CN109811008A - CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是根据小鼠FGF5基因序列，构建基于CRISPR‑Cas9系统的sgRNA表达载体，将sgRNA和Cas9 质粒混合物对受精卵原核注射，胚胎移植，品系基因鉴定，得到基因突变鼠，并pcr测序，确认最终得到遗传性小鼠突变模型。本发明构建的CRISPR‑Cas9介导的打靶载体为小鼠FGF5基因的敲除提供了一种简便快速安全的途径，该方法实现了不添加任何筛选标记即可筛选定点整合外源基因细胞系，大大提高了转基因动物的安全性，对小鼠的遗传育种具有重要价值。

Description

CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是细菌、古细菌通过长期的进化，自我产生的一种有效抵御外源DNA入侵的适应性免疫。而人类对Ⅱ型CRISPR/Cas 系统的改造使其成为继锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)和TALEN核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases，TALENs)以来的另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术，该系统中成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）转录出的mRNA(CRISPR RNA)及CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas proteins）人为改造成sgRNA（small guide RNA）及Cas9蛋白。CRISPR/Cas9系统通过sgRNA识别靶序列并引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，使DNA发生双链断裂(DNA double-strand break，DSB)，断裂的DNA为防止被降解会自动启动内源性修复机制，其中同源重组（Homologous recombination，HR）修复机制以及修复模板存在的条件下，可以实现定点单个碱基或者长片段的插入、删除或者突变，从而完成基因的敲入与敲除。

20世纪30年代，科学家发现大脑和垂体的组织提取物中存在一种能促进成纤维细胞生长的活性物质，该物质直到到70年代才被分离提纯，根据其生物学功能，这种物质被命名为成纤维细胞生长因子。到目前为止已经鉴定出23种人或鼠的FGFs，其中18个哺乳动物FGFs按照其序列的同源进化关系分成6个亚家族：FGF1和FGF2；FGF3，FGF7，FGF10；FGF22；FGF4，FGF5，FGF6；FGF8，FGF17，FGF18；FGF9，FGF16，FGF20；FGF19，FGF21，FGF23。FGF11~FGF14也与其它的FGFs序列具有髙度的同源性，但是目前还没有找到该因子相应的受体，故没有对其进行分类。FGF15是人类FGF19同源的鼠源因子。FGFs作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。

生长因子5（Fibroblast growth factor 5，FGF5）是FGF基因家族中的一个成员，具有与其他成员类似的基因结构，包括三个外显子和两个内含子，翻译后可剪接成两种蛋白产物，FGF5S较短，不包括第二个外显子，FGF5较长，包括三个外显子。

利用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠FGF5基因的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法，其是根据小鼠的FGF5基因序列(Gene ID 14176)，构建基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体，将sgRNA和Cas9质粒混合物对受精卵原核注射，胚胎移植，品系基因鉴定，得到基因敲除鼠，并PCR测序,确认最终获得FGF5基因敲除小鼠。

本发明中述及的小鼠包括但不限于CD-1品系小鼠。

前述的方法，sgRNA作用靶位点位于小鼠FGF5基因的第一外显子上。sgRNA作用位点的DNA序列为5’ -GAAGGGCAACCCGCGCCTCC-3’。

前述的方法，所述的CRISPR-Cas9载体（即hCas9质粒)的核苷酸序列如SEQID NO:1所示（hCas9质粒图谱见图1）；所述FGF5-sgRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明进一步提供上述方法在制备FGF5基因敲除的克隆小鼠的应用。该应用是指根据小鼠胎儿成纤维细胞中FGF5基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的FGF5-sgRNA表达载体，将FGF5-sgRNA和Cas9质粒注入小鼠受精卵原核中，再通过胚胎移植技术将注射后的受精卵移入代孕受体，获得的F0代小鼠采用PCR反应和测序这两种方法进行检测，鉴定FGF5基因的敲除情况，确认最终得到的FGF5敲除的遗传性小鼠突变模型。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

1CRISPR-Cas9载体的优化； 2） sgRNA表达载体的构建； 3） CRISPR-Cas9系统中sgRNA的活性检测；4）注射基因的纯化；5）实验用鼠的准备；6）受精卵的采集；7）原核注射；8）胚胎移植；9）FGF5基因敲除F0代小鼠的测序鉴定。

步骤9）中鉴定FGF5敲除的遗传性小鼠突变模型主要采用设计扩增包含两个靶位区域的PCR引物的方法，通过PCR技术扩增靶序列区域的全部序列再对该扩增片段进行测序分析，目的是确定FGF5基因的突变情况。

本实验通过原核显微注射法共得到4只FGF5基因敲除小鼠，突变效率为11.1％。对各突变小鼠的突变类型进一步分析，共发现了4种不同的突变类型，具体突变类型见图4。

本发明具有以下优点。

（一） CRISPR-Cas9基因编辑技术与常规的同源重组技术、TALEN技术和ZFNs技术相比，基因敲除效率显著提高。

（二）通过CRISPR/Cas9获得FGF5基因敲除小鼠模型，在实际应用中方便研究FGF5在小鼠毛囊发育过程中的影响，且该模型可以稳定传代。

（三）通过CRISPR-Cas9系统的介导，实现了不加任何筛选标记即可筛选出FGF5基因敲除的小鼠模型，这是传统同源重组技术、TALEN技术和ZFNs技术无法实现的，很大程度提高了转基因动物的安全性。

附图说明

图1为本发明实施例1中hCas9质粒图谱。

图2为本发明实施例1中sgRNA质粒结构示意图。

图3为本发明实施例3中利用Surveyor突变检测试剂盒检测靶位点的电泳结果；其

中，M:100bpmaker;1: 阳性对照片段；CK+：靶位点检测片段。

图4.FGF5基因敲除小鼠鉴定-测序图。

图5：CRISPR/Cas系统的结构。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例说明书均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW ,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中测序工作由华大基因完成。

实施例1 CRISPR-Cas9载体的优化

对购自北京中原公司的CRISPR-Cas9表达载体进行优化，优化的CRISPR-Cas9载体(即hCas9质粒)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，hCas9质粒图谱见图1。

实施例2 sgRNA表达载体的构建

根据小鼠的FGF5基因序列(Gene ID 14176)，针对FGF5的一号外显子序列设计sgRNA序列，并构建基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体。sgRNA表达载体包括4部分：U6启动子、靶序列、sgRNA骨架和终止信号。其中，sgRNA作用位点的DNA序列如下：5 ’-GAAGGGCAACCCGCGCCTCC-3’(sgRNA靶位点)

利用生物学软件根据sgRNA作用位点(sgRNA1靶位点)设计sgRNA序列，克隆至PMD-19T载体上，转化大肠杆菌，涂板后挑取单菌落，进行菌液PCR，经电泳及测序鉴定，测序正确的单菌落接种于含Amp的LB培养基中，37℃、220rpm过夜揺菌，提取质粒命名为19T-sgRNA-FGF5，并将其作为sgRNA PCR模板备用。

实施例3 靶位点的筛选及切除效率检测

按照小鼠胎儿成纤维细胞转染条件的筛选结果确定最佳转染条件为质粒10ug；电击条件为电压（V）160、脉冲时间（s）5的条件进行FGF5-sgRNA、cas9的转染。根据FGF5-sgRNA、cas9的分子量计算，保证最终转染的sgRNA和cas9的摩尔数要基本相同，sgRNA略多于cas9，并保证总DNA量为10ug，且加入DNA混合溶液不大于10ul。我们将sgRNA浓度稀释为200ng/ul;cas9的浓度稀释为2000ng/ul作为电转反应液。最终以sgRNA5.5ul；cas9 4.5ul，进行转染。

使用Premier 5软件横跨不同靶位点设计的一对PCR引物（如表1），对转染3天后的MEF提基因组作为模板进行PCR反应，PCR反应总体系为50µL：预混La Taq 25µL，上、下游引物（100 mmol·L-1）各2µL，基因组DNA 2µL，灭菌水19µL。PCR反应条件同上。然后2µL PCR产物跑电泳，得到目的条带片段与预期大小相同时，将剩下的PCR产物进行DNA的杂交，杂交体系如下：DNA 18µL，10×La PCR BufferⅡ2µL。DNA的杂交所用到的办法是逐步降温退火法。

表1 靶位点检测引物

根据Surveyor突变检测试剂盒进行突变效率检测。其检测体系为25µL：杂交DNA 20µL，0.15M MgCl₂ Solution 3µL，Surveyor Enhancer S 1 µL，Surveyor Nuclease S 1 µL。检测条件为：42 ºC 1h，最后加入1/10体积的 Stop Solution，通过2％琼脂糖凝胶电泳，观察其预期条带数量及大小，当观察结果与预期相符时再根据电泳图的条带进行灰度分析，从而确定靶位点的切除效率。

实施例4 注射基因的纯化

将PCR反应扩增的FGF5-sgRNA载体和大提的Cas9质粒均采用酚/氯仿/异戊醇抽提法进行纯化，具体操作如下：

向装有待纯化DNA溶液的1.5mL离心管中分别加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，涡旋振荡10s，室温下12000rpm离心15s；

将含有DNA的上层水相小心转移至一个新的1.5mL离心管中，向其中加入等体积的氯仿/异戊醇，涡旋振荡10s，室温下12000rpm离心15s；

向DNA溶液中加入1/10体积的3mol/L的乙酸钠（pH5.2），轻弹离心管壁几次，混匀溶液向离心管中加入等体积冰冷的无水乙醇，涡旋振荡混匀，-20℃条件下静置20min后，室温下12000rpm离心5min，弃上清；

取1mL 70%乙醇沿壁缓缓加入离心管中轻轻漂洗沉淀，室温条件下12000rpm离心5min后，弃上清，晾干DNA沉淀；

加入适量PH7.4的TE缓冲液，溶解DNA；

利用分光光度计测定DNA溶液的浓度及OD值，其中OD值应在1.7～1.9之间确保其纯度，-20℃冰箱保存备用。

根据各个载体FGF5-sgRNA、Cas9的分子量进行计算，保证最终注射时FGF5-sgRNA和Cas9的摩尔数基本相同。稀释各载体浓度，使得最终用于注射的DNA溶液中FGF5-sgRNA载体最终浓度为1.0ng/µL，Cas9质粒最终浓度为3.0ng/µL。

实施例5 实验用鼠的准备

种公鼠的准备

选取8周龄以上的CD-1公鼠，检验其交配能力。选取经过超数排卵的母鼠，每只均与一只公鼠交配，合笼第二天早晨检查母鼠是否有阴道栓，并记录见栓情况。连续两次都不能使母鼠见栓的公鼠，需要将其淘汰。

供体母鼠的准备

选择4~6周龄的母鼠作为超数排卵供体，于17:00左右腹腔注射PMSG 10UI，经过46～48h后再腹腔注射hCG 10UI，超排后的供体母鼠与种公鼠按1：1的比例进行合笼。次日早上检栓，有阴道栓的母鼠将作为受精卵采集的供体备用。

结扎公鼠的准备

选取8周龄以上的CD-1公鼠，对其实施结扎手术，一至两周后，待伤口愈合，且在正式实验之前，使之与性成熟的母鼠反复交配2~3次，能使母鼠产生阴道栓但都不会导致怀孕产仔，则该公鼠结扎成功；如果结扎公鼠与母鼠交配2~3次后，都不能使母鼠产生阴道栓，则应该淘汰该结扎公鼠。

假孕母鼠的准备

选取8~12周龄，体重大约25~35g的母鼠，使母鼠与结扎公鼠按2:1的比例进行交配，出现阴道栓的当天算作假孕的0.5天。假孕0.5天的母鼠可做输卵管胚胎移植，假孕2.5天、3.5天的母鼠可做子宫胚胎移植，较理想的每窝产仔数为9~11只。

实施例6 受精卵的采集

将检栓当天有阴道栓的供体母鼠采用断颈法处死。剪下小鼠的双侧输卵管置于M2液滴中，用镊子在显微镜下将其固定，然后用注射器针头撕开壶腹部，受精卵团随即释放出来。使用移卵管将细胞团移到0.1%的透明质酸酶中，观察到受精卵脱去颗粒细胞后，再用移卵管将受精卵移入到新的M2液滴中终止消化。接着分别捡入三个M2液滴中洗三遍，再分别捡入三个KSOM液滴中洗三遍。最后选取形态良好的受精卵用移卵管移至预先平衡的KSOM培养液中，将其置于培养条件为37℃、5% CO₂的培养箱中培养，为注射做好准备。

实施例7 原核注射

在进行显微注射操作前半小时制作一个注射滴，在35mm培养皿盖中央滴加50µL M2培养液，其上附加一层石蜡油直至没过M2液滴，然后放入培养箱内平衡。此时将持卵针连到气相操作臂上，同时将提前制备好的注射针内加入体积为1μL待注射的载体DNA溶液，然后将注射针连到微量自动注射仪上。将预先平衡好的注射皿置于载物台上，将持卵针和注射针均调至显微镜的视野中央，准备注射。

挑选30～40枚雌雄原核清晰可见的受精卵移入预先平衡好的M2液滴中，置于显微镜下，调至视野清晰，进行原核显微注射，注射结束后，将受精卵从M2液滴中移入新KSOM液滴内，再置于培养条件为37℃、5%CO₂的培养箱中培养30min，最后挑选注射后仍形态良好的受精卵，准备将其移植入代孕母鼠体内。

实施例8 胚胎移植

称量代孕母鼠的体重，对应使用一定剂量的Avertin麻醉当天阴道见栓可用的代孕母鼠，剃掉其背部大腿上侧部位毛发，酒精消毒后，用剪子剪出1cm的开口，轻轻用镊子将卵巢拉出，再用脂肪钳夹住脂肪垫固定卵巢位置，在解剖镜下用镊子轻轻撕开卵巢囊膜，找到输卵管伞口，将提前装入已经注射完的胚胎的移植管小心插入伞口，轻轻将胚胎吹入代孕母鼠输卵管。移植完成后将卵巢及连带组织轻轻放回腹腔内，缝合伤口，消毒处理后将代孕母鼠置于37℃热板上，等待小鼠麻醉苏醒后，将其放回饲养室，同时对移植的受精卵数和移植时间进行记录，大约19天后代孕母鼠分娩产仔，再对分娩时期和产仔数目进行详细记录。

实施例9 FGF5基因敲除F0代小鼠的测序鉴定

根据NCBI上提供的小鼠基因组中FGF5基因的序列，设计出包含FGF5-sgRNA作用靶位点的FGF5基因鉴定引物。采用PCR的方法对F0代小鼠FGF5基因是否敲除进行鉴定。设计的扩增引物序列见表2，PCR反应体系见表3。

表2FGF5敲除小鼠的扩增引物

表3 PCR鉴定体系

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸45s，共设置35个循环；72℃终延伸10min，16℃,5min。

以新生的36只F0代小鼠基因组为模板进行PCR反应，PCR反应产物经胶回收后过夜连接19T载体，转化感受态大肠杆菌，涂平板，培养10~12小时后各挑取20个单克隆测序，测序结果与野生型小鼠FGF5基因序列进行比对，检查突变情况。

序列表

<110> 内蒙古大学

<120> CRISPR-Cas9系统介导的小鼠FGF5基因敲除的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 9553

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

atggtggtgt cgaagtactt gaaggctgca ggcgcgccca agttggtcag agtaaacaag 60

tggataatgt tttctgcctg ctccctgatg ggcttatccc tgtgcttatt gtaagcagaa 120

agcaccttat cgaggttagc gtcggcgagg atcactcttt tggagaattc gcttatttgc 180

tcgatgatct catcaaggta gtgtttgtgt tgttccacga acagctgctt ctgctcatta 240

tcttcgggag accctttgag cttttcatag tggctggcca gatacaagaa attaacgtat 300

ttagagggca gtgccagctc gttacctttc tgcagctcgc ccgcactagc gagcattcgt 360

ttccggccgt tttcaagctc aaagagagag tacttgggaa gcttaatgat gaggtctttt 420

ttgacctctt tatatccttt cgcctcgaga aagtcgatgg ggtttttttc gaagcttgat 480

cgctccatga ttgtgatgcc cagcagttcc ttgacgcttt tgagtttttt agacttccct 540

ttctccactt tggccacaac cagtacactg taagcgactg taggagaatc gaatccgccg 600

tatttcttgg ggtcccaatc ttttttgcgt gcgatcagct tgtcgctgtt ccttttcggg 660

aggatacttt ccttggagaa gcctccggtc tgtacttcgg tctttttaac gatgttcacc 720

tgcggcatgg acaggacctt ccggactgtc gcgaaatccc tacccttgtc ccacacgatt 780

tctcctgttt ctccgtttgt ttcgataagt ggtcgcttcc gaatctctcc attggccagt 840

gtaatctcgg tcttgaaaaa attcataata ttgctgtaaa agaagtactt agcggtggcc 900

ttgcctattt cctgctcaga ctttgcgatc attttcctaa catcgtacac tttatagtct 960

ccgtaaacaa attcagattc aagcttggga tattttttga taagtgcagt gcctaccact 1020

gcattcaggt aggcatcatg cgcatggtgg taattgttga tctctctcac cttataaaac 1080

tgaaagtcct ttctgaaatc tgagaccagc ttagacttca gagtaataac tttcacctct 1140

cgaatcagtt tgtcattttc atcgtacttg gtgttcatgc gtgaatcgag aatttgggcc 1200

acgtgcttgg tgatctggcg tgtctcaaca agctgccttt tgatgaagcc ggctttatcc 1260

aactcagaca ggccacctcg ttcagcctta gtcagattat cgaacttccg ttgtgtgatc 1320

agtttggcgt tcagcagctg ccgccaataa tttttcattt tcttgacaac ttcttctgag 1380

gggacgttat cactcttccc tctattttta tcggatcttg tcaacacttt attatcaata 1440

gaatcatctt tgagaaaaga ctggggcacg atatgatcca cgtcgtagtc ggagagccga 1500

ttgatgtcca gttcctgatc cacgtacatg tccctgccgt tctgcaggta gtacaggtag 1560

agcttctcat tctgaagctg ggtgttttca actgggtgtt ccttaaggat ttgggacccc 1620

agttctttta taccctcttc aatcctcttc atcctttccc tactgttctt ctgtcccttc 1680

tgggtagttt ggttctctcg ggccatctcg ataacgatat tctcgggctt atgccttccc 1740

attactttga cgagttcatc cacgacctta acggtctgca gtattccctt tttgatagct 1800

gggctacctg caagattagc gatgtgctcg tgaagactgt ccccctggcc agaaacttgt 1860

gctttctgga tgtcctcctt aaaggtgaga gagtcatcat ggatcaactg catgaagttc 1920

cggttggcaa atccatcgga cttaagaaaa tccaggattg tctttccact ctgcttgtct 1980

cggatcccat tgatcagttt tcttgacagc cgcccccatc ctgtatatcg gcgcctcttg 2040

agctgtttca tgactttgtc gtcgaagaga tgagcgtaag ttttcaagcg ttcttcaatc 2100

atctccctat cttcaaacaa cgtaagggtg aggacaatgt cctcaagaat gtcctcgttc 2160

tcctcattgt ccaggaagtc cttgtcttta atgattttca ggagatcgtg atacgttccc 2220

agggatgcgt tgaagcgatc ctccactccg ctgatttcaa cagagtcgaa acattcaatc 2280

tttttgaaat agtcttcttt gagctgtttc acggtaactt tccggttcgt cttgaagagg 2340

aggtccacga tagctttctt ctgctctcca gacaggaatg ctggctttct catcccttct 2400

gtgacgtatt tgaccttggt gagctcgtta taaactgtga agtactcgta cagcagagag 2460

tgtttaggaa gcaccttttc gttaggcaga tttttatcaa agttagtcat cctttcgatg 2520

aaggactggg cagaggcccc cttatccacg acttcctcga agttccaggg agtgatggtc 2580

tcttctgatt tgcgagtcat ccacgcgaat ctggaatttc cccgggcgag ggggcctaca 2640

tagtagggta tccgaaatgt gaggattttc tcaatctttt ccctgttatc tttcaaaaag 2700

gggtagaaat cctcttgccg cctgaggata gcgtgcagtt cgcccaggtg aatctggtgg 2760

gggatgcttc cattgtcgaa agtgcgctgt ttgcgcaaca gatcttctct gttaagcttt 2820

accagcagct cctcggtgcc gtccattttt tccaagatgg gcttaataaa tttgtaaaat 2880

tcctcctggc ttgctccgcc gtcaatgtat ccggcgtagc catttttaga ctgatcgaag 2940

aaaatttcct tgtacttctc aggcagttgc tgtctgacaa gggccttcag caaagtcaag 3000

tcttggtggt gctcatcata gcgcttgatc atactagcgc tcagcggagc tttggtgatc 3060

tccgtgttca ctcgcagaat atcactcagc agaatggcgt ctgacaggtt ctttgccgcc 3120

aaaaaaaggt ctgcgtactg gtcgccgatc tgggccagca gattgtcgag atcatcatcg 3180

taggtgtctt tgctcagttg aagcttggca tcttcggcca ggtcgaagtt agatttaaag 3240

ttgggggtca gcccgagtga cagggcgata agattaccaa acaggccgtt cttcttctcc 3300

ccagggagct gtgcgatgag gttttcgagc cgccgggatt tggacagcct agcgctcagg 3360

attgctttgg cgtcaactcc ggatgcgttg atcgggttct cttcgaaaag ctgattgtaa 3420

gtctgaacca gttggataaa gagtttgtcg acatcgctgt tgtctgggtt caggtccccc 3480

tcgatgagga agtgtccccg aaatttgatc atatgcgcca gcgcgagata gatcaaccgc 3540

aagtcagcct tatcagtact gtctacaagc ttcttcctca gatgatatat ggttgggtac 3600

ttttcatggt acgccacctc gtccacgata ttgccaaaga ttgggtggcg ctcgtgcttt 3660

ttatcctcct ccaccaaaaa ggactcctcc agcctatgga agaaagagtc atccacctta 3720

gccatctcat tactaaagat ctcctgcagg tagcagatcc gattctttct gcgggtatat 3780

ctgcgccgtg ctgttctttt gagccgcgtg gcttcggccg tctccccgga gtcgaacagg 3840

agggcgccaa tgaggttctt ctttatgctg tggcgatcgg tattgcccag aactttgaat 3900

tttttgctcg gcaccttgta ctcgtccgta atgacggccc agccgacgct gtttgtgccg 3960

atatcgagcc caatggagta cttcttgtcc atggtggcaa gggttcgatc ctctagagtc 4020

cggaggctgg atcggtcccg gtgtcttcta tggaggtcaa aacagcgtgg atggcgtctc 4080

caggcgatct gacggttcac taaacgagct ctgcttatat agacctccca ccgtacacgc 4140

ctaccgccca tttgcgtcaa tggggcggag ttgttacgac attttggaaa gtcccgttga 4200

ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg tcaatggggt ggagacttgg aaatccccgt 4260

gagtcaaacc gctatccacg cccattgatg tactgccaaa accgcatcac catggtaata 4320

gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa gtaggaaagt cccataaggt catgtactgg 4380

gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca ttgacgtcaa tagggggcgt acttggcata 4440

tgatacactt gatgtactgc caagtgggca gtttaccgta aatactccac ccattgacgt 4500

caatggaaag tccctattgg cgttactatg ggaacatacg tcattattga cgtcaatggg 4560

cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg ccatttaccg taagttatgt aacgcggaac 4620

tccatatatg ggctatgaac taatgacccc gtaattgatt actattaata actagtcaat 4680

aatcaatgtc aacgcgtata tctggcccgt acatcgcgaa gcagcgcaaa acgcctaacc 4740

ctaagcagat tcttcatgca attgtcggtc aagccttgcc ttgttgtagc ttaaattttg 4800

ctcgcgcact actcagcgac ctccaacaca caagcaggga gcagatactg gcttaactat 4860

gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccataggg gatcgggaga tctcccgatc 4920

cgtcgacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 4980

tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 5040

aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 5100

ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 5160

ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 5220

tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 5280

tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 5340

actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 5400

gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 5460

acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 5520

gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 5580

acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 5640

gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 5700

ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 5760

gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 5820

cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 5880

agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 5940

catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 6000

tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 6060

cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 6120

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 6180

taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 6240

ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 6300

tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 6360

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 6420

cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 6480

agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 6540

gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 6600

atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 6660

gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 6720

gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 6780

ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 6840

cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 6900

cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 6960

acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 7020

cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 7080

accatgatta cgccaagctc tagctagagg tcgacggtat acagacatga taagatacat 7140

tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 7200

ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttggggtggg 7260

cgaagaactc cagcatgaga tccccgcgct ggaggatcat ccagccggcg tcccggaaaa 7320

cgattccgaa gcccaacctt tcatagaagg cggcggtgga atcgaaatct cgtgatggca 7380

ggttgggcgt cgcttggtcg gtcatttcgc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg 7440

tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 7500

aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct 7560

atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg 7620

ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg 7680

ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc 7740

tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg 7800

atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc 7860

cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga 7920

tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg 7980

agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc 8040

tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc 8100

gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag 8160

ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc 8220

atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagatccga aaatggatat acaagctccc 8280

gggagctttt tgcaaaagcc taggcctcca aaaaagcctc ctcactactt ctggaatagc 8340

tcagaggcag aggcggcctc ggcctctgca taaataaaaa aaattagtca gccatggggc 8400

ggagaatggg cggaactggg cggagttagg ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact 8460

atggttgctg actaattgag atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg 8520

gactttccac acctggttgc tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct 8580

ggggagcctg gggactttcc acaccctaac tgacacacat tccacagaat taattcgcgt 8640

taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt 8700

ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 8760

cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 8820

gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac 8880

taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg 8940

tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag 9000

cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt 9060

ggggataccc cctagagccc cagctgcgca gatctgctat ggcagggcct gccgccccga 9120

cgttggctgc gagccctggg ccttcacccg aacttggggg gtggggtggg gaaaaggaag 9180

aaacgcgggc gtattggccc caatggggtc tcggtggggt atcgacagag tgccagccct 9240

gggaccgaac cccgcgttta tgaacaaacg acccaacacc cgtgcgtttt attctgtctt 9300

tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc ggtattgtct ccttccgtgt ttcagttagc 9360

ctcccccgtt taaactcatt actaaccggt agggatcgaa ccctttcaca ccttcctctt 9420

cttcttgggg tcagccctgc tgtctccacc gagctgagag aggtcgattc ttgtttcata 9480

gagccccgta attgactgat gaatcagtgt ggcgtccagg acctcctttg tagaggtgta 9540

ccgctttctg tct 9553

<210> 1

<211> 368

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac 60

aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120

aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt 180

aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat 240

atcttgtgga aaggacgaaa caccgggagg cgcgggttgc ccttcgtttt agagctagaa 300

atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg 360

cttttttt 368

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

gaagggcaac ccgcgcctcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

ataaatatcc cggtgccagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 5

tgggtggcta gtcttttcgg 20

<210> 6

<211> 795

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 6

atgagcctgt ccttgctctt cctcatcttc tgcagccacc tgatccacag cgcttgggct 60

cacggggaga agcgtctcac tcccgaaggg caacccgcgc ctcctaggaa cccgggagac 120

tccagcggca gccggggcag aagtagcgcg acgttttctt cgtcttctgc ctcctcacca 180

gtcgcagctt ctccgggcag ccaaggaagc ggctcggaac atagcagttt ccagtggagc 240

ccttcggggc gccggaccgg cagcctgtac tgcagagtgg gcatcggttt ccatctgcag 300

atctacccgg atggcaaagt caatggctcc cacgaagcca gtgtgttaag tattttggaa 360

atatttgctg tgtctcaggg gattgtagga atacgaggag ttttcagcaa caaattttta 420

gcgatgtcaa aaaaaggaaa actccatgca agtgccaaat ttacggatga ctgtaagttc 480

agggagagat tccaagaaaa cagctataat acctatgcgt ccgcgatcca cagaactgaa 540

aagacaggcc gagagtggta cgtggccctg aacaagagag ggaaagccaa gagaggctgc 600

agcccacggg tcaaacccca acacgtctcc acccacttcc tacccaggtt caagcagtcc 660

gagcaaccgg aactttcctt caccgtcact gttccagaaa agaaaaagcc accggtgaaa 720

ccaaaggtgc ccctgtcgca gcctcgcaga agtcccagcc cagtgaagta cagactgaag 780

tttcgctttg gatga 795

<210> 7

<211> 2797

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 7

acgtggaggt aaatgattcc gccaagcttg catgcctgca ggtcgacgat tataaatatc 60

ccggtgccag cgccgagatc cgctcgggtg gcctctctct ctccccctct ccctctccct 120

tccccgaggc tatgtccacc ctgtgcggcg agggaggcag cgccagaggc acgcagccgc 180

gcgggggcta cggagcccgg agccagccct gcaagatgca cttaggaccc ccgcggccgg 240

aagaatgagc ctgtccttgc tcttcctcat cttctgcagc cacctgatcc acagcgcttg 300

ggctcacggg gagaagcgtc tcactcccga aagcaacccg cgcctcctag gaacccggga 360

gactccagcg gcagccgggg cagaagtagc gcgacgtttt cttcgtcttc tgcctcctca 420

ccagtcgcag cttctccggg cagccaagga agcggctcgg aacatagcag tttccagtgg 480

agcccttcgg ggcgccggac cggcagcctg tactgcagag tgggcatcgg tttccatctg 540

cagatctacc cggatggcaa agtcaatggc tcccacgaag ccagtgtgtt aagtaagttg 600

ctcactctcc aacaaaacct gttctgggag ggacggtcaa gattcctttg ggccacaggc 660

acctctagga gccctagcgt ctgggactct gctggttctg gaaagagtcc ggtagggttt 720

cgtggagatg cgtctactca gagcgagcag acgcaccctt ctgtcttggg tagtaagcat 780

gggtaagccc aggtgaggtt accgaggtga gacaggcagc tcttttccag aatgcccggg 840

ccgaaaagac tagccaccca aatctctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcact 900

ggctggtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 960

ttgcagcaca tcccctcttt cgccagctgg cgtaatagcg agaggcccgc accgatcgcc 1020

cttcccacag ttgcgcagct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt ttctctacgc 1080

atcgtggcgg tattcacaac cgcaatttgt gcactcctca gtacaatctt gcctctgatg 1140

ccgcatagta ggcagtccga actcggcaac tcgctgaccg gccttgacgc tgctgctccg 1200

gactcgctac agaacatgct gtgaaccgat ctccggaacg tggaggtaaa tgattccgcc 1260

aagcttgcat gcctgcaggt cgacgattat aaatatcccg gtgccagcgc cgagatccgc 1320

tcgggtggcc tctctctctc cccctctccc tctcccttcc ccgaggctat gtccaccctg 1380

tgcggcgagg gaggcagcgc cagaggcacg cagccgcgcg ggggctacgg agcccggagc 1440

cagccctgca agatgcactt aggacccccg cggccggaag aatgagcctg tccttgctct 1500

tcctcatctt ctgcagccac ctgatccaca gcgcttgggc tcacggggag aagcgtctca 1560

acgtggaggt aaatgattcc gccaagcttg catgcctgca ggtcgacgat tataaatatc 1620

ccggtgccag cgccgagatc cgctcgggtg gcctctctct ctccccctct ccctctccct 1680

tccccgaggc tatgtccacc ctgtgcggcg agggaggcag cgccagaggc acgcagccgc 1740

gcgggggcta cggagcccgg agccagccct gcaagatgca cttaggaccc ccgcggccgg 1800

aagaatgagc ctgtccttgc tcttcctcat cttctgcagc cacctgatcc acagcgcttg 1860

ggctcacggg gagaagcgtc tcactcccga aagcaacccg cgcctcctag gaacccggga 1920

gactccagcg gcagccgggg cagaagtagc gcgacgtttt cttcgtcttc tgcctcctca 1980

ccagtcgcag cttctccggg cagccaagga agcggctcgg aacatagcag tttccagtgg 2040

agcccttcgg ggcgccggac cggcagcctg tactgcagag tgggcatcgg tttccatctg 2100

cagatctacc cggatggcaa agtcaatggc tcccacgaag ccagtgtgtt aagtaagttg 2160

ctcactctcc aacaaaacct gttctgggag ggacggtcaa gattcctttg ggccacaggc 2220

acctctagga gccctagcgt ctgggactct gctggttctg gaaagagtcc ggtagggttt 2280

cgtggagatg cgtctactca gagcgagcag acgcaccctt ctgtcttggg tagtaagcat 2340

gggtaagccc aggtgaggtt accgaggtga gacaggcagc tcttttccag aatgcccggg 2400

ccgaaaagac tagccaccca aatctctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcact 2460

ggctggtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 2520

ttgcagcaca tcccctcttt cgccagctgg cgtaatagcg agaggcccgc accgatcgcc 2580

cttcccacag ttgcgcagct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt ttctctacgc 2640

atcgtggcgg tattcacaac cgcaatttgt gcactcctca gtacaatctt gcctctgatg 2700

ccgcatagta ggcagtccga actcggcaac tcgctgaccg gccttgacgc tgctgctccg 2760

gactcgctac agaacatgct gtgaaccgat ctccgga 2797

<210> 8

<211> 1172

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 8

gttgcttcga cgcagtgatt cgagctcggt acccggggat cctctagaga ttataaatat 60

cccggtgcca gcgccgagat ccgctcgggt ggcctctctc tctccccctc tccctctccc 120

ttccccgagg ctatgtccac cctgtgcggc gagggaggca gcgccagagg cacgcagccg 180

cgcgggggct acggagcccg gagccagccc tgcaagatgc acttaggacc cccgcggccg 240

gaagaatgag cctgtccttg ctcttcctca tcttctgcag ccacctgatc cacagcgctt 300

gggctcacgg ggagaagcgt ctcactcccg aacccgcgcc tcctaggaac ccgggagact 360

ccagcggcag ccggggcaga agtagcgcga cgttttcttc gtcttctgcc tcctcaccag 420

tcgcagcttc tccgggcagc caaggaagcg gctcggaaca tagcagtttc cagtggagcc 480

cttcggggcg ccggaccggc agcctgtact gcagagtggg catcggtttc catctgcaga 540

tctacccgga tggcaaagtc aatggctccc acgaagccag tgtgttaagt aagttgctca 600

ctctccaaca aaacctgttc tgggagggac ggtcaagatt cctttgggcc acaggcacct 660

ctaggagccc tagcgtctgg gactctgctg gttctggaaa gagtccggta gggtttcgtg 720

gagatgcgtc tactcagagc aagcagacgc acccttctgt cttgggtagt aagcatgggt 780

aaacccaggt gaggttaccg aggtgagaca ggcagctctt ttccagaatg ctcgggcccg 840

aaaagactag ccacccaaat cgtcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc 900

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt tccacacaac atacgagccg 960

aagcataaag tgtaagcctg gggtgcctaa tgagtgaggc tactcacata atggcgatgc 1020

gcctcactgc ccgcttcagt ccggaaactg tcatccagct gcatatgatc gccaccgccg 1080

ggaaagccga tgcaatggag acttccgtat ctcgctcatg gatcggtagc taggtcgaac 1140

gctatgcgga agtgtatagc gttcgaatct ag 1172

<210> 9

<211> 1233

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 9

ccggacatga catgattacg ccagcttgca tgcctgcagg tcgacgatta taaatatccc 60

ggtgccagcg ccgagatccg ctcgggtggc ctctctctct ctccccctct ccctctccct 120

tccccgaggc tatgtccacc ctgtgcggcg agggaggcag cgccagaggc acgcagccgc 180

gcgggggcta cggagcccgg agccagccct gcaagatgca cttaggaccc ccgcggccgg 240

aagaatgagc ctgtccttgc tcttcctcat cttctgcagc cacctgatcc acagcgcttg 300

ggctcacggg gagaagcgtc tcactcccgc aacccgcgcc tcctaggaac ccgggagact 360

ccagcggcag ccggggcaga agtagcgcga cgttttcttc gtcttctgcc tcctcaccag 420

tcgcagcttc tccgggcagc caaggaagcg gctcggaaca tagcagtttc cagtggagcc 480

cttcggggcg ccggaccggc agcctgtact gcagagtggg catcggtttc catctgcaga 540

tctacccgga tggcaaagtc aatggctccc acgaagccag tgtgttaagt aagttgctca 600

ctctccaaca aaacctgttc tgggagggac ggtcaagatt cctttgggcc acaggcacct 660

ctaggagccc tagcgtctgg gactctgctg gttctggaaa gagtccggta gggtttcgtg 720

gagatgcgtc tactcagagc gagcagacgc acccttctgt cttgggtagt aagcatgggt 780

aagcccaggt gaggttaccg aggtgagaca ggcagctctt ttccagaatg cccgggccga 840

aaagactagc cacccaaatc tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcactgggc 900

cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 960

agcacatccc ccttttcgcc agctggcgta atagcgagag gcccgcaccg atcgcccttt 1020

ccaacagttg cgcagctgaa tggcgatggc gctgatgcgg tatttttctc ttacgcatct 1080

gtgcgtattt cacaccgcaa tgtgcactct cagtacaatc tgctctgatg cggcatagta 1140

ggcaggcccg actcggccac accgctgacg cgacctgacg ctgtctgctc cggcatcgct 1200

acagacagca tgtgtaacga tatctctcgg aga 1233

<210> 10

<211> 1247

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

gcggcaatga catgattacg ccagcttgca tgcctgcagg tcgacgatta taaatatccc 60

ggtgccagcg ccgagatccg ctcgggtggc ctctctctct ctccccctct ccctctccct 120

tccccgaggc tatgtccacc ctgtgcggcg agggaggcag cgccagaggc acgcagccgc 180

gcgggggcta cggagcccgg agccagccct gcaagatgca cttaggaccc ccgcggccgg 240

aagaatgagc ctgtccttgc tcttcctcat cttctgcagc cacctgatcc acagcgcttg 300

ggctcacggg gagaagcgtc tcactcccgc ttcctaggag ggcaacccgc gcctcctagg 360

aacccgggag actccagcgg cagccggggc agaagtagcg cgacgttttc ttcgtcttct 420

gcctcctcac cagtcgcagc ttctccgggc agccaaggaa gcggctcgga acatagcagt 480

ttccagtgga gcccttcggg gcgccggacc ggcagcctgt actgcagagt gggcatcggt 540

ttccatctgc agatctaccc ggatggcaaa gtcaatggct cccacgaagc cagtgtgtta 600

agtaagttgc tcactctcca acaaaacctg ttctgggagg gacggtcaag attcctttgg 660

gccacaggca cctctaggag ccctagcgtc tgggactctg ctggttctgg aaagagtccg 720

gtagggtttc gtggagatgc gtctactcag agcgagcaga cgcacccttc tgtcttgggt 780

agtaagcatg ggtaagccca ggtgaggtta ccgaggtgag acaggcagct cttttccaga 840

atgcccgggc cgaaaagact agccacccaa atctctagag gatccccggg taccgagctc 900

gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 960

taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 1020

cgatcgccct ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgctga tgcggtattt 1080

ttctcttacg catctgtgcg tattcacacc gcatatggtg cacctctcag tacatctgct 1140

ctgatgcgca tagtaagcca ggcccgaacc ccgcaaacac ccgcttgacg gactgacgac 1200

tgtctggctc cgggcatcgc tcttaacaga aaccagccgt tgtgaag 1247

Claims (7)

1.一种基于CRISPR/Cas9获得FGF5突变小鼠模型的构建方法，其特征包括以下步骤：第1步：构建基于CRISPR-Cas9系统的sgRNA表达载体。

第2步：将sgRNA和Cas9 质粒混合物对受精卵原核注射，胚胎移植，品系基因鉴定，得到基因突变小鼠，并pcr测序，确认最终得到的FGF5基因突变的遗传性小鼠突变模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，向导RNA表达载体为sgRNA-FGF5，sgRNA靶位点位于第一外显子上。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，sgRNA靶序列为 5 ’-GAAGGGCAACCCGCGCCTCC-3’。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述小鼠包括CD-1品系小鼠。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述sgRNA-FGF5表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2示。

6.根据权利要求1-5任一项所述方法获得FGF5基因敲除小鼠。

7.根据权利要求1-6任一项所述方法在生产FGF5基因敲除的克隆小鼠中的应用。