的条带大小7.3kb，Nhe I和KpnI 双酶切产生条目的带大小为2.7kb和5.6kb，符合预期结果(图11)。重组载体测序表明，各元件按照预定顺序排列且连接正确。

实施例5：CCR5位点定点整合VEGF基因的单克隆细胞系的获得在获得CCR5 位点定点整合外源KAP6.1-VEGF-polyA表达盒单克隆细胞系的过程中，需要经过鉴定细胞系性别、转染细胞、筛选、单克隆培养及转基因细胞系鉴定等过程。其中转染条件的确定和单克隆细胞系的获得是具有创造性的环节。

1)绒山羊胎儿成纤维细胞为本实验室通过原代培养的方法分离，15％FBS的DMEM/F12培养液，于5％CO2、37℃的培养箱中培养，扩增后液氮冻存。用时解冻培养。这些都是常规方法。

2)绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定。解冻通过原代培养得到的冻存绒山羊胎儿成纤维细胞，正常培养扩增，一部分细胞提取细胞基因组DNA，应用表5中针对SRY基因的特异性引物，PCR扩增SRY基因片段，预期片段长度497bp。PCR反应体系为 LATaqTM II 25μL，上游引物(10uM/L)2μL，下游引物(10uM/L)2μL，模板2μL，d3H2O 19μL。扩增条件：95℃5min预变性；95℃30sec变性，56℃30sec退火，72℃延伸30sec， 33个循环；72℃10min；4℃30min。同时以来自于母羊和公羊的DNA作为阴性和阳性对照。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测是否有目标条带。

电泳检测表明未检测到SRY基因片段(图12)。使用的细胞系为雌性。

3）定点整合VEGF基因打靶载体P₁-KV-polyA-P₂转染绒山羊胎儿成纤维细胞：

绒山羊胎儿成纤维细胞电转染法转染条件的确定。由于打靶载体P₁-KV-polyA-P₂中不含有荧光标记基因，故用pCMV-DsRed-Express2摸索、确定电转条件。解冻培养的绒山羊胎儿成纤维细胞在100 mm的皿中用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养，细胞汇合度到达90%时，消化细胞制成单细胞悬液，用Opti-MEM清洗两遍并弃去上清液，Opti-MEM重悬计数。调整细胞浓度至90 µL含有1×10⁶个细胞。加入pCMV-DsRed-Express2质粒（1 µg/µL），将100 µL混合液加入到电击杯中，加入的过程中避免产生气泡，使用NEPA21电击，在1×10⁶个细胞的恒定条件下，对电压和脉冲时间进行优化。参照NEPA21使用说明书，按表8进行转染条件优化。

表8

先吸取10％FBS的培养液10mL加入100mm的细胞培养皿中放到置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的培养箱中平衡；电击结束后，向电击杯中加入500μL预热的含15％FBS 的培养液，轻轻吸打，将细胞混合液加到预先平衡的培养液中，置于培养箱培养，24h后换液。48h后观察细胞状态及荧光表达情况，使用流式细胞仪分析转染效率。

在10μg pCMV-DsRed-Express2质粒的恒定条件下，以不同的电压与脉冲时间组合参数电转，使用流式细胞仪分析。结果表明225V/2.5m的转染条件，转染效率能够达到100％， 48h倒置相差显微镜观察细胞见图13。其中A为普通光照射下拍摄，B为蓝光激发的绿色荧光照片。

根据上面所述优化好的电转条件，利用pCCR5-gRNA4、hCas9和P₁-KV-polyA-P₂三个载体共同转染细胞。同时用pCDsRed2-KV作为对照实验组。

复苏培养的原代细胞在100mm的皿培养汇合度到达90％时，经过两次传代，以便细胞恢复良好的状态和活力。按照优化好的转染条件，待新细胞生长汇合度到达90％时， PBS清洗2-3遍后用0.25％胰蛋白酶消化2min，培养液终止消化，轻轻吹打使细胞悬浮并将细胞收集于15mL离心管中；然后用Opti-MEM清洗两遍并弃去上清液，最后加 80μL Opti-MEM重悬；hCas9质粒5μL(2000ngμL)；pCCR5-gRNA4质粒5μL(200ng/μL；打靶载体P1-KV-polyA-P210μL(100ng/μL，混合，将100μL混合液加入到电击杯中，使用NEPA21电转仪进行电击。然后向电击杯中加入100μL预热的含20％FBS的培养液，轻轻吸打，将细胞转移到含5mL预热培养液的两个60mm培养皿中，置于培养箱培养。对照实验组pCDsRed2-KV质粒10μL(100ng/μLL)。

对转染细胞12h和48h后观察生长状况拍照，结果显示用pCCR5-gRNA4、hCas9 和pP1-KV-polyA-P2三个载体共同转染的细胞生长状态良好(图14A，B)；对照实验组pCDsRed2-KV质粒转染的细胞，红荧光较强，转染效率较高(图14C，D)，对30个视野的统计表明转染效率可以达到100％。

4)单克隆细胞系的筛选。

本实验通过口吸管方法挑选单克隆细胞。预先将20％FBS的培养液加入96孔细胞培养板的每个孔。将转染48h后的细胞，用PBS清洗2-3遍后用0.25％胰蛋白酶消化 2min，用含10％FBS的培养液终止消化，轻轻吹打使细胞悬浮离心收集于15mL离心管中；用培养液悬浮，用玻璃管拉制成可以使单个细胞通过的合适直接口吸管，在显微镜下无菌操作，将单细胞分别接种预先平衡的96孔细胞培养板。置于培养箱培养。待细胞生长铺满皿底后，分别用0.25％胰蛋白酶消化2min，用含10％FBS的培养液终止消化，轻轻吹打使细胞悬浮，将96细胞培养孔板中的每个孔细胞传到24孔细胞培养板的每个孔中继续扩大培养，待每个孔细胞长满时，然后将每个孔的细胞消化回收传到6孔细胞培养板的每个孔中继续培养。6孔细胞培养板的每个孔中细胞长满时，将细胞编号后一半细胞用于基因组DNA的提取；另一半细胞冻存。

定点整合VEGF基因单克隆细胞系的鉴定。

利用表6中的一对特异于外源KAP6.1-VEGF-polyA表达盒的PCR扩增引物，以筛选得到的转基因单克隆细胞系提取的基因组DNA为模板，扩增外源基因。PCR反应体系为LATaqTM II 25μL，上游引物(10uM/L)2μL，下游引物(10uM/L)2μL，模板2μL， d3H2O 19μL。PCR扩增反应条件：95℃5min；95℃30sec，57.5℃30sec，72℃1.5min， 33个循环；72℃10min，4℃30min。预期片段长度1500bp。PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，有阳性片段的为转基因细胞系，目的片段胶回收，将回收产物测序。

通过口吸管法挑选得到80单克隆细胞，通过PCR检测获得1株CCR5位点定点整合VEGF基因的阳性单克隆细胞系D39（图15）。图中M：250 bp DNA marker，C：对照，1为阳性细胞系D39。将PCR产物测序正确，为目的片段序列。得到的CCR5位点定点整合外源KAP6.1-VEGF-polyA表达盒的阳性单克隆细胞系D39可直接用于后续SCNT制备重构胚的供体细胞。

实施例6：CCR5位点定点整合VEGF基因的转基因绒山羊制备、鉴定与外源基因表达检测。通过体细胞核移植方法获得转基因绒山羊需要经过定点整合VEGF基因的核供体细胞准备、卵母细胞的体外成熟、受体母羊的准备、重构胚的制备与移植、胚胎移植羊的术后管理、受孕母羊鉴定、孕期母羊管理、产羔管理、新生羔羊管理、转基因羊鉴定、外源基因表达检测和转基因羊后期管理等过程，其中定点整合外源KAP6.1-VEGF-polyA表达盒的核供体细胞准备、转基因羊鉴定和外源基因表达检测等内容具有创造性，其它内容为常规技术。

1)定点整合VEGF基因的核供体细胞准备。通过体细胞核移植技术获得转基因绒山羊，转基因细胞系的获得至关重要，将用做核供体细胞。将前面筛选出来的VEGF定点整合阳性细胞以不同的梯度接种到二十四孔板中，用含有15％FBS的细胞培养液培养细胞，达到90％汇合度时，用50μL的0.25％胰蛋白酶消化2min，用含450μL的15％胎牛血清的培养液终止消化，轻轻吹打使细胞悬浮，吸取50μL细胞混合液，准备用于核移植。

2)卵母细胞的体外成熟。用生理盐水将从屠宰场取得的卵巢清洗3次，用剪刀剪去多余的脂肪，再清洗3次。采用切割法收集卵母细胞，在显微镜下挑选形态完好，卵丘细胞完整、包裹致密的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)。采集到的COCs用卵母细胞成熟液清洗三遍，38.5℃，5％CO2饱和湿度的条件下成熟培养。18h后，置于含0.1％透明质酸酶的M199溶液中孵育3min，反复轻轻吹打，将成熟卵母细胞表面的卵丘细胞去除，裸卵用成熟液清洗3次，用显微镜挑出带有第一极体的成熟卵母细胞，放入培养箱中备用。

本发明共采集未成熟的卵母细胞3099枚，成熟卵母细胞2206枚，成熟率为71.18％。卵母细胞形态见图16。其中A:未成熟的卵母细胞；B:去掉卵丘细胞的成熟卵母细胞。

3)重构胚的制备。将成熟后的卵母细胞脱去颗粒细胞与核供体细胞放入CCB的滴中，采用盲吸法，在显微操作仪下吸除第一极体，同时吸出处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。再将核供体细胞注射到卵周隙中，并使供体细胞与卵质膜接触。将完成的重构胚胎放入成熟液中清洗三遍，然后放入培养箱培养30min后进行电融合(融合参数为90 V/mm，一次直流脉冲、30μs/次)。将电融合好的重构胚再放培养箱中恢复30min。然后，挑取融合的胚胎统计计数后，置于A231875μM I中激活5分钟，然后再将其放入2mM 6-DMAP培养液中培养4h，之后放到发育液中培养。38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件培养48h后挑选发育到2-8细胞期的胚胎用于移植。

本发明对2206枚成熟的卵母细胞经过融合、激活后获得1465枚重构胚，发育至卵裂期的胚胎747枚。成熟率达到71.2％，融合率达到66.4％，卵裂率达到51％，克隆胚重构及融合过程见图17，图18。

4)受体母羊的准备。九月份成体母羊自然发情，早上试出来的发情母羊随羊

群放牧，晚上继续试情，所有发情母羊记录耳号，并打好标记。单独圈养进行空腹，准备手术。

5)重构胚移植。手术移植前一天对受体母羊禁食，先对手术受体母羊注射麻药鹿眠灵，腹部靠近乳房部剃毛消毒后，用以灭好菌的创布，在腹中线纵线切，拉出子宫角及卵巢，查看排卵点。用移植枪吸取4-5枚2-8细胞的克隆胚胎，移植入有排卵点一侧的输卵管中。结束后向腹腔内注射20mL抗生素同时肌注5mL抗生素。移植完毕后用缝合线进行双层缝合，撒上消炎粉后间断缝合皮肤，静脉注射苏醒药鹿醒灵。

本研究将使用体细胞移植技术得到的2细胞、4细胞和8细胞期胚胎移植到150 只受体母羊输卵管中。

6)受体羊的术后管理与受孕母羊鉴定。受体母羊手术后单独进行饲养，待伤口愈合后，进行试情，观察是否反情。如果两个情期均未返情，则该受体羊可能具有妊娠情况，对其进行B超检查，进一步确定是否怀孕。

7)孕期母羊管理。对已妊娠的受体羊进行集中饲养，并观察其生长发育情况，进入预产期的受体羊进行严密的监控保证其可顺利生产。

8)产羔与新生羔羊管理。刚出生的羔羊进行特殊的看护和管理确保其安全，每月对初生羔羊的体长、体高、胸围和体重进行测量并记录，待羔羊生长至一个月时，采血样进行初步鉴定。

本发明中接受胚胎移植的150只受体母羊，有3只母羊各产羔羊1只，共3只。编号为219029的受体羊在2016年3月2日产羔1只，为1618号，雌性，白色绒毛；编号为313177的受体羊在2016年3月12日产羔1只，为1625号，雌性，带有黑色绒毛；编号为200304的受体羊在2016年3月17日产羔1只，为1652号，雌性，于出生7天后死亡。1618号羔羊和1625号羔羊生长发育正常，存活至今。

在出生后2天测定新生羊生长参数如表9所示，存活的2只羔羊生长良好，图19 为出生后30天的1618号羔羊和出生后30天的1625号羔羊。

表9

9)定点整合VEGF基因的转基因绒山羊鉴定

于新生羔羊出生后30天，在牧场分别采集每只新生羔羊的血液，提取基因组DNA作为模板，使用表6中的鉴定引物，PCR扩增目的片段。预期片段长度1500bp。扩增出目的片段的为定点整合VEGF基因表达盒的绒山羊。PCR反应体系和反应程序与中鉴定转基因细胞系一致。

PCR扩增产物电泳结果表明，3、8泳道在预期1500bp出现目的条带，其模板为通过体细胞核移植产生的转基因雌性羊羔1618号和1625号。12号泳道为以转基因单克隆细胞系D39基因组DNA为模板的阳性对照组C1，13泳道为以无酶水为模板的阴性对照组C2，其他泳道为正常饲养的对照组所生的羊羔，均未出现目的扩增条带(图20)

将3、8泳道PCR产物纯化、测序，序列与预期序列比对一致。说明体细胞核移植受体母羊所产的羊羔1618和1625为CCR5位点定点整合外源KAP6.1-VEGF-polyA 表达盒的转基因绒山羊。

10)定点整合VEGF基因的转基因绒山羊皮肤组织的实时定量PCR检测。

于羔羊出生180天，在牧场分别剪取新生羔羊耳尖皮肤组织。采集耳尖皮肤时，耳尖剃毛，碘酒消毒，70％酒精脱碘，无菌手术剪剪取整个耳尖(约2～3cm2)置37℃，含青霉素(100IU/ml)、链霉素(100IU/ml)生理盐水中，1～2h内带回实验室。羔羊耳尖伤口用消炎粉处理。提取绒山羊皮肤组织总RNA，反转录合成cDNA，定量PCR检测转基因绒山羊皮肤组织和对照组绒山羊皮肤组织VEGF基因的表达。

VEGF基因表达检测选取GAPDH作为内参基因，所用引物为表7所示。反应体系为SYBR Premix Ex Taq II(2×)10μL，Forward Primer 0.4μL，Reverse Primer0.4μL，cDNA模板2.0μL，RNase Free H2O 7.2μL。反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃31s，40个循环；从60℃升温至95℃绘制溶解曲线。

定量PCR结果使用2-△△Ct方法计算相对表达量，实验重复3次。并使用SPASS 软件进行显著性差异分析，其中**0.01<p＜0.05为差异显著，***p＜0.01差异极其显著。比对VEGF基因mRNA丰度，转基因绒山羊皮肤组织中VEGF基因过表达。

通过实时定量PCR检测对照组(NT)、1618号和1625号羔羊皮肤组织中VEGF 基因mRNA的表达丰度如图21所示，1618和1625两只新生羊皮肤组织中VEGF基因 mRNA表达量与NT皮肤组织中的表达量相比显著增高(p＜0.01)。表明外源VEGF基因在CCR5位点得到高表达。

11)新生转基因绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达检测。

如前面所述，于羔羊出生180天，在牧场分别剪取新生羔羊耳尖皮肤组织，按照组织蛋白抽提液试剂盒说明提取总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。

将经过定量和稀释到同一浓度的新生羔羊耳尖皮肤组织总蛋白样品进行WesternBlot检测，SDS-PAGE电泳分离后转膜，脱脂奶粉封闭，抗VEGF抗体(Abcam)为一抗孵育4℃孵育过夜，goat抗rat二抗(Abcam)室温℃孵育1h，ECL试剂盒发光，放入Tanon 5200全自动化学发光成像分析系统中照相。α-tublin为内参。

Western Blot检测NT、1618号和1625号绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达量明显升高。如图22所示，相比NT，1618和1625定点整合绒山羊皮肤组织中VEGF蛋白表达量较于NT的表达量增高(p＜0.01)。新生绒山羊皮肤组织中VEGF基因在蛋白水平得到高表达。

12)转基因羊的管理。采用放牧式时注意抓好秋膘，做好越冬管理工作，做好抓绒、修蹄、去湿、免疫和驱虫等日常管理工作，完善各项记录。采用网围栏机械隔离，防止转基因动物在饲养时与同类野生动物交配。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古大学

<120> 一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法

<130> 一种基于CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9553

<212> DNA

<213> hCas9质粒

<400> 1

atggtggtgt cgaagtactt gaaggctgca ggcgcgccca agttggtcag agtaaacaag 60

tggataatgt tttctgcctg ctccctgatg ggcttatccc tgtgcttatt gtaagcagaa 120

agcaccttat cgaggttagc gtcggcgagg atcactcttt tggagaattc gcttatttgc 180

tcgatgatct catcaaggta gtgtttgtgt tgttccacga acagctgctt ctgctcatta 240

tcttcgggag accctttgag cttttcatag tggctggcca gatacaagaa attaacgtat 300

ttagagggca gtgccagctc gttacctttc tgcagctcgc ccgcactagc gagcattcgt 360

ttccggccgt tttcaagctc aaagagagag tacttgggaa gcttaatgat gaggtctttt 420

ttgacctctt tatatccttt cgcctcgaga aagtcgatgg ggtttttttc gaagcttgat 480

cgctccatga ttgtgatgcc cagcagttcc ttgacgcttt tgagtttttt agacttccct 540

ttctccactt tggccacaac cagtacactg taagcgactg taggagaatc gaatccgccg 600

tatttcttgg ggtcccaatc ttttttgcgt gcgatcagct tgtcgctgtt ccttttcggg 660

aggatacttt ccttggagaa gcctccggtc tgtacttcgg tctttttaac gatgttcacc 720

tgcggcatgg acaggacctt ccggactgtc gcgaaatccc tacccttgtc ccacacgatt 780

tctcctgttt ctccgtttgt ttcgataagt ggtcgcttcc gaatctctcc attggccagt 840

gtaatctcgg tcttgaaaaa attcataata ttgctgtaaa agaagtactt agcggtggcc 900

ttgcctattt cctgctcaga ctttgcgatc attttcctaa catcgtacac tttatagtct 960

ccgtaaacaa attcagattc aagcttggga tattttttga taagtgcagt gcctaccact 1020

gcattcaggt aggcatcatg cgcatggtgg taattgttga tctctctcac cttataaaac 1080

tgaaagtcct ttctgaaatc tgagaccagc ttagacttca gagtaataac tttcacctct 1140

cgaatcagtt tgtcattttc atcgtacttg gtgttcatgc gtgaatcgag aatttgggcc 1200

acgtgcttgg tgatctggcg tgtctcaaca agctgccttt tgatgaagcc ggctttatcc 1260

aactcagaca ggccacctcg ttcagcctta gtcagattat cgaacttccg ttgtgtgatc 1320

agtttggcgt tcagcagctg ccgccaataa tttttcattt tcttgacaac ttcttctgag 1380

gggacgttat cactcttccc tctattttta tcggatcttg tcaacacttt attatcaata 1440

gaatcatctt tgagaaaaga ctggggcacg atatgatcca cgtcgtagtc ggagagccga 1500

ttgatgtcca gttcctgatc cacgtacatg tccctgccgt tctgcaggta gtacaggtag 1560

agcttctcat tctgaagctg ggtgttttca actgggtgtt ccttaaggat ttgggacccc 1620

agttctttta taccctcttc aatcctcttc atcctttccc tactgttctt ctgtcccttc 1680

tgggtagttt ggttctctcg ggccatctcg ataacgatat tctcgggctt atgccttccc 1740

attactttga cgagttcatc cacgacctta acggtctgca gtattccctt tttgatagct 1800

gggctacctg caagattagc gatgtgctcg tgaagactgt ccccctggcc agaaacttgt 1860

gctttctgga tgtcctcctt aaaggtgaga gagtcatcat ggatcaactg catgaagttc 1920

cggttggcaa atccatcgga cttaagaaaa tccaggattg tctttccact ctgcttgtct 1980

cggatcccat tgatcagttt tcttgacagc cgcccccatc ctgtatatcg gcgcctcttg 2040

agctgtttca tgactttgtc gtcgaagaga tgagcgtaag ttttcaagcg ttcttcaatc 2100

atctccctat cttcaaacaa cgtaagggtg aggacaatgt cctcaagaat gtcctcgttc 2160

tcctcattgt ccaggaagtc cttgtcttta atgattttca ggagatcgtg atacgttccc 2220

agggatgcgt tgaagcgatc ctccactccg ctgatttcaa cagagtcgaa acattcaatc 2280

tttttgaaat agtcttcttt gagctgtttc acggtaactt tccggttcgt cttgaagagg 2340

aggtccacga tagctttctt ctgctctcca gacaggaatg ctggctttct catcccttct 2400

gtgacgtatt tgaccttggt gagctcgtta taaactgtga agtactcgta cagcagagag 2460

tgtttaggaa gcaccttttc gttaggcaga tttttatcaa agttagtcat cctttcgatg 2520

aaggactggg cagaggcccc cttatccacg acttcctcga agttccaggg agtgatggtc 2580

tcttctgatt tgcgagtcat ccacgcgaat ctggaatttc cccgggcgag ggggcctaca 2640

tagtagggta tccgaaatgt gaggattttc tcaatctttt ccctgttatc tttcaaaaag 2700

gggtagaaat cctcttgccg cctgaggata gcgtgcagtt cgcccaggtg aatctggtgg 2760

gggatgcttc cattgtcgaa agtgcgctgt ttgcgcaaca gatcttctct gttaagcttt 2820

accagcagct cctcggtgcc gtccattttt tccaagatgg gcttaataaa tttgtaaaat 2880

tcctcctggc ttgctccgcc gtcaatgtat ccggcgtagc catttttaga ctgatcgaag 2940

aaaatttcct tgtacttctc aggcagttgc tgtctgacaa gggccttcag caaagtcaag 3000

tcttggtggt gctcatcata gcgcttgatc atactagcgc tcagcggagc tttggtgatc 3060

tccgtgttca ctcgcagaat atcactcagc agaatggcgt ctgacaggtt ctttgccgcc 3120

aaaaaaaggt ctgcgtactg gtcgccgatc tgggccagca gattgtcgag atcatcatcg 3180

taggtgtctt tgctcagttg aagcttggca tcttcggcca ggtcgaagtt agatttaaag 3240

ttgggggtca gcccgagtga cagggcgata agattaccaa acaggccgtt cttcttctcc 3300

ccagggagct gtgcgatgag gttttcgagc cgccgggatt tggacagcct agcgctcagg 3360

attgctttgg cgtcaactcc ggatgcgttg atcgggttct cttcgaaaag ctgattgtaa 3420

gtctgaacca gttggataaa gagtttgtcg acatcgctgt tgtctgggtt caggtccccc 3480

tcgatgagga agtgtccccg aaatttgatc atatgcgcca gcgcgagata gatcaaccgc 3540

aagtcagcct tatcagtact gtctacaagc ttcttcctca gatgatatat ggttgggtac 3600

ttttcatggt acgccacctc gtccacgata ttgccaaaga ttgggtggcg ctcgtgcttt 3660

ttatcctcct ccaccaaaaa ggactcctcc agcctatgga agaaagagtc atccacctta 3720

gccatctcat tactaaagat ctcctgcagg tagcagatcc gattctttct gcgggtatat 3780

ctgcgccgtg ctgttctttt gagccgcgtg gcttcggccg tctccccgga gtcgaacagg 3840

agggcgccaa tgaggttctt ctttatgctg tggcgatcgg tattgcccag aactttgaat 3900

tttttgctcg gcaccttgta ctcgtccgta atgacggccc agccgacgct gtttgtgccg 3960

atatcgagcc caatggagta cttcttgtcc atggtggcaa gggttcgatc ctctagagtc 4020

cggaggctgg atcggtcccg gtgtcttcta tggaggtcaa aacagcgtgg atggcgtctc 4080

caggcgatct gacggttcac taaacgagct ctgcttatat agacctccca ccgtacacgc 4140

ctaccgccca tttgcgtcaa tggggcggag ttgttacgac attttggaaa gtcccgttga 4200

ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg tcaatggggt ggagacttgg aaatccccgt 4260

gagtcaaacc gctatccacg cccattgatg tactgccaaa accgcatcac catggtaata 4320

gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa gtaggaaagt cccataaggt catgtactgg 4380

gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca ttgacgtcaa tagggggcgt acttggcata 4440

tgatacactt gatgtactgc caagtgggca gtttaccgta aatactccac ccattgacgt 4500

caatggaaag tccctattgg cgttactatg ggaacatacg tcattattga cgtcaatggg 4560

cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg ccatttaccg taagttatgt aacgcggaac 4620

tccatatatg ggctatgaac taatgacccc gtaattgatt actattaata actagtcaat 4680

aatcaatgtc aacgcgtata tctggcccgt acatcgcgaa gcagcgcaaa acgcctaacc 4740

ctaagcagat tcttcatgca attgtcggtc aagccttgcc ttgttgtagc ttaaattttg 4800

ctcgcgcact actcagcgac ctccaacaca caagcaggga gcagatactg gcttaactat 4860

gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccataggg gatcgggaga tctcccgatc 4920

cgtcgacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 4980

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 5040

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 5100

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 5160

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 5220

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 5280

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 5340

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 5400

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 5460

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 5520

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 5580

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 5640

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 5700

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 5760

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 5820

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 5880

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 5940

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 6000

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 6060

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 6120

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 6180

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 6240

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 6300

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 6360

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 6420

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 6480

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 6540

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 6600

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 6660

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 6720

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 6780

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 6840

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 6900

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 6960

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 7020

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 7080

accatgatta cgccaagctc tagctagagg tcgacggtat acagacatga taagatacat 7140

tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 7200

ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttggggtggg 7260

cgaagaactc cagcatgaga tccccgcgct ggaggatcat ccagccggcg tcccggaaaa 7320

cgattccgaa gcccaacctt tcatagaagg cggcggtgga atcgaaatct cgtgatggca 7380

ggttgggcgt cgcttggtcg gtcatttcgc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg 7440

tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 7500

aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct 7560

atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg 7620

ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg 7680

ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc 7740

tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg 7800

atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc 7860

cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga 7920

tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg 7980

agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc 8040

tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc 8100

gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag 8160

ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc 8220

atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagatccga aaatggatat acaagctccc 8280

gggagctttt tgcaaaagcc taggcctcca aaaaagcctc ctcactactt ctggaatagc 8340

tcagaggcag aggcggcctc ggcctctgca taaataaaaa aaattagtca gccatggggc 8400

ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact 8460

atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg 8520

gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 8580

ggggagcctg gggactttcc acaccctaac tgacacacat tccacagaat taattcgcgt 8640

taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt 8700

ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 8760

cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 8820

gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac 8880

taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg 8940

tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag 9000

cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt 9060

ggggataccc cctagagccc cagctgcgca gatctgctat ggcagggcct gccgccccga 9120

cgttggctgc gagccctggg ccttcacccg aacttggggg gtggggtggg gaaaaggaag 9180

aaacgcgggc gtattggccc caatggggtc tcggtggggt atcgacagag tgccagccct 9240

gggaccgaac cccgcgttta tgaacaaacg acccaacacc cgtgcgtttt attctgtctt 9300

tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc ggtattgtct ccttccgtgt ttcagttagc 9360

ctcccccgtt taaactcatt actaaccggt agggatcgaa ccctttcaca ccttcctctt 9420

cttcttgggg tcagccctgc tgtctccacc gagctgagag aggtcgattc ttgtttcata 9480

gagccccgta attgactgat gaatcagtgt ggcgtccagg acctcctttg tagaggtgta 9540

ccgctttctg tct 9553

<210> 2

<211> 3868

<212> DNA

<213> CCR5基因组序列

<400> 2

ccaactcaga agaaactgca tttcctactt ttatgctgtc tatatgtttg acttgcacag 60

ctcagctggt cagaggagtt gagacatccg ttcccctacg agaatctctc tcggtaagtt 120

ctctctcagc taactttgcc tatttcttag cgcagcttga gtgatgagta aaagccttta 180

caggaaacca tagaaaacat cagaaataca ccaggcgttc actgaactat cttaaactat 240

aatctttaag taaggaaaaa gttaagagtt tagaatcagt ttcagactgt gataacatca 300

aagatacaaa acaggattat gaatggaaga ctataaaaag ccctcacctt tcaaaagaaa 360

gatattttcg gagaataatt actggccaaa actttgacag acatgatctt ttggttagga 420

gaaataaaac ctcctcagca ggatgccctc tgaacatgtg cccaaccaca agctgtgtct 480

aagtctcctt ttatttctgc caaggaaaga aggaagcctg aaaattggcc aaattaataa 540

caagttataa atatcaaatc aactttcata gcaaatctag ttgattcttt ttctggctca 600

gaatttaaag gagagatttt tctgtgagct tttcccagct gcttaatctg aggtactggg 660

agcttgagtc tcacagggac taattagaga aaattctcag tcaagcggtg ggacctaaat 720

agaccaggca agttagtggg ttgcgaagga acaaagctaa tacaggatgt atgctaggag 780

atgaaacact gtccacttga ccacttctta tgtattaggg gagggggtcc ttaatcatag 840

cagctcagaa actacaaaca caaacttcag agaaaatgtg agaatgggaa tcgggacttg 900

acaactggct gctggctcct atgaccttct ccagggactc gggcatcagt ctgtctcatt 960

ttgactacat caaggctcca ggctgacaat cctgcttgta gttctctcac caaggagtga 1020

aagacaggga ccacagcaga taagttacag tcagcactgc ctgccttcaa aattagttgc 1080

ttactccctg tgggtctttg gggaagttac tcatcttctc tgtgctctga ggttcttatt 1140

tgcaaaacgg ggacaataaa cctgacctgc ctcactgagt caccttgagg attaactgaa 1200

tgaatgaagt gaagcttaga acagtgctta gcaagcaaag tgccctagag aactgttcat 1260

tatcaccagc aagcccctaa tgatgctatg tgtaagctaa ctccagggaa tgacagtaag 1320

aacagacacg gttggacagt tcctgaccca gtttctggac attgttatca cagcttcatt 1380

cactgcacgt ggctacacaa catccaattt tatttggtga gatgattgat gctctccgtc 1440

tagtaaacag agtgttagtc gctcaggcgt gtctgactct tatgacccca tggattgtag 1500

cccaccaggc tccactgacc atggaattct ccaggcaaga atactggagt gggttgccat 1560

ttccttctcc aggggatctt cccaacccag ggatcgaatc caggtctcct gcattgcagg 1620

cagattcttt accatctgag ccaccacgga aacccaaagc agagaagcta gcagcaaact 1680

aatataaaaa gttcactgtt tgacaaaaaa aaggacttca gttaaatgta gaaatctacg 1740

tatcaatttt taaaacctac ttaagtatat aaaacggttt gcattcatga tggactgcta 1800

aggacattct aggactttat aaaacacctt ttctttattt acagagtcaa gcaaaatgga 1860

ttatcaaaca tcaactcccc tctatgacat tgattatggg atgtcagagc catgccaaaa 1920

aatcaacgtg aggcaaattg caggccagct cttgccccca ctctactcgc tggtgttcat 1980

ctttggtttt gtgggcaact tgctggttgt cctcatcctg ataaactgca aaaagctgaa 2040

gagcatgact gacatctatc tgctcaactt ggccatctct gacctacttt tcatcatcac 2100

tatcccattc tgggctcact acgctgcaga ccagtgggta tttggaaata caatgtgcca 2160

gttattcaca gggttctatt tcattggtta ttttggtgga atcttcttca tcatcctctt 2220

gacaatcgat aggtacctgg ctatcgttca tgctgtgttt gctttaaaag ccagaacagt 2280

cacctttggg gcagtgacaa gtggggtcac gtgggtggtg gctatgtttg cctctctccc 2340

aggaattatc tttaccaaat cccaaaagga aggctctcgt catacgtgca gcccacattt 2400

cccatccaat cagtatcatt tctggaagag tttccaaact ttaaagatag tcatcttggg 2460

gctggtgctg cctctgcttg tcatgatcgt ctgctactcg ggaatcataa aaaccctgct 2520

ccagtgtcgc agcgagaaga agaagcacaa ggctgtgagg ctcatcttcg tgatcatgat 2580

tgtctacttt ctcttctggg ctccctacaa catcgtcctc ctcctgagca ccttccagga 2640

attcttcggc ttgaataact gcagtgactc taacaggctg gaccaagcca tgcaggtgac 2700

agagaccctg gggatgacgc actgctgcat caaccccatc atctatgcct tcgtggggga 2760

gaagttccga aactatctcc tacggttctt ccgaaagtac atcgccagcc gcttctgcaa 2820

aggctgtcca gtcttccagg gagaggctcc agagcgagtg agctccgttt acacacgatc 2880

cacgggagaa caggaagtct ctgttggctt gtgatctgac tcagttcata tatgcaaact 2940

gtgggggagc agttcaagag gaaattactg tcaacaaggg tttaagattc atccatcaat 3000

ttggcatcag ctctaaatat attagatatt tcaagcccat caattctaga aagccaaagc 3060

aaaacacgct gatgaaatag caatcttctc accgcccccc tccacataca acaatttatt 3120

ggcaagctct cccctcacta caaaaggttc aatgtttaaa aaaaaaaatc ctcagagaat 3180

tattaattcc tgagtttggt tacctgaaca ggaataacaa aatgaactga ggaaagtatt 3240

gtatagtttc ttatctgggt agggcaatag ccaggttgca aatgtgatta aaataggtcc 3300

ttctcttgcc atggggagaa aagacatgcc ggtgatcaga taaggaatga catcttccat 3360

gtgggatctc tcccaaaagg tacgttaata agttccacag acactgatgc caaggaagag 3420

ccctgtggtc tgctgagagc tgggaaggct tcttcgcaga aaaggtactg gaggccaatg 3480

gtctgtcagc ggagaaggaa gctgagctcc aggatgcagg cactgcacag gcaaaacttg 3540

gctgtgggga gacaggcact ggctggggga gctcctggga ggaaaaatga ggctggtgca 3600

tgagaaaact ggacggcatt gctcatcaaa ttcagagagc agagtgggga gccctggcca 3660

atgttgcaga aagctcattc tgtaaccaaa ggatggcctg gaaaggtgag cattcaggtc 3720

aaggagacca gcaacaatgt gatcaagtga ggaggctcca ctaaagttga agccagagat 3780

gggaaggatg gataccacct cacagcactg aggatgagag ccagcagaat ttggggtgga 3840

tttggcttgg cagtgaaggg cagagagg 3868

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA靶位点

<400> 3

gtgtcgcagc gagaagaaga 20

<210> 4

<211> 455

<212> DNA

<213> gRNA质粒

<400> 4

tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60

gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120

gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180

tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240

gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300

tggaaaggac gaaacaccgt cgtgggggag aagttccgag ttttagagct agaaatagca 360

agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg gcaccgagtc ggtgcttttt 420

ttctagaccc agctttcttg tacaaagttg gcatt 455

<210> 5

<211> 1202

<212> DNA

<213> 上游同源臂序列

<400> 5

agcaagcccc taatgatgct atgtgtaagc taactccagg gaatgacagc ttaagaacag 60

acacggttgg acagttcctg acccagtttc tggacatcgt tatcacagct tcattcactg 120

cacgtggcta cacaacatcc aattttattt ggtgagatga ttgatgctct ccgtctagta 180

aacagagtgt tagtcgctca ggcgtgtctg actcttatga ccccatggat tgtagcccac 240

caggctccac tgaccatgga attctccagg caagaatact ggagtgggtt gccatttcct 300

tctccagggg atcttcccaa cccagggatt gaatccaggt ctcctgcatt gcaggcagat 360

tctttaccat ctgagccacc acggaaaccc aaagcagaga agctagcagc aaactaatat 420

aaaaagttca ctgtttgaca aaaaaaagga cttcagttaa atgtagaaat ctatgtatca 480

atttttaaaa cctacttaag tatataaaat ggtttgcatt catgatggac tgctaaggac 540

attctaggac tttataaaac accttttctt tatttacaga gtcaagcaaa atggattatc 600

aaacatcaac tcccctctat gacattgatt atgggatgtc agagccatgc caaaaaatca 660

acgtgaggca aattgcaggc cagctcttgc ccccactcta ctcgctggtg ttcatctttg 720

gttttgtggg caacttgctg gttgtcctca tcctgataaa ctgcaaaaag ctgaagagca 780

tgactgacat ctatctgctc aacttggcca tctctgacct acttttcatc atcactatcc 840

cattctgggc tcactacgct gcagaccagt gggtatttgg aaatacaatg tgccagttat 900

tcacagggtt ctatttcatt ggttattttg gtggaatctt cttcatcatc ctcttgacaa 960

tcgataggta cctggctatc gttcatgctg tgtttgcttt aaaagccaga acagtcacct 1020

ttggggcagt gacaagtggg gtcacgtggg tggtggctat gtttgcctct ctcccaggaa 1080

ttatctttac caaatcccaa aaggaaggct ctcgtcatac gtgcagccca catttcccat 1140

ccaatcagta tcatttctgg aagagtttcc aaactttaaa gatagtcatc ttggggctgg 1200

tg 1202

<210> 6

<211> 1081

<212> DNA

<213> 下游同源臂序列

<400> 6

agcacaaggc tgtgaggctc atcttcgtga tcatgattgt ctactttctc ttctgggctc 60

cctacaacat cgtcctcctc ctgagcacct tccaggaatt cttcggcttg aataactgca 120

gtgactctaa caggctggac caagccatgc aggtgacaga gaccctgggg atgacgcact 180

gctgcatcaa ccccatcatc tatgccttcg tgggggagaa gttccgaaac tatctcctac 240

ggttcttccg aaagtacatc gccagccgct tctgcaaagg ctgtccagtc ttccagggag 300

aggctccaga gcgagtgagc tccgtttaca cacgatccac gggagaacag gaagtctctg 360

ttggcttgtg atctgactca gctcatatat gcaaactgtg ggggagcagt tcaagaggaa 420

attactgtca acaagggttt aagattcatc catcaatttg gcatcagctc taaatatatt 480

agatatttca agcccatcaa ttctagaaag ccaaagcaaa acacgctgat gaaatagcaa 540

tcttctcacc gcccccctcc acatacaaca atttattggc aagctctccc ctcactacaa 600

aaggttcaat gtttaaaaaa aaaaatcctc agagaattat taattcctga gtttggttac 660

ctgaacagga ataacaaaat gaactgagga aagtattgta tagtttctta tctgggtagg 720

gcaatagcca ggttgcaaat gtgattaaaa taggtccttc tcttgccatg gggagaaaag 780

acatgccggt gatcagataa ggaatgacat cttccatgtg ggatctctcc caaaaggtac 840

gttaataagt tccacagaca ctgatgccaa ggaagagccc tgtggtctgc tgagagctgg 900

gaaggcttct tcgcagaaaa ggtactggag gccaatggtc tgtcagcgga gaaggaagct 960

gagctccagg atgcaggcac tgcacaggca aaacttggct gtggggagac aggcactggc 1020

tgggggagct cctgggagga aaaatgaggc tggtgcatga gaaaactgga cggcattgct 1080

c 1081

<210> 7

<211> 4034

<212> DNA

<213> VEGF同源重组载体序列

<400> 7

tttatttggt gagatgattg atgctctccg tctagtaaac agagtgttag tcgctcaggc 60

gtgtctgact cttatgaccc catggattgt agcccaccag gctccactga ccatggaatt 120

ctccaggcaa gaatactgga gtgggttgcc atttccttct ccaggggatc ttcccaaccc 180

agggattgaa tccaggtctc ctgcattgca ggcagattct ttaccatctg agccaccacg 240

gaaacccaaa gcagagaagc tagcagcaaa ctaatataaa aagttcactg tttgacaaaa 300

aaaaggactt cagttaaatg tagaaatcta tgtatcaatt tttaaaacct acttaagtat 360

ataaaatggt ttgcattcat gatggactgc taaggacatt ctaggacttt ataaaacacc 420

ttttctttat ttacagagtc aagcaaaatg gattatcaaa catcaactcc cctctatgac 480

attgattatg ggatgtcaga gccatgccaa aaaatcaacg tgaggcaaat tgcaggccag 540

ctcttgcccc cactctactc gctggtgttc atctttggtt ttgtgggcaa cttgctggtt 600

gtcctcatcc tgataaactg caaaaagctg aagagcatga ctgacatcta tctgctcaac 660

ttggccatct ctgacctact tttcatcatc actatcccat tctgggctca ctacgctgca 720

gaccagtggg tatttggaaa tacaatgtgc cagttattca cagggttcta tttcattggt 780

tattttggtg gaatcttctt catcatcctc ttgacaatcg ataggtacct ggctatcgtt 840

catgctgtgt ttgctttaaa agccagaaca gtcacctttg gggcagtgac aagtggggtc 900

acgtgggtgg tggctatgtt tgcctctctc ccaggaatta tctttaccaa atcccaaaag 960

gaaggctctc gtcatacgtg cagcccacat ttcccatcca atcagtatca tttctggaag 1020

agtttccaaa ctttaaagat agtcatcttg gggctggtgg gatcctctag agattaatct 1080

gcagttcatg gggtcactaa gagtcgggca tggctgagcg acttcacttt catgtatcac 1140

tttcatgcat tggagaagga aatggcaacg cactccagtg ttcttgcctg gagaatccca 1200

gggctggggg agcctggtgc actgccatct ctggggtcgc acagagtcgg acatgactga 1260

agagacttag cagcagcagt agcagcatgt tgataaggga cttggtttag cacattaata 1320

aacataaata tgttagtata ttggatattt tcttagaata taaatctaac actaatgaac 1380

agactagttt gtataactgt atattcaatt tagaaaaaca agtggagaaa tcagatttca 1440

agaaataact cctttttgca gtccttcaat agaaattgag cataaatgtg aattagtcat 1500

tggcatagac agaaaaatat aatgcatttt gctcagactt ggtttactgg aaactttaac 1560

tggttggatt atgatcaaca tcatgggaat aaaagataca ttgtagtttc aatataggaa 1620

agaaactgaa tcactgaaga agataatttg gatcaagaag ataagaatct ttgagtaaaa 1680

aggagttgtt agtcttaaga aaaaaatttt aacgtttggt gaaacaaact gaggtcaaga 1740

gcaaataaga ttaagaccaa caaatatatt tctcactata ctgaaggtgc taggtggtta 1800

aaataaaatg tgtgatctgg gacaggactg tgtaggtgtg agtctgcatc tcctctcatt 1860

caattcctta actggataag aggaatctaa actgagatgt caacacagca agcctgctga 1920

atttctctga ggtttcatct ttggttgtga acaacaagct aattagtcca gtcataaagt 1980

tagccaatgg catgaaggtg tggtgggtca cacccacact gagagcatat aaaaggccct 2040

ctgcagggag aaatgtccac actcaagtga cacttctact ctaattctct acccgagaac 2100

aacctcaaca agcaacacct cctagagcaa tcgtcgacat gaactttctg ctctcttggg 2160

tgcattggag ccttgccttg ctgctctacc ttcaccatgc caagtggtcc caggctgcac 2220

ccatggcaga aggagggcag aaaccccatg aagtgatgaa gttcatggat gtctaccagc 2280

gcagcttctg ccgtcccatt gagaccctgg tggacatctt ccaggagtac ccagatgaga 2340

ttgagttcat tttcaagccg tcctgtgtgc ccctgatgcg gtgcgggggc tgctgtaatg 2400

acgaaagtct ggagtgtgtg cccactgagg agtccaacat caccatgcag attatgcgga 2460

tcaaacctca ccaaagccag cacataggag agatgagttt cctacagcat aacaaatgtg 2520

aatgcagacc aaagaaagat aaagcaaggc aagaaaatcc ctgtgggcct tgctcagagc 2580

ggagaaagca tttgtttgta caagatccgc agacgtgtaa atgttcctgc aaaaacacag 2640

actcgcgttg caaggcgagg cagcttgagt taaacgaacg tacttgcaga tgtgacaagc 2700

cgaggcggtg agcatgcaag cttctgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 2760

ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 2820

tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 2880

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 2940

ctctatgggt accagcacaa ggctgtgagg ctcatcttcg tgatcatgat tgtctacttt 3000

ctcttctggg ctccctacaa catcgtcctc ctcctgagca ccttccagga attcttcggc 3060

ttgaataact gcagtgactc taacaggctg gaccaagcca tgcaggtgac agagaccctg 3120

gggatgacgc actgctgcat caaccccatc atctatgcct tcgtggggga gaagttccga 3180

aactatctcc tacggttctt ccgaaagtac atcgccagcc gcttctgcaa aggctgtcca 3240

gtcttccagg gagaggctcc agagcgagtg agctccgttt acacacgatc cacgggagaa 3300

caggaagtct ctgttggctt gtgatctgac tcagctcata tatgcaaact gtgggggagc 3360

agttcaagag gaaattactg tcaacaaggg tttaagattc atccatcaat ttggcatcag 3420

ctctaaatat attagatatt tcaagcccat caattctaga aagccaaagc aaaacacgct 3480

gatgaaatag caatcttctc accgcccccc tccacataca acaatttatt ggcaagctct 3540

cccctcacta caaaaggttc aatgtttaaa aaaaaaaatc ctcagagaat tattaattcc 3600

tgagtttggt tacctgaaca ggaataacaa aatgaactga ggaaagtatt gtatagtttc 3660

ttatctgggt agggcaatag ccaggttgca aatgtgatta aaataggtcc ttctcttgcc 3720

atggggagaa aagacatgcc ggtgatcaga taaggaatga catcttccat gtgggatctc 3780

tcccaaaagg tacgttaata agttccacag acactgatgc caaggaagag ccctgtggtc 3840

tgctgagagc tgggaaggct tcttcgcaga aaaggtactg gaggccaatg gtctgtcagc 3900

ggagaaggaa gctgagctcc aggatgcagg cactgcacag gcaaaacttg gctgtgggga 3960

gacaggcact ggctggggga gctcctggga ggaaaaatga ggctggtgca tgagaaaact 4020

ggacggcatt gctc 4034

<210> 8

<211> 1426

<212> DNA

<213> 上游检测测序结果

<400> 8

agcaagcccc taatgatgct atgtgtaagc taactccagg gaatgacagc ttaagaacag 60

acacggttgg acagttcctg acccagtttc tggacatcgt tatcacagct tcattcactg 120

cacgtggcta cacaacatcc aattttattt ggtgagatga ttgatgctct ccgtctagta 180

aacagagtgt tagtcgctca ggcgtgtctg actcttatga ccccatggat tgtagcccac 240

caggctccac tgaccatgga attctccagg caagaatact ggagtgggtt gccatttcct 300

tctccagggg atcttcccaa cccagggatt gaatccaggt ctcctgcatt gcaggcagat 360

tctttaccat ctgagccacc acggaaaccc aaagcagaga agctagcagc aaactaatat 420

aaaaagttca ctgtttgaca aaaaaaagga cttcagttaa atgtagaaat ctatgtatca 480

atttttaaaa cctacttaag tatataaaat ggtttgcatt catgatggac tgctaaggac 540

attctaggac tttataaaac accttttctt tatttacaga gtcaagcaaa atggattatc 600

aaacatcaac tcccctctat gacattgatt atgggatgtc agagccatgc caaaaaatca 660

acgtgaggca aattgcaggc cagctcttgc ccccactcta ctcgctggtg ttcatctttg 720

gttttgtggg caacttgctg gttgtcctca tcctgataaa ctgcaaaaag ctgaagagca 780

tgactgacat ctatctgctc aacttggcca tctctgacct acttttcatc atcactatcc 840

cattctgggc tcactacgct gcagaccagt gggtatttgg aaatacaatg tgccagttat 900

tcacagggtt ctatttcatt ggttattttg gtggaatctt cttcatcatc ctcttgacaa 960

tcgataggta cctggctatc gttcatgctg tgtttgcttt aaaagccaga acagtcacct 1020

ttggggcagt gacaagtggg gtcacgtggg tggtggctat gtttgcctct ctcccaggaa 1080

ttatctttac caaatcccaa aaggaaggct ctcgtcatac gtgcagccca catttcccat 1140

ccaatcagta tcatttctgg aagagtttcc aaactttaaa gatagtcatc ttggggctgg 1200

tgggatcctc tagagattaa tctgcagttc atggggtcac taagagtcgg gcatggctga 1260

gcgacttcac tttcatgtat cactttcatg cattggagaa ggaaatggca acgcactcca 1320

gtgttcttgc ctggagaatc ccagggctgg gggagcctgg tgcactgcca tctctggggt 1380

cgcacagagt cggacatgac tgaagagact tagcagcagc agtagc 1426

<210> 9

<211> 497

<212> DNA

<213> SRY基因序列

<400> 9

cggtggtaca gcaacaaaat actttcgcct ttgggaaaac ctcttccttg tgcacagaca 60

atcatagtgc aaatgatcag tgtgaaaggg gcgaaaatgt tacggagagc agccaggacc 120

acgtcaagcg acccatgaac gccttcattg tgtggtctcg tgaacgaaga cgaaaggtgg 180

ctctagagaa tcccaaattg caaaactcag agatcagcaa gcagctggga tacgagtgga 240

aaaggcttac agatgctgaa aagcgcccat tctttgagga ggcacagaga ctactagcta 300

tacaccgaga caaatacccg ggctataaat atcgacctcg tcggaaagcc aagaggccac 360

agaaatcgct tgatgcagac tctccaatac tatgcaacca gatggatgta gagacattgc 420

accccttcac atacagggac gattgtgcca agaccacaca ctcacaaatg gaaagccaat 480

tatgccgctc acagtcc 497

Claims (4)

1.一种基于CRISPR-Cas9系统介导绒山羊VEGF基因定点敲入的方法，其特征在于，其是根据绒山羊的CCR5基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体和VEGF同源重组载体，然后将优化后的CRISPR-Cas9载体和上述构建的gRNA表达载体及VEGF同源重组载体共同转入绒山羊胎儿成纤维细胞中，获得VEGF基因定点敲入的细胞；

所述绒山羊为阿尔巴斯绒山羊；

靶位点在安全位点CCR5基因的第2外显子上，gRNA靶序列为5’-GTCTTCTTCTCGCTGCGACAC-3’；

所述CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述gRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述VEGF同源重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.权利要求1所述方法获得的绒山羊VEGF基因定点敲入的细胞系。

3.权利要求1所述方法在生产VEGF基因定点敲入的克隆绒山羊中的应用，所述绒山羊为阿尔巴斯绒山羊。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，绒山羊VEGF基因定点敲入的细胞为核移植供体细胞，离体的绒山羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得绒山羊克隆胚胎，然后将克隆胚胎通过胚胎移植技术移入绒山羊子宫内妊娠，获得VEGF基因定点敲入的绒山羊。

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